先天性巨结肠病因研究进展
上海第二医科大学附属上海儿童医学中心新华医院儿外科，200000 褚君(综述)；施诚仁(审校)
关键词：肛肠病
摘要：
先天性巨结肠
先天性巨结肠(Hirschsprung's disease，简称HD)是一种肠神经系统(Enteric nervous system，简称ENS)发育异常的疾病，又称无神经节细胞症。其发病率大约是1/5000，Okamoto等研究发现：肌间神经丛系由神经母细胞形成。这些神经母细胞于胚胎第5周开始沿迷走神经干由头侧向尾侧迁移，于第12周到达消化道远端，而黏膜下层的神经节细胞由肌间神经母细胞移行过去的。故HD的发生是由于各种原因导致神经母细胞迁移过程发生停顿所致。国际最新研究表明，HD是一种多基因控制的疾病，一些基因的缺失或突变是导致肠管发育障碍的根本原因。本文对近几年HD病因的研究作一综述。
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1、神经嵴和神经嵴病
肠神经系统的神经节细胞是起源于神经嵴，在脊椎动物胚芽期中，这是最早发生的器官之一，可衍化为许多组织[1]。在所知的人类先天性异常中，与神经嵴有关的占1/3。
来源于神经嵴的细胞，其形态学的表现是相似的，它们是从头向尾端迁移到组织中。当迁移结束时分化成不同的细胞类型，包括神经原，交感神经，付交感神经节，神经内分泌细胞，肾上腺髓质，黑色素细胞和面部的软骨。神经嵴病临床表现也不一样，可有内皮性，皮肤性，神经性，消化或其综述征。
Bolande等[1]在1974年命名了神经嵴病，并分为2种形式。一种是单病灶或局限性的简单神经嵴病；另一种是神经嵴综合征或复杂性神经嵴病含有多病灶或单病灶多样变。HD被证实是一种简单的神经嵴病。
迷增神经嵴是消化道肠神经系统的神经原和支持细胞的来源。1993年Peters-van,Sanden等[3]研究发现迷走神经嵴存在于肠神经系统的各段，他们认为整个为走神经嵴的切除会导致从肛门至中肠的无神经细胞症，而前肠可有正常的神经节细胞(食管，胃，十二指肠)。迷走神经嵴邻近的3～5个体节的切除可导致后肠的无神经节细胞症。如果不切除这个节段，就不会影响肠神经系统的形成。
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2、HD的主要基因：RET原癌基因
1988年Takahashi等[4]在进行DNA重组实验时发现了RET基因。随后人们发现RET基因对内分泌肿瘤(如甲状腺髓样癌、多发性内分泌瘤等)的发生起重要的作用。原癌基因RET的致癌性已无可非议。1992年Martucciello等首次在一名全结肠无神经节细胞症的患者上发现其10号染色体长臂缺陷[5]。其突变的位置在10q11.2和q12.2上的RET原癌基因[6]。此基因长约80Kb，含20个外显子，编码一种酪氨酸激酶受体。进一步研究显示RET原癌基因突变绝大多数是突变，且均为杂合型。Schnchardt等[7]利用基因工程将RET基因剔除后可产生整个消化管的无神经节细胞症，从而证明RET基因对肠神经系统发育起决定性作用，与HD的发生有不可分割的关系。
欧美国家地HD患者的RET基因全部20个我显子突变的研究发现，家族性HD患者约40%～50%可存在RET基因的突变，散发性HD仅为15%～20%[8]。研究表明：家族性HD的RET基因突变位点均是RET蛋白产物的细胞外区段的编码区，而散发性HD的RET基因的突变位点的是RET蛋白产物的细胞内区段的编码区；散发HD有RET基因突的是长段型，而家族性HD有RET基因突变的可以是长段型、短段型或是正常携带者。
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3、巨结肠和多发性内分泌瘤(MEN2)
酪氨酸酶受体在细胞的正常分化和生长中起重要的作用，生长因子和受体连接会形成受体二聚物，随后激活它们内在酪氨酸酶。然而这些基因点突变和重排可以导致与肿瘤发生相关受体的活化，RET原癌基因编码了酪氨酸酶受体，并首次被证实作为一个嵌合的肿瘤基因在N1H3T3转化中发生重排[9]。在RET原癌基因发现的近十年中RET基因被证实在遗传性肿瘤、MEN2和HD中发生。MEN2A突变会导致在RET细胞外不存在6半胱氨酸的替代物。然而，在一些无症状的MEN2A或散发的合伴甲状腺髓样癌的HDA中半胱氨酸残基609和620存在错义突变[10，11]。
即使从未对MEN2B的胃肠表现进行研究，但是目前的临床研究发现在MEN2B中有大量的肠道变异。据Anderson，Lucaya，Grun Eberle和Verdy等报道，在MEN2B患者的钡灌肠影像学表现如下：①在含有钡剂的结肠上有正常的皱襞；②通便后黏膜增厚；③结肠扩张；④巨结肠远端狭窄。
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根据以上影像学的发现，最近有学者认为在不同的MEN2B中存在短段型的无神经细胞症和近端肠管神经节神经瘤的形成。免疫组织化学研究表明MEN2B的外显子16突变是肠道分型的基础。Roneo等[12]描述了一名3岁女患儿中HD和MEN2B之间存在联系，分析这个患儿整个RET基因，一个典型的外显子16Met918Thr的突被发现。在同一患儿中间时存在MEN2和HD解释了突变可激活RET酪氨酸酶使其发生异常的有丝分裂信号转导，从而激活了胚胎肠神经节细胞的凋亡进程。基因的变更和环境因素可以说明RET基因突变的存在及RET等位基因变异的影响作用。
另一个对临床有重要意义的是在HD中这些新的基因有发生MEN2或至少发生甲状腺髓样癌的危险。这个危险因素被认为①在巨结肠中RET基因的突变率占20%；②在外显子10上的酪氨酸残基的突变有发展成MEN2A或家族性甲状腺髓样癌的倾向，且至少占了所有HD突变的5%[13，14]。
4、巨结肠病中GDNF缺乏
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首先证实RET受体配体是一种神经胶质细胞所诱导的神经营养因子(GDNF)。这种蛋白质是由134个氨基酸组成，这是一种32-42KD的二聚体分子物[15]。GDNF是RET基因跨膜受体的配体之一，其糖基磷酯酰肌醇连接蛋白GDNF-α与配体粘合，为RET提供了信号指示。基础研究表明GDNF或者GDNF-α的其中之一缺乏，均可使传递给RET的信号减少或中断。GDNF基因包含子二个已知的外显子：外显子1(151bp)和外显子2(485bp)其可作为一个潜在性突变的指示。
在Gaslini儿童医院，98例肠神经节细胞发育异常的患者中进行GDNF突变的分析。其中43例是不同类型的无神经节细胞症，筛查证实在外显子2中存在二个杂合子错义突变：一个是R143R，在全结肠型的HD核苷酸492上存三个G-A的易位；另一个易1211M，在普通型的HD核苷酸630上有C-G的易位。研究证实GDNF突变率0.9%～5.5%[16，17]。
, http://www.100md.com GDNF的免疫反应能力是表现于肠神经丛及黏膜下神经丛的神经节中。在HD的肠神经节中未发现GDNF阳性的神经纤维。与近端正常神经节比较时发现在神经节细胞发育低下部分的小神经节中，其GDNF免疫反应力是减弱的。在HD无神经节细胞的远端，不同的酶及免疫组织化学标志物(SDH，LDH，ANE，NSE)提示了神经节细胞的缺乏。肌间质中存在神经纤维干和一些配体起源的具有免疫反应力的GFAD和S-100蛋白的小细胞物。在HD的无神经节肠段中不存在GDNF免疫反应力。
在无神经节的肠段的远端GDNF的表达缺乏是HD发病机制中的一个重要因素。在后肠末端GDNF的缺乏，可能决定了在RET原癌基历上不发生RET受体失活和磷酸化的突变，从而引起肠神经母细胞迁移的停顿和巨结肠症。
5、巨结肠与EDNRB
内皮细胞产生的信号传递过程也是神经嵴细胞移行所必需的。被EDN1、EDN2、EDN3基因编码的内皮细胞ET-1、ET-2、ET-3是一个具有21残基的小肽，它是从一较大的前蛋白经2步蛋白水解后诱变形成。这些肽经过由EDNRA、EDNRB基因编码的2个受体ET-A、ET-B调解它们作用。ET-B受体是一个442个残基的蛋白质，其基因具有7个外显子，位于染色体13q22上，最初在脑、肾、肺、心的内皮细胞内存在表现[18]。最近，发现EDNRB也在人类的结肠内，特别是在肌间神经丛、黏膜下层及黏膜下的血管组织内。
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有文献报道在EDNRB所发现的12种突变中，既有散发性的也有家族性的，且至少有7种突变与散在性HD有关。Hosoda[19]通过体外杂交试验证实EDNRB基因缺失可以产生巨结肠。这种基因缺如不同于RET基因缺失时有全部消化管无神经节细胞症及肾脏损害。EDNRB剔除试验制成的鼠，其他部位的大体结构正常，结肠内也是局部短段结肠内无神经节细胞症，而不是全部结肠，所以说EDNRB缺失与短段型HD的关系非常密切。
Bloch[20]首先通过杂交试验分离出EDN3，其是EDNRB的配体，基因定位于人类第20号染色体上，具有两个外显子。Sakurai等[21]研究发现：EDN1、EDN2、EDN3对于EDNRB作用是均等的，但是近年来实验证实EDN3对于神经嵴细胞的移行、增殖及分化的作用是十分重要的。最近发现在EDN3基因上的纯合子突变被证实还可产生伴有综合征的HD(Shah-Waardenburg综合征)，即色素病，耳聋和HD。
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6、其他的易感基因和候选基因
Neurturin基因的RET的另一个配体，位于19p13.3。Doray等[22]在一个在家族的4个HD患儿中发现一例杂合neurturin基因误认突变。家族成员中还同时存在RET基因突变，表明单纯的neurturin突变淍不足以引起HD，但可影响它的发展。
SOX10基因也被证实是易感基因，特别是SOX10的1-bp插入在胚胎发生过程中一个与睾丸sry基因有关的转入因子，会导致HD[23]。其基因位于22q12-q13，在胚胎期表达于神经嵴细胞，参与外周神经系统的形成。此外，在动物模型中也发现一些与HD有关的候选基因，但未在人类发现。
综上所述，HD是一个由2个主要的信息传递过程中任何一个的机能障碍所引起的(RET-GDNF和GDN3-EDNRB受体)多基因疾病。在家族中基因定位和候补基因的突变谱以及Knocbout动物模型的研究明显显示出在HD病中的致病原因是包含了多基因仅用单一的基因突变或缺失不能圆满解释HD的发病机制。另外，散发HD病例易感基因的低突变率提示环境因素的影响对于神经嵴细胞的分化、移行及发育起到积极关键的作用。所以HD的发生可能是由于遗传和环境两方面的因素造成的。, http://www.100md.com
关键词：肛肠病
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先天性巨结肠
先天性巨结肠(Hirschsprung's disease，简称HD)是一种肠神经系统(Enteric nervous system，简称ENS)发育异常的疾病，又称无神经节细胞症。其发病率大约是1/5000，Okamoto等研究发现：肌间神经丛系由神经母细胞形成。这些神经母细胞于胚胎第5周开始沿迷走神经干由头侧向尾侧迁移，于第12周到达消化道远端，而黏膜下层的神经节细胞由肌间神经母细胞移行过去的。故HD的发生是由于各种原因导致神经母细胞迁移过程发生停顿所致。国际最新研究表明，HD是一种多基因控制的疾病，一些基因的缺失或突变是导致肠管发育障碍的根本原因。本文对近几年HD病因的研究作一综述。
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1、神经嵴和神经嵴病
肠神经系统的神经节细胞是起源于神经嵴，在脊椎动物胚芽期中，这是最早发生的器官之一，可衍化为许多组织[1]。在所知的人类先天性异常中，与神经嵴有关的占1/3。
来源于神经嵴的细胞，其形态学的表现是相似的，它们是从头向尾端迁移到组织中。当迁移结束时分化成不同的细胞类型，包括神经原，交感神经，付交感神经节，神经内分泌细胞，肾上腺髓质，黑色素细胞和面部的软骨。神经嵴病临床表现也不一样，可有内皮性，皮肤性，神经性，消化或其综述征。
Bolande等[1]在1974年命名了神经嵴病，并分为2种形式。一种是单病灶或局限性的简单神经嵴病；另一种是神经嵴综合征或复杂性神经嵴病含有多病灶或单病灶多样变。HD被证实是一种简单的神经嵴病。
迷增神经嵴是消化道肠神经系统的神经原和支持细胞的来源。1993年Peters-van,Sanden等[3]研究发现迷走神经嵴存在于肠神经系统的各段，他们认为整个为走神经嵴的切除会导致从肛门至中肠的无神经细胞症，而前肠可有正常的神经节细胞(食管，胃，十二指肠)。迷走神经嵴邻近的3～5个体节的切除可导致后肠的无神经节细胞症。如果不切除这个节段，就不会影响肠神经系统的形成。
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2、HD的主要基因：RET原癌基因
1988年Takahashi等[4]在进行DNA重组实验时发现了RET基因。随后人们发现RET基因对内分泌肿瘤(如甲状腺髓样癌、多发性内分泌瘤等)的发生起重要的作用。原癌基因RET的致癌性已无可非议。1992年Martucciello等首次在一名全结肠无神经节细胞症的患者上发现其10号染色体长臂缺陷[5]。其突变的位置在10q11.2和q12.2上的RET原癌基因[6]。此基因长约80Kb，含20个外显子，编码一种酪氨酸激酶受体。进一步研究显示RET原癌基因突变绝大多数是突变，且均为杂合型。Schnchardt等[7]利用基因工程将RET基因剔除后可产生整个消化管的无神经节细胞症，从而证明RET基因对肠神经系统发育起决定性作用，与HD的发生有不可分割的关系。
欧美国家地HD患者的RET基因全部20个我显子突变的研究发现，家族性HD患者约40%～50%可存在RET基因的突变，散发性HD仅为15%～20%[8]。研究表明：家族性HD的RET基因突变位点均是RET蛋白产物的细胞外区段的编码区，而散发性HD的RET基因的突变位点的是RET蛋白产物的细胞内区段的编码区；散发HD有RET基因突的是长段型，而家族性HD有RET基因突变的可以是长段型、短段型或是正常携带者。
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酪氨酸酶受体在细胞的正常分化和生长中起重要的作用，生长因子和受体连接会形成受体二聚物，随后激活它们内在酪氨酸酶。然而这些基因点突变和重排可以导致与肿瘤发生相关受体的活化，RET原癌基因编码了酪氨酸酶受体，并首次被证实作为一个嵌合的肿瘤基因在N1H3T3转化中发生重排[9]。在RET原癌基因发现的近十年中RET基因被证实在遗传性肿瘤、MEN2和HD中发生。MEN2A突变会导致在RET细胞外不存在6半胱氨酸的替代物。然而，在一些无症状的MEN2A或散发的合伴甲状腺髓样癌的HDA中半胱氨酸残基609和620存在错义突变[10，11]。
即使从未对MEN2B的胃肠表现进行研究，但是目前的临床研究发现在MEN2B中有大量的肠道变异。据Anderson，Lucaya，Grun Eberle和Verdy等报道，在MEN2B患者的钡灌肠影像学表现如下：①在含有钡剂的结肠上有正常的皱襞；②通便后黏膜增厚；③结肠扩张；④巨结肠远端狭窄。
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根据以上影像学的发现，最近有学者认为在不同的MEN2B中存在短段型的无神经细胞症和近端肠管神经节神经瘤的形成。免疫组织化学研究表明MEN2B的外显子16突变是肠道分型的基础。Roneo等[12]描述了一名3岁女患儿中HD和MEN2B之间存在联系，分析这个患儿整个RET基因，一个典型的外显子16Met918Thr的突被发现。在同一患儿中间时存在MEN2和HD解释了突变可激活RET酪氨酸酶使其发生异常的有丝分裂信号转导，从而激活了胚胎肠神经节细胞的凋亡进程。基因的变更和环境因素可以说明RET基因突变的存在及RET等位基因变异的影响作用。
另一个对临床有重要意义的是在HD中这些新的基因有发生MEN2或至少发生甲状腺髓样癌的危险。这个危险因素被认为①在巨结肠中RET基因的突变率占20%；②在外显子10上的酪氨酸残基的突变有发展成MEN2A或家族性甲状腺髓样癌的倾向，且至少占了所有HD突变的5%[13，14]。
4、巨结肠病中GDNF缺乏
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首先证实RET受体配体是一种神经胶质细胞所诱导的神经营养因子(GDNF)。这种蛋白质是由134个氨基酸组成，这是一种32-42KD的二聚体分子物[15]。GDNF是RET基因跨膜受体的配体之一，其糖基磷酯酰肌醇连接蛋白GDNF-α与配体粘合，为RET提供了信号指示。基础研究表明GDNF或者GDNF-α的其中之一缺乏，均可使传递给RET的信号减少或中断。GDNF基因包含子二个已知的外显子：外显子1(151bp)和外显子2(485bp)其可作为一个潜在性突变的指示。
在Gaslini儿童医院，98例肠神经节细胞发育异常的患者中进行GDNF突变的分析。其中43例是不同类型的无神经节细胞症，筛查证实在外显子2中存在二个杂合子错义突变：一个是R143R，在全结肠型的HD核苷酸492上存三个G-A的易位；另一个易1211M，在普通型的HD核苷酸630上有C-G的易位。研究证实GDNF突变率0.9%～5.5%[16，17]。
, http://www.100md.com GDNF的免疫反应能力是表现于肠神经丛及黏膜下神经丛的神经节中。在HD的肠神经节中未发现GDNF阳性的神经纤维。与近端正常神经节比较时发现在神经节细胞发育低下部分的小神经节中，其GDNF免疫反应力是减弱的。在HD无神经节细胞的远端，不同的酶及免疫组织化学标志物(SDH，LDH，ANE，NSE)提示了神经节细胞的缺乏。肌间质中存在神经纤维干和一些配体起源的具有免疫反应力的GFAD和S-100蛋白的小细胞物。在HD的无神经节肠段中不存在GDNF免疫反应力。
在无神经节的肠段的远端GDNF的表达缺乏是HD发病机制中的一个重要因素。在后肠末端GDNF的缺乏，可能决定了在RET原癌基历上不发生RET受体失活和磷酸化的突变，从而引起肠神经母细胞迁移的停顿和巨结肠症。
5、巨结肠与EDNRB
内皮细胞产生的信号传递过程也是神经嵴细胞移行所必需的。被EDN1、EDN2、EDN3基因编码的内皮细胞ET-1、ET-2、ET-3是一个具有21残基的小肽，它是从一较大的前蛋白经2步蛋白水解后诱变形成。这些肽经过由EDNRA、EDNRB基因编码的2个受体ET-A、ET-B调解它们作用。ET-B受体是一个442个残基的蛋白质，其基因具有7个外显子，位于染色体13q22上，最初在脑、肾、肺、心的内皮细胞内存在表现[18]。最近，发现EDNRB也在人类的结肠内，特别是在肌间神经丛、黏膜下层及黏膜下的血管组织内。
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有文献报道在EDNRB所发现的12种突变中，既有散发性的也有家族性的，且至少有7种突变与散在性HD有关。Hosoda[19]通过体外杂交试验证实EDNRB基因缺失可以产生巨结肠。这种基因缺如不同于RET基因缺失时有全部消化管无神经节细胞症及肾脏损害。EDNRB剔除试验制成的鼠，其他部位的大体结构正常，结肠内也是局部短段结肠内无神经节细胞症，而不是全部结肠，所以说EDNRB缺失与短段型HD的关系非常密切。
Bloch[20]首先通过杂交试验分离出EDN3，其是EDNRB的配体，基因定位于人类第20号染色体上，具有两个外显子。Sakurai等[21]研究发现：EDN1、EDN2、EDN3对于EDNRB作用是均等的，但是近年来实验证实EDN3对于神经嵴细胞的移行、增殖及分化的作用是十分重要的。最近发现在EDN3基因上的纯合子突变被证实还可产生伴有综合征的HD(Shah-Waardenburg综合征)，即色素病，耳聋和HD。
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6、其他的易感基因和候选基因
Neurturin基因的RET的另一个配体，位于19p13.3。Doray等[22]在一个在家族的4个HD患儿中发现一例杂合neurturin基因误认突变。家族成员中还同时存在RET基因突变，表明单纯的neurturin突变淍不足以引起HD，但可影响它的发展。
SOX10基因也被证实是易感基因，特别是SOX10的1-bp插入在胚胎发生过程中一个与睾丸sry基因有关的转入因子，会导致HD[23]。其基因位于22q12-q13，在胚胎期表达于神经嵴细胞，参与外周神经系统的形成。此外，在动物模型中也发现一些与HD有关的候选基因，但未在人类发现。
综上所述，HD是一个由2个主要的信息传递过程中任何一个的机能障碍所引起的(RET-GDNF和GDN3-EDNRB受体)多基因疾病。在家族中基因定位和候补基因的突变谱以及Knocbout动物模型的研究明显显示出在HD病中的致病原因是包含了多基因仅用单一的基因突变或缺失不能圆满解释HD的发病机制。另外，散发HD病例易感基因的低突变率提示环境因素的影响对于神经嵴细胞的分化、移行及发育起到积极关键的作用。所以HD的发生可能是由于遗传和环境两方面的因素造成的。, http://www.100md.com