尼可地尔含血停搏液对心肌细胞Na+-K+ATPase的保护作用
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体外循环杂志 2002年第2期第4卷
100853 北京，解放军总医院 何蕾；骆荩；李佳春
关键词：尼可地尔；停搏液；缺血再灌注损伤
摘要：
目的
目的：研究尼可地尔含血停搏液对心肌细胞Na+-K+ATPase的保护作用 。
方法：采用间生态离体免心共生支持系统模型。16个心脏随机分为两组，每组8只。分别采用尼可地尔超极化含血停跳液或者高钾去极化含血停跳液灌注。超极化含血停跳液由尼可地 尔(100m mol/L)，Krebs-Henseleit液和兔血1∶2混合配制。去极化停搏液由St.Thomas液与兔血1∶2混合配制，最终K+浓度20mmol/L。心脏停跳后以含血停跳液间断灌注，常温缺血60min，再灌注60min。采用电镜酶化学方法检测缺血前后心脏Na+-K+ATPase的变化。
, 百拇医药
结果：缺血再灌注后两组中酶的活性均明显降低，高钾组(图B、D)中较尼可地尔组(图C、E)减少明显。
结论：尼可地尔对心肌细胞Na+-K+ATPase缺血再灌注损伤有保护作用。
传统高钾停博液将细胞阻断于去极化膜电位，此时许多能量消耗在离子转运泵上。这种有害的跨膜离子流会导致钙超载，加重心肌缺血再灌注损伤。钾通道开放剂(PCOs)用于心肌保 护，可以将细胞阻断于静息膜电位(超极化阻断)，跨膜离子流大为平衡且净离子流最小，有利于减少停博期间心肌细胞的能量消耗，并避免发生钙超载〔1〕。缺血再灌注损伤会导致Na+-K+ATPase活性降低。我们研究尼可地尔超极化停博液对心肌细胞Na+-K+ ATPase的保护作用。
材料与方法
采用离体兔心共生支持系统模型。成年大耳白兔32只，体重2.5～3.0kg，无论雌雄。每次实验两只动物，随机分为供兔与支持兔。
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支持兔麻醉，气管切开，气管内插管，100%氧气吸入。监测动脉血气，维持动脉血pH7.35- 7.5，PCO235～45mmHg(1mmHg=0.133kPa)，PaO2>200mmHg。耳缘静脉注射肝素钠(2000U)。右股动脉插管，连接压力传感器进行持续有创压力监测。左颈内静脉及左颈动脉插管，两插管连接灌注泵管。动脉血泵入Langendorff灌注装置〔2〕。灌注液面高度80cm。溢出的液体回流到支持动物颈内静脉〔3〕。
供体兔麻醉，肝素化同上。正中开胸快速行心脏切除。收集胸腔内血液以配制含血停博液。 开放肺动脉，主动脉插管，悬挂固定，开始血液灌注〔4〕。
16个心脏随机分为两组，分别采用尼可地尔超极化含血停跳液(n=8)或者高钾去极化含血停跳液(n=8)进行心肌保护。超极化含血停跳液由Krebs-Henseleit液(mmol/L 蒸馏水，NaCl 11 8.5，NaHCO3 25.0，KCl 3.2，MgSO4 1.2 KH2PO4 1.2，glucose 5.5，CaCl 2 2.5)加nicorandil 50 mmol/L和兔血1∶2混合配制。去极化停搏液由St.Thomas液(mmol/L蒸馏水，NaCl 110.0，CaCl2 1.6，MgCl2 16.0，KCl 16.0)与兔血1∶2混合配制，最终达到KCl浓度为20mmol/L。两种停跳液pH，PaCO2相似〔4〕。每种停跳液中均加入肝素(12.5u/ml)。
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缺血期开始，关闭Langendorff灌注管。温血(37℃)停跳液自另外管道灌注，灌注液面高度80cm。达到机械电阻断后，每20min间断灌注2min。60min后，开放Langendorff灌注管，心脏再灌注60min。实验结束时取左室心肌标本。
Na+-K+ATPase电镜酶细胞化学〔5〕采用组织灌注固定5min(固定液含100mmol/L二甲砷酸钠缓冲液pH7.2，2%多聚甲醛，0.25%～0.5%戊二醛，6～8%蔗糖)，细切后再固定10min。相同缓冲液中加入10%DMSO，浸洗过夜。将组织切成40mm非冷冻切片。在孵育液中37℃孵育30min。100mmol/L二甲砷酸钠缓冲液中洗涤5min。1%饿酸-100mmol/L二甲砷酸钠缓冲液中固定30min。酒精逐级脱水后Epon树脂包理。AO超薄切片机切片，醋酸铀单染，透射电镜观察。
结 果
正常心肌细胞酶反应产物以高电子密度的黑色颗粒分布于细胞肌膜(图A)，其次见于肌浆网和血管内皮细胞。缺血再灌注后两组中酶的活性均明显降低，高钾组(图B、D)较尼可地尔组(图C、E)减少更明显。
, 百拇医药
讨 论
高钾停搏液作为心脏外科心肌保护的金标准已经有20多年的历史了。常用高钾停跳液的浓度为15～20mmol/L。可以将膜电位由静息值约为-80mV去除化到-50mV〔6〕。此时，电压依赖快Na+通道失活导致舒张期阻断。但会有活跃的Na+“窗”电流〔7〕，导致细胞内Na+增多，随后，通过钙窗电流细胞内Ca2+增多，即使在阻断条件下也会产生过度收缩。这将导致钙超载，挛缩，再灌注损伤〔8〕。
PCOs可以导致超级化阻断，此时膜电位接近静息电位。从理论上说有许多优点。静息电位时跨膜离子阶差基本平衡，几乎不会激活离子泵和离子通道〔7〕，从而避免了钙超载，并最大限度保存了高能磷酸能量贮备。由于静息伏态下Na+和Ca2+通道关闭，Na+和Ca2+内流及超载会最大限度减小。理论上说这提供了一种更接近生理状态的缺血保护方法。
Na+-K+ATPase主要位于细胞膜结构。Schwartz报道心肌缺血后24h组织匀浆Na+-K+ATPase活性无变化〔10〕。Beller应用相似的过程发现6h缺血此酶活性减弱〔11〕。心肌细胞Na+-K+ATPase活性依赖于膜磷脂、膜蛋白、离子浓度的存在。电镜酶细胞化学方法保存了心肌细胞结构的完整性，跨膜离子浓度梯度及膜磷脂蛋白，而生化测定方法离子浓度梯度及pH均控制在理想条件下，掩盖了上述条件变化引起的酶活性改变。因而，本试验选择电镜酶方法，以便更准确反映酶活性变化。酶活性减弱，可能会影响跨膜离子浓度的重建，进一步影响Na+-Ca2+交换引起钙超载，导致再灌注损伤〔4〕。本实验发现尼可地尔组，心肌酶活性变化小，可能是因为尼可地尔使缺血期跨膜离子浓度变化小，避免了钙超载，从而减轻了随之而产生的再灌注损伤。因此，再灌注后酶的活性没有进一步减少。
, 百拇医药
PCOs可能会成为一种比传统高钾更理想的停搏因子〔9〕。
参考文献
1.Baumgarten CM,Fozzard HA.Cardiac resting and pacemaker potential s.In:Fozzard HA,Haber E,Jennings RB.Katz AM,Morgan HE ed.Head and cardiovascular System.Scientific Foundations.New York:Raven press.1992.963-1001.
2.Maskal SL,Cohen NM,Hsia PW,et al.Hyperpolarized cardi ac arrest with a potassium-channel opener,aprikalim.J Thorac Cardiovasc Surg,199 5,110:1083-1095.
, http://www.100md.com
3.Lawton JS,Harrinton GC,Allen CT,et al.Myocardial protection with pinac idil cardioplegia in the blood-perfused heart.Ann Thorac Surg,1996,61:1680-1688.
4.Lawton JS,Hsia-PW,Damiano RJ,Adenosine-triphosphate-sensitive potassium -channel opener pinacidil is effective in blood cardioplegia.Ann Thorac Surg,199 8,66:768-73.
5.谷天祥,马跃文,张显清,等.心肌缺血再灌注Na+-K+ATPase活性变化及鹿茸精的保护作用.中国医科大学学报.1999,28:282-4.
, 百拇医药 6.Hearse DJ, Braimbridge MV, Jynge P.Protection of the ischemic myocardium :Cardioplegia.New York:Raven Press,1981.23-27.
7.Attwell D,Cohen I,Eisner D,et al.The steady-state TTX-se nsiti ve("Window")sodium current in cardiac Purkinje fibres.Pflugers Arch,1979,379:137 -142.
8.Lazdunski M,Frelin C,Vigne P.The sodium/hydrogen exchange system in ca rdiac cells:its biochemical and pharmacological properties and its role in regulating internal concentrations of sodium and internal pH.J Mol Cell Cardiol,1985, 17:1029-1042.
, 百拇医药
9.Chambers DJ.Polarization and myocardial protection.Curr Opin Cardiol.1 999,14:495-500.
10.Schwartz A.Biochemical and morphological correlates of cardiac ischemia.1,Membrane systems.Am J Cardiil,1978,82:46-54.
11.Beller GA,Couroy J,Smith TW.Ischemia-induced alteration in myocardial Na+-K+ATPase and cardiac glycoside binding.J Clin Invest,1976,57:341-350., http://www.100md.com
关键词：尼可地尔；停搏液；缺血再灌注损伤
摘要：
目的
目的：研究尼可地尔含血停搏液对心肌细胞Na+-K+ATPase的保护作用 。
方法：采用间生态离体免心共生支持系统模型。16个心脏随机分为两组，每组8只。分别采用尼可地尔超极化含血停跳液或者高钾去极化含血停跳液灌注。超极化含血停跳液由尼可地 尔(100m mol/L)，Krebs-Henseleit液和兔血1∶2混合配制。去极化停搏液由St.Thomas液与兔血1∶2混合配制，最终K+浓度20mmol/L。心脏停跳后以含血停跳液间断灌注，常温缺血60min，再灌注60min。采用电镜酶化学方法检测缺血前后心脏Na+-K+ATPase的变化。
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结果：缺血再灌注后两组中酶的活性均明显降低，高钾组(图B、D)中较尼可地尔组(图C、E)减少明显。
结论：尼可地尔对心肌细胞Na+-K+ATPase缺血再灌注损伤有保护作用。
传统高钾停博液将细胞阻断于去极化膜电位，此时许多能量消耗在离子转运泵上。这种有害的跨膜离子流会导致钙超载，加重心肌缺血再灌注损伤。钾通道开放剂(PCOs)用于心肌保 护，可以将细胞阻断于静息膜电位(超极化阻断)，跨膜离子流大为平衡且净离子流最小，有利于减少停博期间心肌细胞的能量消耗，并避免发生钙超载〔1〕。缺血再灌注损伤会导致Na+-K+ATPase活性降低。我们研究尼可地尔超极化停博液对心肌细胞Na+-K+ ATPase的保护作用。
材料与方法
采用离体兔心共生支持系统模型。成年大耳白兔32只，体重2.5～3.0kg，无论雌雄。每次实验两只动物，随机分为供兔与支持兔。
, 百拇医药
支持兔麻醉，气管切开，气管内插管，100%氧气吸入。监测动脉血气，维持动脉血pH7.35- 7.5，PCO235～45mmHg(1mmHg=0.133kPa)，PaO2>200mmHg。耳缘静脉注射肝素钠(2000U)。右股动脉插管，连接压力传感器进行持续有创压力监测。左颈内静脉及左颈动脉插管，两插管连接灌注泵管。动脉血泵入Langendorff灌注装置〔2〕。灌注液面高度80cm。溢出的液体回流到支持动物颈内静脉〔3〕。
供体兔麻醉，肝素化同上。正中开胸快速行心脏切除。收集胸腔内血液以配制含血停博液。 开放肺动脉，主动脉插管，悬挂固定，开始血液灌注〔4〕。
16个心脏随机分为两组，分别采用尼可地尔超极化含血停跳液(n=8)或者高钾去极化含血停跳液(n=8)进行心肌保护。超极化含血停跳液由Krebs-Henseleit液(mmol/L 蒸馏水，NaCl 11 8.5，NaHCO3 25.0，KCl 3.2，MgSO4 1.2 KH2PO4 1.2，glucose 5.5，CaCl 2 2.5)加nicorandil 50 mmol/L和兔血1∶2混合配制。去极化停搏液由St.Thomas液(mmol/L蒸馏水，NaCl 110.0，CaCl2 1.6，MgCl2 16.0，KCl 16.0)与兔血1∶2混合配制，最终达到KCl浓度为20mmol/L。两种停跳液pH，PaCO2相似〔4〕。每种停跳液中均加入肝素(12.5u/ml)。
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缺血期开始，关闭Langendorff灌注管。温血(37℃)停跳液自另外管道灌注，灌注液面高度80cm。达到机械电阻断后，每20min间断灌注2min。60min后，开放Langendorff灌注管，心脏再灌注60min。实验结束时取左室心肌标本。
Na+-K+ATPase电镜酶细胞化学〔5〕采用组织灌注固定5min(固定液含100mmol/L二甲砷酸钠缓冲液pH7.2，2%多聚甲醛，0.25%～0.5%戊二醛，6～8%蔗糖)，细切后再固定10min。相同缓冲液中加入10%DMSO，浸洗过夜。将组织切成40mm非冷冻切片。在孵育液中37℃孵育30min。100mmol/L二甲砷酸钠缓冲液中洗涤5min。1%饿酸-100mmol/L二甲砷酸钠缓冲液中固定30min。酒精逐级脱水后Epon树脂包理。AO超薄切片机切片，醋酸铀单染，透射电镜观察。
结 果
正常心肌细胞酶反应产物以高电子密度的黑色颗粒分布于细胞肌膜(图A)，其次见于肌浆网和血管内皮细胞。缺血再灌注后两组中酶的活性均明显降低，高钾组(图B、D)较尼可地尔组(图C、E)减少更明显。
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讨 论
高钾停搏液作为心脏外科心肌保护的金标准已经有20多年的历史了。常用高钾停跳液的浓度为15～20mmol/L。可以将膜电位由静息值约为-80mV去除化到-50mV〔6〕。此时，电压依赖快Na+通道失活导致舒张期阻断。但会有活跃的Na+“窗”电流〔7〕，导致细胞内Na+增多，随后，通过钙窗电流细胞内Ca2+增多，即使在阻断条件下也会产生过度收缩。这将导致钙超载，挛缩，再灌注损伤〔8〕。
PCOs可以导致超级化阻断，此时膜电位接近静息电位。从理论上说有许多优点。静息电位时跨膜离子阶差基本平衡，几乎不会激活离子泵和离子通道〔7〕，从而避免了钙超载，并最大限度保存了高能磷酸能量贮备。由于静息伏态下Na+和Ca2+通道关闭，Na+和Ca2+内流及超载会最大限度减小。理论上说这提供了一种更接近生理状态的缺血保护方法。
Na+-K+ATPase主要位于细胞膜结构。Schwartz报道心肌缺血后24h组织匀浆Na+-K+ATPase活性无变化〔10〕。Beller应用相似的过程发现6h缺血此酶活性减弱〔11〕。心肌细胞Na+-K+ATPase活性依赖于膜磷脂、膜蛋白、离子浓度的存在。电镜酶细胞化学方法保存了心肌细胞结构的完整性，跨膜离子浓度梯度及膜磷脂蛋白，而生化测定方法离子浓度梯度及pH均控制在理想条件下，掩盖了上述条件变化引起的酶活性改变。因而，本试验选择电镜酶方法，以便更准确反映酶活性变化。酶活性减弱，可能会影响跨膜离子浓度的重建，进一步影响Na+-Ca2+交换引起钙超载，导致再灌注损伤〔4〕。本实验发现尼可地尔组，心肌酶活性变化小，可能是因为尼可地尔使缺血期跨膜离子浓度变化小，避免了钙超载，从而减轻了随之而产生的再灌注损伤。因此，再灌注后酶的活性没有进一步减少。
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PCOs可能会成为一种比传统高钾更理想的停搏因子〔9〕。
参考文献
1.Baumgarten CM,Fozzard HA.Cardiac resting and pacemaker potential s.In:Fozzard HA,Haber E,Jennings RB.Katz AM,Morgan HE ed.Head and cardiovascular System.Scientific Foundations.New York:Raven press.1992.963-1001.
2.Maskal SL,Cohen NM,Hsia PW,et al.Hyperpolarized cardi ac arrest with a potassium-channel opener,aprikalim.J Thorac Cardiovasc Surg,199 5,110:1083-1095.
, http://www.100md.com
3.Lawton JS,Harrinton GC,Allen CT,et al.Myocardial protection with pinac idil cardioplegia in the blood-perfused heart.Ann Thorac Surg,1996,61:1680-1688.
4.Lawton JS,Hsia-PW,Damiano RJ,Adenosine-triphosphate-sensitive potassium -channel opener pinacidil is effective in blood cardioplegia.Ann Thorac Surg,199 8,66:768-73.
5.谷天祥,马跃文,张显清,等.心肌缺血再灌注Na+-K+ATPase活性变化及鹿茸精的保护作用.中国医科大学学报.1999,28:282-4.
, 百拇医药 6.Hearse DJ, Braimbridge MV, Jynge P.Protection of the ischemic myocardium :Cardioplegia.New York:Raven Press,1981.23-27.
7.Attwell D,Cohen I,Eisner D,et al.The steady-state TTX-se nsiti ve("Window")sodium current in cardiac Purkinje fibres.Pflugers Arch,1979,379:137 -142.
8.Lazdunski M,Frelin C,Vigne P.The sodium/hydrogen exchange system in ca rdiac cells:its biochemical and pharmacological properties and its role in regulating internal concentrations of sodium and internal pH.J Mol Cell Cardiol,1985, 17:1029-1042.
, 百拇医药
9.Chambers DJ.Polarization and myocardial protection.Curr Opin Cardiol.1 999,14:495-500.
10.Schwartz A.Biochemical and morphological correlates of cardiac ischemia.1,Membrane systems.Am J Cardiil,1978,82:46-54.
11.Beller GA,Couroy J,Smith TW.Ischemia-induced alteration in myocardial Na+-K+ATPase and cardiac glycoside binding.J Clin Invest,1976,57:341-350., http://www.100md.com