尼可地尔对改善冠状动脉内皮细胞低温保存的作用
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体外循环杂志 2001年第1期第3卷
100037 北京 中国医学科学院阜外心血管病医院麻醉体外循环科 世康；龙村；程邦昌
关键词：尼可地尔；冠状动脉内皮细胞；内皮源性超极化因子；保存
摘要：
目的 目的：探讨在冷缺血期间高钾溶液中尼可地尔(NCR)对改善猪冠状动脉内皮细胞保存效果的影响。
方法：取新鲜猪心外膜下冠状动脉前降支下三分之一，切成3mm长的血管环。分别用Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(KH)、高钾溶液(20mmol/L、50mmol/L)及加入NCR(0.1mmol/L)的高钾溶液(20mmol/L、50mmol/L)保存4小时，采用器官槽法，监测在37℃有氧条件下，一氧化氮合成酶阻断剂LNNA(7μmol/L)和环加氧酶阻断剂indomethacin(300μmol/L)作用后，前列腺素F2α(30nmol/L)及非受体介导钙离子载体(A23187)引发的收缩舒张反应。
, 百拇医药
结果：与浸泡于KH的冠状动脉相比，A23187引发的血管舒张反应，浸泡于高钾溶液明显减低，浸泡于含NCR的50mmol/L高钾溶液虽反应有所增强，但仍有显著性差异，浸泡于含NCR的20 mmol/L高钾溶液差异无显著性。
结论：低温下NCR对冠状动脉内皮源性超极化因子介导的血管舒张功能有保护作用。当钾离子浓度为20mmol/L时，其保护效果显著；若钾离子浓度为50mmol/L时，效果降低。
既往研究表明尼可地尔(NCR)能改善供心的低温保存效果〔1〕。但低温下其对冠状动脉内皮细胞功能影响研究报道不多。冠状动脉内皮细胞能分泌多种活性物质来调节血管张力，改善心肌的血供。内皮源性超极化因子(EDHF)是一重要的具有舒张血管作用的活性物质〔2〕。本研究以离体猪冠状动脉为研究对象，采用器官槽法〔3〕，探讨低温下高钾溶液中NCR对EDHF介导血管舒张功能的影响。
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材料与方法
主要试剂和设备前列腺素F2α(U46619)，非受体介导钙离子载体(A23187)，一氧化氮合成酶阻断剂N椣趸鶙L椌彼?/FONT>(LNNA)，环加氧酶阻断剂消炎痛(i ndomethacin)，(以上均来自美国Sigma公司)，配置Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(KH)的试 剂(均为国产分析纯试剂)，NCR(日本)，超级恒温器(WC109-5重庆试验设备厂)，肌张力 换能器(JZ101新航机电设备有限公司)，Powerlab八通道主机/后置(澳大利亚(AD Instrum ents Pty Ltd),Powerlab八通道主机/前置(澳大利亚Bridge AD Instruments Pty Ltd)，血管张力计算机软件(Powerlab Chart v3.4.3澳大利亚 AD Instr uments Pty Ltd)，微量进液器(上海医用激光仪器厂)，恒温预充玻璃器皿(军事医学科学院实验仪器厂)，大、小玻璃浴槽(军事医学科学院实验仪器厂)，器官保存箱(美国Colemn公司 )，95%O2+5%CO2(北京氧气厂)。
, 百拇医药
建立模型猪心取自当地肉联厂刚宰杀的生猪(雌雄不限)，置入4℃的KH中，20分钟内送回实验室，选心外膜下冠状动脉前降支中下三分之一，切成几段3cm的血管环。将血管环悬挂于一对不锈钢丝上，悬挂血管环上方的不锈钢丝与肌张力换能器相连接。实验器官槽充以9ml KH(mmol/L含NaCl 118, KCl 4.7,CaCl2 2.52,MgSO4(7H2O)1.2,NaHCO3 24.2 ,KH2PO41.18,glucost 5.55,pH=7.35)，液体中持续通入充95%O2+5%CO2混合气体以保证其中PO2>53.5kPa(1kPa=7.5mmHg),PCO2>5.33kPa。温度维持37℃。最后随机选取四段3cm的血管环，将一直径与血管口径相近的棉杆插入血管腔紧贴内皮轻柔摩擦1min，去除内皮，观察其对A 23187的反应。
, 百拇医药
实验步骤及分组随机分组：A为对照组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧的KH中4小时，然后悬挂固定血管环于37℃持续通入充95%O2+5%CO2混合气体的KH中，予2.5～3.0g的前负荷至血管环并维持平衡60分钟，加入indomethacin(7μ mol/L)和LNNA(300μ mol/L)水浴30分钟，再加入U46619(30nmol/L)使血管环预收缩达一稳定的平台(通常10分钟左右)。依次加入不同浓度的A23187(10-10-10-6mol/L)舒张血管环。B组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含有钾50mmol/L的KH 4小时，余处理同对照组；C组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含有钾20mmol/L的KH 4小时，余处理同对照组；D组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含10-4mol/L NCR的50mmol/L高钾KH 4小时，余处理同对照组；E组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含10-4mol/L NCR的20mmol/L高钾KH 4小时，余处理同对照组 。
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观察指标 U46619引起冠状动脉最大的预收缩强度；A23187引起的内皮源性舒张(占预收缩高度的百分比)。
统计学处理应用SPSS软件微机处理，数据采用均数±标准差(x±s)表示。组间比较用Anova方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。
结 果
1.U46619引发的冠状动脉预收缩强度；各组差别无显著性。见表1。
表1 各组U46619预收缩强度
组别
样本含量
收缩强度(g)
A组
, 百拇医药
7
2.46±0.56
B组
7
2.55±0.55
C组
7
2.80±0.48
D组
7
2.93±0.71
E组
7
, 百拇医药
2.60±0.52
2.A23187引发的内皮源性舒张：A23187(10-6mol/L)引发的血管舒张反应程度，A组与B、C、D组相比，差别有显著性(62.03±9.65%vs35.09±10.00%、27.21±6.78%、42.97±10.12%P<0.01)，C组与E组，差别有显著性(27.21±6.78%vs59.56±10.38% 42.97±10.12%vs35.09±10.00% P=0.18)。
讨 论
内皮细胞具有高度代谢活性和内分泌功能，对机体许多生理活动具有调节制衡的作 用。冠状动脉内皮细胞合成和释放一氧化氮(NO)、前列腺素(PGI2)及EDHF等三种具有血管舒张作用活性物质。其中EDHF的作用机制及化学性质目前尚未清楚。有研究表明，EDHF在血管内皮源性舒张的调节过程中起着重要的作用；EDHF通过超极化血管平滑肌，促进细胞钙激动性钾通道(Kca通道)的开放，降低细胞内的钙而舒张血管；花生四烯酸经细胞色素P 450单氧化酶的代谢产物有类似于EDHF的特征〔2〕。本研究结果显示，离体冠状动脉在低温无氧的条件下保存4小时后，阻断了NO和PGI2舒张血管的途径，EDHF仍处于可激活状态，A23187能引发62.03%的血管舒张。
, 百拇医药
研究结果表明，浸泡于缺氧的20mmol/L、50mmol/L高钾溶液4小时后，A23187引发内皮源性舒张反应程度均明显降低。这说明高钾溶液抑制EDHF舒张血管的功能。高钾对EDHF的损害可能有两方面原因，一方面是高钾的去极化作用使平滑肌细胞的超极化过程延迟，另一方面是高钾阻碍了钾通道，特别是细胞Kca通道的开放〔3〕。
NCR属于PCOS类药物，其舒张血管作用的机制有二〔4〕：一是通过激活ATP敏感性钾通道，促进胞内钾外流，使血管平滑肌细胞膜超极化。从而减少细胞外钙的内流，降低细胞内收缩因子对钙的敏感性，抑制细胞内的钙离子代谢并促使细胞内钙的流出；二是硝酸酯样作用，增加细胞内cGMP的生成，降低细胞内钙。He等〔5〕通过对离体猪冠状动脉研究，发现在高钾溶液中，PCOS类药物对EDHF介导血管舒张功能有保护作用。认为PCOS类药物对血管平滑肌细胞膜超级化作用，可抵消高钾去极化作用的影响。
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本研究结果显示，冠状动脉浸泡于含有NCR(10-4mol/L)的20mmol/L氯化钾溶液4小时后，A23187引发内皮源性舒张反应程度，与浸泡于20mmol/L氯化钾溶液的对比，差异有显著意义。浸泡于含NCR(10-4mol/L)的50mmol/L氯化钾溶液4小时后，A23187引发内皮源性舒张反应程度，与浸泡于50mmol/L高钾溶液的对比，虽然稍有恢复，但两者无明显差异。说明NCR在20mmol/L高钾溶液中能防止高钾对EDHF的抑制作用，但在50mmol/L高钾溶液中其保护效果降低。
NCR的保护效应可能与其能使血管平滑肌细胞膜超极化的作用有关。当溶液的钾浓度相对较低(≤20mmol/L)时，NCR的超极化作用可抵消高钾去极化作用对EDHF的超极化过程的影响；若溶液的钾浓度过高(≥50mmol/L)时，其去极化程度超过了NCR对平滑肌细胞膜的超极化程度，则NCR对EDHF的保护效果下降或消失。但确切原因需进一步研究。总之，本研究提示，NCR能防止高钾溶液低温保存时对EDHF的功能的损伤。这种作用在溶液的钾离子浓度为20mmol/L明显，但当钾离子浓度达50mmol/L时，其保护效果减低。目前，高钾器官保存液在临床广泛应用，若进一步证实NCR在临床高钾保存液中对冠状动脉内皮细胞功能的保护效果，则有望在常规保护方法的基础上，获得更好的移植效果。
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参考文献
1.Gu K,Sin S,Sattoh Y,et al.Cardioprotective effect of nicorandil in histidine-trypophan-ketoglurate solution during the cold storage of islolated hearts.Transplantation,1996,61:1572～1575.
2.Feletou M,Vanhoutte PM.The alternative EDHF.J Mol Cell Cardial,1999,31 :15～22.
3.He GW,Yang CQ.Depolaring cardiac arrest and EDHF-mediated hyperpolariz ation and relaxation in coronary arteries:the effect and mechanism.J Thorac Card iovasc Surg,1997,113:932～941.
4.Kukovetz WR,Holzmann S,Braid C,et al.Dual mechanism of the relaxing ef fect of nicorandil by stimulation of cyclic GMP formation and by hyperpolarizati on.J Careiovasc Pharmacol,1991,17:627～633.
5.He GW.Potassium-channel opener in cardioplegic may restore coronary en dothelial function.Ann Thorac Surg,1998,66:318～322., 百拇医药
关键词：尼可地尔；冠状动脉内皮细胞；内皮源性超极化因子；保存
摘要：
目的 目的：探讨在冷缺血期间高钾溶液中尼可地尔(NCR)对改善猪冠状动脉内皮细胞保存效果的影响。
方法：取新鲜猪心外膜下冠状动脉前降支下三分之一，切成3mm长的血管环。分别用Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(KH)、高钾溶液(20mmol/L、50mmol/L)及加入NCR(0.1mmol/L)的高钾溶液(20mmol/L、50mmol/L)保存4小时，采用器官槽法，监测在37℃有氧条件下，一氧化氮合成酶阻断剂LNNA(7μmol/L)和环加氧酶阻断剂indomethacin(300μmol/L)作用后，前列腺素F2α(30nmol/L)及非受体介导钙离子载体(A23187)引发的收缩舒张反应。
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结果：与浸泡于KH的冠状动脉相比，A23187引发的血管舒张反应，浸泡于高钾溶液明显减低，浸泡于含NCR的50mmol/L高钾溶液虽反应有所增强，但仍有显著性差异，浸泡于含NCR的20 mmol/L高钾溶液差异无显著性。
结论：低温下NCR对冠状动脉内皮源性超极化因子介导的血管舒张功能有保护作用。当钾离子浓度为20mmol/L时，其保护效果显著；若钾离子浓度为50mmol/L时，效果降低。
既往研究表明尼可地尔(NCR)能改善供心的低温保存效果〔1〕。但低温下其对冠状动脉内皮细胞功能影响研究报道不多。冠状动脉内皮细胞能分泌多种活性物质来调节血管张力，改善心肌的血供。内皮源性超极化因子(EDHF)是一重要的具有舒张血管作用的活性物质〔2〕。本研究以离体猪冠状动脉为研究对象，采用器官槽法〔3〕，探讨低温下高钾溶液中NCR对EDHF介导血管舒张功能的影响。
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材料与方法
主要试剂和设备前列腺素F2α(U46619)，非受体介导钙离子载体(A23187)，一氧化氮合成酶阻断剂N椣趸鶙L椌彼?/FONT>(LNNA)，环加氧酶阻断剂消炎痛(i ndomethacin)，(以上均来自美国Sigma公司)，配置Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(KH)的试 剂(均为国产分析纯试剂)，NCR(日本)，超级恒温器(WC109-5重庆试验设备厂)，肌张力 换能器(JZ101新航机电设备有限公司)，Powerlab八通道主机/后置(澳大利亚(AD Instrum ents Pty Ltd),Powerlab八通道主机/前置(澳大利亚Bridge AD Instruments Pty Ltd)，血管张力计算机软件(Powerlab Chart v3.4.3澳大利亚 AD Instr uments Pty Ltd)，微量进液器(上海医用激光仪器厂)，恒温预充玻璃器皿(军事医学科学院实验仪器厂)，大、小玻璃浴槽(军事医学科学院实验仪器厂)，器官保存箱(美国Colemn公司 )，95%O2+5%CO2(北京氧气厂)。
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建立模型猪心取自当地肉联厂刚宰杀的生猪(雌雄不限)，置入4℃的KH中，20分钟内送回实验室，选心外膜下冠状动脉前降支中下三分之一，切成几段3cm的血管环。将血管环悬挂于一对不锈钢丝上，悬挂血管环上方的不锈钢丝与肌张力换能器相连接。实验器官槽充以9ml KH(mmol/L含NaCl 118, KCl 4.7,CaCl2 2.52,MgSO4(7H2O)1.2,NaHCO3 24.2 ,KH2PO41.18,glucost 5.55,pH=7.35)，液体中持续通入充95%O2+5%CO2混合气体以保证其中PO2>53.5kPa(1kPa=7.5mmHg),PCO2>5.33kPa。温度维持37℃。最后随机选取四段3cm的血管环，将一直径与血管口径相近的棉杆插入血管腔紧贴内皮轻柔摩擦1min，去除内皮，观察其对A 23187的反应。
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实验步骤及分组随机分组：A为对照组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧的KH中4小时，然后悬挂固定血管环于37℃持续通入充95%O2+5%CO2混合气体的KH中，予2.5～3.0g的前负荷至血管环并维持平衡60分钟，加入indomethacin(7μ mol/L)和LNNA(300μ mol/L)水浴30分钟，再加入U46619(30nmol/L)使血管环预收缩达一稳定的平台(通常10分钟左右)。依次加入不同浓度的A23187(10-10-10-6mol/L)舒张血管环。B组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含有钾50mmol/L的KH 4小时，余处理同对照组；C组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含有钾20mmol/L的KH 4小时，余处理同对照组；D组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含10-4mol/L NCR的50mmol/L高钾KH 4小时，余处理同对照组；E组(n=7)，先将血管环浸泡于4℃无氧含10-4mol/L NCR的20mmol/L高钾KH 4小时，余处理同对照组 。
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观察指标 U46619引起冠状动脉最大的预收缩强度；A23187引起的内皮源性舒张(占预收缩高度的百分比)。
统计学处理应用SPSS软件微机处理，数据采用均数±标准差(x±s)表示。组间比较用Anova方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。
结 果
1.U46619引发的冠状动脉预收缩强度；各组差别无显著性。见表1。
表1 各组U46619预收缩强度
组别
样本含量
收缩强度(g)
A组
, 百拇医药
7
2.46±0.56
B组
7
2.55±0.55
C组
7
2.80±0.48
D组
7
2.93±0.71
E组
7
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2.60±0.52
2.A23187引发的内皮源性舒张：A23187(10-6mol/L)引发的血管舒张反应程度，A组与B、C、D组相比，差别有显著性(62.03±9.65%vs35.09±10.00%、27.21±6.78%、42.97±10.12%P<0.01)，C组与E组，差别有显著性(27.21±6.78%vs59.56±10.38% 42.97±10.12%vs35.09±10.00% P=0.18)。
讨 论
内皮细胞具有高度代谢活性和内分泌功能，对机体许多生理活动具有调节制衡的作 用。冠状动脉内皮细胞合成和释放一氧化氮(NO)、前列腺素(PGI2)及EDHF等三种具有血管舒张作用活性物质。其中EDHF的作用机制及化学性质目前尚未清楚。有研究表明，EDHF在血管内皮源性舒张的调节过程中起着重要的作用；EDHF通过超极化血管平滑肌，促进细胞钙激动性钾通道(Kca通道)的开放，降低细胞内的钙而舒张血管；花生四烯酸经细胞色素P 450单氧化酶的代谢产物有类似于EDHF的特征〔2〕。本研究结果显示，离体冠状动脉在低温无氧的条件下保存4小时后，阻断了NO和PGI2舒张血管的途径，EDHF仍处于可激活状态，A23187能引发62.03%的血管舒张。
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研究结果表明，浸泡于缺氧的20mmol/L、50mmol/L高钾溶液4小时后，A23187引发内皮源性舒张反应程度均明显降低。这说明高钾溶液抑制EDHF舒张血管的功能。高钾对EDHF的损害可能有两方面原因，一方面是高钾的去极化作用使平滑肌细胞的超极化过程延迟，另一方面是高钾阻碍了钾通道，特别是细胞Kca通道的开放〔3〕。
NCR属于PCOS类药物，其舒张血管作用的机制有二〔4〕：一是通过激活ATP敏感性钾通道，促进胞内钾外流，使血管平滑肌细胞膜超极化。从而减少细胞外钙的内流，降低细胞内收缩因子对钙的敏感性，抑制细胞内的钙离子代谢并促使细胞内钙的流出；二是硝酸酯样作用，增加细胞内cGMP的生成，降低细胞内钙。He等〔5〕通过对离体猪冠状动脉研究，发现在高钾溶液中，PCOS类药物对EDHF介导血管舒张功能有保护作用。认为PCOS类药物对血管平滑肌细胞膜超级化作用，可抵消高钾去极化作用的影响。
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本研究结果显示，冠状动脉浸泡于含有NCR(10-4mol/L)的20mmol/L氯化钾溶液4小时后，A23187引发内皮源性舒张反应程度，与浸泡于20mmol/L氯化钾溶液的对比，差异有显著意义。浸泡于含NCR(10-4mol/L)的50mmol/L氯化钾溶液4小时后，A23187引发内皮源性舒张反应程度，与浸泡于50mmol/L高钾溶液的对比，虽然稍有恢复，但两者无明显差异。说明NCR在20mmol/L高钾溶液中能防止高钾对EDHF的抑制作用，但在50mmol/L高钾溶液中其保护效果降低。
NCR的保护效应可能与其能使血管平滑肌细胞膜超极化的作用有关。当溶液的钾浓度相对较低(≤20mmol/L)时，NCR的超极化作用可抵消高钾去极化作用对EDHF的超极化过程的影响；若溶液的钾浓度过高(≥50mmol/L)时，其去极化程度超过了NCR对平滑肌细胞膜的超极化程度，则NCR对EDHF的保护效果下降或消失。但确切原因需进一步研究。总之，本研究提示，NCR能防止高钾溶液低温保存时对EDHF的功能的损伤。这种作用在溶液的钾离子浓度为20mmol/L明显，但当钾离子浓度达50mmol/L时，其保护效果减低。目前，高钾器官保存液在临床广泛应用，若进一步证实NCR在临床高钾保存液中对冠状动脉内皮细胞功能的保护效果，则有望在常规保护方法的基础上，获得更好的移植效果。
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参考文献
1.Gu K,Sin S,Sattoh Y,et al.Cardioprotective effect of nicorandil in histidine-trypophan-ketoglurate solution during the cold storage of islolated hearts.Transplantation,1996,61:1572～1575.
2.Feletou M,Vanhoutte PM.The alternative EDHF.J Mol Cell Cardial,1999,31 :15～22.
3.He GW,Yang CQ.Depolaring cardiac arrest and EDHF-mediated hyperpolariz ation and relaxation in coronary arteries:the effect and mechanism.J Thorac Card iovasc Surg,1997,113:932～941.
4.Kukovetz WR,Holzmann S,Braid C,et al.Dual mechanism of the relaxing ef fect of nicorandil by stimulation of cyclic GMP formation and by hyperpolarizati on.J Careiovasc Pharmacol,1991,17:627～633.
5.He GW.Potassium-channel opener in cardioplegic may restore coronary en dothelial function.Ann Thorac Surg,1998,66:318～322., 百拇医药