两种心脏停搏液对兔未成熟乳头肌细胞电生理特性影响的实验研究
http://www.100md.com
体外循环杂志 2000年第4期第2卷
730000 兰州医学院第一附属医院心脏外科 赵举；龙村；姚忠喜
关键词：MST；HTK乳头肌；标准玻璃微电极技术；RP；AP
摘要：
目的目的：用标准玻璃微电极技术观察并记录两种心脏停搏液对兔未成熟乳头肌细胞电生理特性的影响。
方法：实验选用2～3周龄未成熟大耳白兔(226.47±20.06克)19只，随机分为MST组(N=9)和HTK组(N=10)，取左室乳头肌肌条，台氏液(36.5±0.5℃)平衡灌流60分钟后，分别用4℃改良St.Thomas液(MST)和Bretschneider溶液(HTK)灌流至停搏后30分钟，再行台氏液复灌60分钟。用标准玻璃微电极技术连续观察并记录乳头肌细胞电生理特性的改变。
结果：MST组停搏时间、复灌后复跳时间均较HTK组短；停搏时RP值、停搏期间最高RP值均较低，表现较好的能量储备；复灌后MST组RP、APA、OS、Vmax、APD 50、APD 90的恢复比HTK组更早，提示良好的心肌保护效果。两组复灌后平台期时程(D2)明显延长，与基础值比较有显著性差别。
, 百拇医药
结论：MST液对未成熟兔乳头肌细胞电生理特性的保护效果优于HTK液。
材料与方法
未成年健康大耳白兔19只，雌雄不限，2～3周龄，体重226.47±20.06克。腹腔麻醉，股静脉内肝素化，游离完整乳头肌条，置于预先准备好的灌流槽内，充氧台氏液持续灌流，槽内温度36.5±0.5℃，灌流速度2ml/min。用1.5～2倍于阈刺激、120次/分的信号使乳头肌节律性收缩。平衡60分钟后，用显微推进器将尖端小于1μm、阻抗>10MΩ、内充3M KC1的标准玻璃微电极刺入肌条，观察电位信号的改变，出现特征性的心肌动作电位并稳定15分钟以上者，记录乳头肌细胞电生理特性作为实验对照；用4℃的心脏停搏液(MST和HTK)以相同的速度灌流肌条，连续记录细胞电生理信号的改变直至停跳后30分钟；用再充氧台氏液复灌60分，流量同前。观察并记录复灌后细胞电信号。
实验分组：MST组和HTK组。
, 百拇医药
统计学处理：用SPSS医学统计软件
1)心脏停搏液心肌保护效果评价：每组各参数自身配对t检验
2)两种停搏液心肌保护效果对比：成组t检验
1.两组动物体重、电极阻抗和停搏前电生理各参数比较均无显著性差异。
2.复灌后电生理参数的恢复情况：
如表1、2所示。MST组各参数均较HTK组恢复迅速，RP(静息电位)在复灌15分钟就已恢复，AP(动作电位)、APD50(50%复极化所需时间)、APD90(90%复极化所需时间)20分钟恢复，OS(超射值)及Vmax(0期最大除极速度)也在30分钟达到停搏前水平。HTK组RP、OS、APD50、APD90值均在复灌后30分钟恢复，AP、Vmax复灌后45分钟后恢复至停搏前水平。
, http://www.100md.com
表1 H复灌后HTK组电生理参数的波变化
项目
停搏前
15分
20分
30分
45分
60分
RP(mV)
-85.66±1.25
-78.06±4.50*
-80.16±5.34*
, http://www.100md.com
-84.25±1.99
-85.00±1.70
-85.41±1.88
AP(mV)
113.53±3.83
98.92±6.67*
103.71±6.66*
109.62±3.70*
111.06±3.67
112.14±3.10
, 百拇医药 OS(mV)
27.86±4.03
21.96±3.83*
23.53±3.72*
25.34±3.98
26.06±2.43
26.69±2.35
Vmax(V/S)
65.13±9.80
57.13±12.25*
56.42±16.17*
, http://www.100md.com
56.19±11.28*
57.62±9.29*
64.16±9.44
APD50(ms)
80.63±19.6
86.30±7.84*
84.32±9.41*
78.92±7.62
79.74±8.63
76.49±10.09
, http://www.100md.com
APD90(ms)
118.02±28.43
132.68±14.83*
126.95±12.28*
102.52±9.68
101.5±13.23
100.28±14.12
注：*与停搏前基础值相比p<0.05
表2 复灌后MST组电生理参数的变化
项目
, http://www.100md.com
停搏前
15分
20分
30分
45分
60分
RP(mV)
-84.00±2.34
-80.60±4.43
-82.59±4.67
-82.94±2.33
-83.49±2.33
, 百拇医药
-83.81±2.38
AP(mV)
112.50±3.37
104.48±7.68*
107.48±6.92
110.13±5.49
110.83±4.18
112.88±4.16
OS(mV)
28.54±2.85
23.67±4.65*
, http://www.100md.com
24.89±3.47*
27.18±3.48
27.34±2.48
29.09±2.14
Vmax(V/S)
64.14±8.46
51.79±11.94*
53.78±9.20*
59.39±8.47
57.78±9.93
64.37±8.22
, 百拇医药
APD50(ms)
71.29±7.20
85.40±9.76*
78.69±10.33
76.69±5.59
72.18±7.50
70.71±5.71
APD90(ms)
104.66±14.02
120.24±13.87*
, 百拇医药
108.68±14.61
97.31±8.33
95.58±9.05
96.73±5.74
注：*与停搏前基础值相比p<0.05
3.静息电位的改变：MST组RP恢复优于HTK组。
4.组间比较：见表3。
表3 两组间比较
组别
停搏时间(秒)
停搏时RP值
, http://www.100md.com
停搏时RP最高值(mV)
复跳时间(秒)
复跳时RP值(mV)
MST
98.89±14.31
-60.28±2.05
-53.94±1.36
411.11±74.41
-74.40±3.63
HTK
217.23±23.12
-55.6±2.76
, 百拇医药
-49.8±0.67
672.00±66.63
-72.7±4.55
P值
P<0.01
P<0.01
P<0.01
P<0.01
P>0.05
讨 论
一、停搏/复灌期间电生理参数的改变：
1.静息电位的改变：
, 百拇医药
本实验所得未成熟兔停搏前RP值平均为-84.83±1.78mV。高钾液灌流细胞外钾离子浓度明显升高，钾离子平衡电位失衡，细胞外钾内流，膜内阴离子相对减少，细胞静息电位升高(绝对值降低)，表现为膜的去极化。因MST组钾离子浓度是HTK组的2倍，故静息电位升高更快。当静息电位升至-60mV时，MST组乳头肌肌条即发生停搏，HTK组则在-55mV才表现间歇性停搏，二者无显著性差异。停搏后静息电位值却不因停博液的持续灌流而上升，说明在此浓度的细胞外钾离子作用下心肌细胞钾离子平衡电位重新达到平衡。此时静息电位已超过正常心肌细胞的阈电位水平，电压依赖性钠离子通道完全失活，即使在阈上刺激的作用下也不能形成动作电位的0期除极，细胞处于静息状态，心脏处于舒张期停搏[1]。恢复灌流静息电位缓慢降低，在-72mV左右时细胞恢复兴奋性，说明此电位水平膜表面失活的离子通道重新复活，产生动作电位及有节律的收缩与舒张活动。MST组复灌后15分钟RP值即恢复到停搏前水平，HTK组在30分钟恢复，HTK液以其低钠无钙为特点，K+浓度为10mmol/L，一方面可以降低RP绝对值，另一方面使动作电位必需的细胞外Na+浓度减低，阻碍AP的形成。
, 百拇医药
2.动作电位2期平台期：
钙离子与动作电位2期平台期密切相关，平台期的长短影响细胞内钙离子浓度的高低。MST组和HTK组在复跳后平台期均有不同程度的延长，说明2期钙内流明显增加，与停搏前有显著性差异，且均在复灌后30分钟恢复到停搏前水平，而组间相同时点D2无统计学差异。目前认为钙超载的发生与低钙环境下赖以钙离子结合的细胞膜外板与糖被分离有很大关系，当低钙或无钙液灌流时外板与糖被分离，膜结构发生改变，通透性增加，复灌时正常浓度的钙离子顺浓度梯度进入细胞内[2]。其内流量的多少与内外离子浓度差、膜稳定性、高能磷酸化合物的消耗等有密切的关系。
3.动作电位、超射值、0期最大除极速度、APD50、APD90：
停搏液灌流时，随RP值的升高即刻表现出动作电位幅度降低，而后OS、Vmax、APD50、APD90均逐渐下降，直到动作电位完全消失。因细胞动作电位的特性很大程度上取决于静息电位的多少，所以在高浓度钾离子的MST组动作电位各参数变化较HTK组迅速，而且与静息电位的改变基本一致。复灌后MST组恢复仍然较快，可能与该组保护液内的普鲁卡因有关。普鲁卡因是一种相对无毒的局麻药，可以在血液中迅速分解，能可逆性地关闭Na+通道，阻滞Ca2+透过细胞膜，使肌肉组织和神经组织细胞迅速静止于极化状态，而且能延缓缺血期间心肌CP和ATP含量的下降[3]。
, http://www.100md.com
4.组间参数的比较：
两组实验对象在同等随机的条件下进行灌流，所得结果具有可比性。
1)MST组从停搏液灌流到肌条停搏所需时间明显短于HTK组，这与两种保护液中钾离子浓度的高低明显相关[4]。
2)停搏时RP值系肌条完全停搏瞬间心肌细胞的静息电位值，MST组停搏时RP值较HTK组低，与所含普鲁卡因可逆性关闭Na+通道有关[5]。
3)停搏期静息电位最高值表示细胞内外钾离子平衡电位的又一次形成。此期MST组仍低于HTK组表明普鲁卡因对Na+通道的可逆性关闭和对细胞膜的稳定性起着十分重要的作用。
4)复灌后MST组很快复跳，提示经改良ST Thomas停搏液保护的心肌细胞对外界环境改变的敏感性更高，细胞膜结构功能得到了更好的保护。
, 百拇医药
5)两组开始复跳的静息电位无显著性差异，提示Na+通道复活的电位差值相对固定。
结 论
经改良ST Thomas停搏液灌流后的乳头肌复灌后RP、AP的恢复较Brestchneider液更早，停搏期间的电位更有利于细胞膜的稳定，对兔未成熟乳头肌细胞电生理特性的保护效果更佳。
参考文献
1.Cox JL,Sabiston DJ.Electrophysiologic consequences of cardioplegic preservation ischemia and reperfusion.In Engelman RM,Levitsky S(eds):A testbook of clinical cardioplegia.New York;Futura Publishing Company Inc,1982.405-417.
, 百拇医药
2.Kass RS,Lecerer WJ.Role of calcium ions in transient inward currents and aftercontractions induced by strophanthidin in cardiac Purkinje fibres.J Physiol,1978,281:187-208.
3.Bretschneider HJ.The ingredients of HTK cardioplegia solution. Leopoldina, 1992,37:161.
4.Cole WC.ATP-sensitive K+ channels in cardiac ischemia:an endogenous mechanism for protection of the heart.Cardiovasc Drugs Ther,1993,7(Suppl 3):527-537.
5.Kimose HH,Helligso P,Randsbaek F,et al.Improved recovery after cold crystalloid cardioplegia using low-dose glutamate enrichment during reperfusion after aortic unclamping:a study in isolated blood-perfused pig hearts.Thorac Cardiovasc Surg,1996,44:118-25., 百拇医药
关键词：MST；HTK乳头肌；标准玻璃微电极技术；RP；AP
摘要：
目的目的：用标准玻璃微电极技术观察并记录两种心脏停搏液对兔未成熟乳头肌细胞电生理特性的影响。
方法：实验选用2～3周龄未成熟大耳白兔(226.47±20.06克)19只，随机分为MST组(N=9)和HTK组(N=10)，取左室乳头肌肌条，台氏液(36.5±0.5℃)平衡灌流60分钟后，分别用4℃改良St.Thomas液(MST)和Bretschneider溶液(HTK)灌流至停搏后30分钟，再行台氏液复灌60分钟。用标准玻璃微电极技术连续观察并记录乳头肌细胞电生理特性的改变。
结果：MST组停搏时间、复灌后复跳时间均较HTK组短；停搏时RP值、停搏期间最高RP值均较低，表现较好的能量储备；复灌后MST组RP、APA、OS、Vmax、APD 50、APD 90的恢复比HTK组更早，提示良好的心肌保护效果。两组复灌后平台期时程(D2)明显延长，与基础值比较有显著性差别。
, 百拇医药
结论：MST液对未成熟兔乳头肌细胞电生理特性的保护效果优于HTK液。
材料与方法
未成年健康大耳白兔19只，雌雄不限，2～3周龄，体重226.47±20.06克。腹腔麻醉，股静脉内肝素化，游离完整乳头肌条，置于预先准备好的灌流槽内，充氧台氏液持续灌流，槽内温度36.5±0.5℃，灌流速度2ml/min。用1.5～2倍于阈刺激、120次/分的信号使乳头肌节律性收缩。平衡60分钟后，用显微推进器将尖端小于1μm、阻抗>10MΩ、内充3M KC1的标准玻璃微电极刺入肌条，观察电位信号的改变，出现特征性的心肌动作电位并稳定15分钟以上者，记录乳头肌细胞电生理特性作为实验对照；用4℃的心脏停搏液(MST和HTK)以相同的速度灌流肌条，连续记录细胞电生理信号的改变直至停跳后30分钟；用再充氧台氏液复灌60分，流量同前。观察并记录复灌后细胞电信号。
实验分组：MST组和HTK组。
, 百拇医药
统计学处理：用SPSS医学统计软件
1)心脏停搏液心肌保护效果评价：每组各参数自身配对t检验
2)两种停搏液心肌保护效果对比：成组t检验
1.两组动物体重、电极阻抗和停搏前电生理各参数比较均无显著性差异。
2.复灌后电生理参数的恢复情况：
如表1、2所示。MST组各参数均较HTK组恢复迅速，RP(静息电位)在复灌15分钟就已恢复，AP(动作电位)、APD50(50%复极化所需时间)、APD90(90%复极化所需时间)20分钟恢复，OS(超射值)及Vmax(0期最大除极速度)也在30分钟达到停搏前水平。HTK组RP、OS、APD50、APD90值均在复灌后30分钟恢复，AP、Vmax复灌后45分钟后恢复至停搏前水平。
, http://www.100md.com
表1 H复灌后HTK组电生理参数的波变化
项目
停搏前
15分
20分
30分
45分
60分
RP(mV)
-85.66±1.25
-78.06±4.50*
-80.16±5.34*
, http://www.100md.com
-84.25±1.99
-85.00±1.70
-85.41±1.88
AP(mV)
113.53±3.83
98.92±6.67*
103.71±6.66*
109.62±3.70*
111.06±3.67
112.14±3.10
, 百拇医药 OS(mV)
27.86±4.03
21.96±3.83*
23.53±3.72*
25.34±3.98
26.06±2.43
26.69±2.35
Vmax(V/S)
65.13±9.80
57.13±12.25*
56.42±16.17*
, http://www.100md.com
56.19±11.28*
57.62±9.29*
64.16±9.44
APD50(ms)
80.63±19.6
86.30±7.84*
84.32±9.41*
78.92±7.62
79.74±8.63
76.49±10.09
, http://www.100md.com
APD90(ms)
118.02±28.43
132.68±14.83*
126.95±12.28*
102.52±9.68
101.5±13.23
100.28±14.12
注：*与停搏前基础值相比p<0.05
表2 复灌后MST组电生理参数的变化
项目
, http://www.100md.com
停搏前
15分
20分
30分
45分
60分
RP(mV)
-84.00±2.34
-80.60±4.43
-82.59±4.67
-82.94±2.33
-83.49±2.33
, 百拇医药
-83.81±2.38
AP(mV)
112.50±3.37
104.48±7.68*
107.48±6.92
110.13±5.49
110.83±4.18
112.88±4.16
OS(mV)
28.54±2.85
23.67±4.65*
, http://www.100md.com
24.89±3.47*
27.18±3.48
27.34±2.48
29.09±2.14
Vmax(V/S)
64.14±8.46
51.79±11.94*
53.78±9.20*
59.39±8.47
57.78±9.93
64.37±8.22
, 百拇医药
APD50(ms)
71.29±7.20
85.40±9.76*
78.69±10.33
76.69±5.59
72.18±7.50
70.71±5.71
APD90(ms)
104.66±14.02
120.24±13.87*
, 百拇医药
108.68±14.61
97.31±8.33
95.58±9.05
96.73±5.74
注：*与停搏前基础值相比p<0.05
3.静息电位的改变：MST组RP恢复优于HTK组。
4.组间比较：见表3。
表3 两组间比较
组别
停搏时间(秒)
停搏时RP值
, http://www.100md.com
停搏时RP最高值(mV)
复跳时间(秒)
复跳时RP值(mV)
MST
98.89±14.31
-60.28±2.05
-53.94±1.36
411.11±74.41
-74.40±3.63
HTK
217.23±23.12
-55.6±2.76
, 百拇医药
-49.8±0.67
672.00±66.63
-72.7±4.55
P值
P<0.01
P<0.01
P<0.01
P<0.01
P>0.05
讨 论
一、停搏/复灌期间电生理参数的改变：
1.静息电位的改变：
, 百拇医药
本实验所得未成熟兔停搏前RP值平均为-84.83±1.78mV。高钾液灌流细胞外钾离子浓度明显升高，钾离子平衡电位失衡，细胞外钾内流，膜内阴离子相对减少，细胞静息电位升高(绝对值降低)，表现为膜的去极化。因MST组钾离子浓度是HTK组的2倍，故静息电位升高更快。当静息电位升至-60mV时，MST组乳头肌肌条即发生停搏，HTK组则在-55mV才表现间歇性停搏，二者无显著性差异。停搏后静息电位值却不因停博液的持续灌流而上升，说明在此浓度的细胞外钾离子作用下心肌细胞钾离子平衡电位重新达到平衡。此时静息电位已超过正常心肌细胞的阈电位水平，电压依赖性钠离子通道完全失活，即使在阈上刺激的作用下也不能形成动作电位的0期除极，细胞处于静息状态，心脏处于舒张期停搏[1]。恢复灌流静息电位缓慢降低，在-72mV左右时细胞恢复兴奋性，说明此电位水平膜表面失活的离子通道重新复活，产生动作电位及有节律的收缩与舒张活动。MST组复灌后15分钟RP值即恢复到停搏前水平，HTK组在30分钟恢复，HTK液以其低钠无钙为特点，K+浓度为10mmol/L，一方面可以降低RP绝对值，另一方面使动作电位必需的细胞外Na+浓度减低，阻碍AP的形成。
, 百拇医药
2.动作电位2期平台期：
钙离子与动作电位2期平台期密切相关，平台期的长短影响细胞内钙离子浓度的高低。MST组和HTK组在复跳后平台期均有不同程度的延长，说明2期钙内流明显增加，与停搏前有显著性差异，且均在复灌后30分钟恢复到停搏前水平，而组间相同时点D2无统计学差异。目前认为钙超载的发生与低钙环境下赖以钙离子结合的细胞膜外板与糖被分离有很大关系，当低钙或无钙液灌流时外板与糖被分离，膜结构发生改变，通透性增加，复灌时正常浓度的钙离子顺浓度梯度进入细胞内[2]。其内流量的多少与内外离子浓度差、膜稳定性、高能磷酸化合物的消耗等有密切的关系。
3.动作电位、超射值、0期最大除极速度、APD50、APD90：
停搏液灌流时，随RP值的升高即刻表现出动作电位幅度降低，而后OS、Vmax、APD50、APD90均逐渐下降，直到动作电位完全消失。因细胞动作电位的特性很大程度上取决于静息电位的多少，所以在高浓度钾离子的MST组动作电位各参数变化较HTK组迅速，而且与静息电位的改变基本一致。复灌后MST组恢复仍然较快，可能与该组保护液内的普鲁卡因有关。普鲁卡因是一种相对无毒的局麻药，可以在血液中迅速分解，能可逆性地关闭Na+通道，阻滞Ca2+透过细胞膜，使肌肉组织和神经组织细胞迅速静止于极化状态，而且能延缓缺血期间心肌CP和ATP含量的下降[3]。
, http://www.100md.com
4.组间参数的比较：
两组实验对象在同等随机的条件下进行灌流，所得结果具有可比性。
1)MST组从停搏液灌流到肌条停搏所需时间明显短于HTK组，这与两种保护液中钾离子浓度的高低明显相关[4]。
2)停搏时RP值系肌条完全停搏瞬间心肌细胞的静息电位值，MST组停搏时RP值较HTK组低，与所含普鲁卡因可逆性关闭Na+通道有关[5]。
3)停搏期静息电位最高值表示细胞内外钾离子平衡电位的又一次形成。此期MST组仍低于HTK组表明普鲁卡因对Na+通道的可逆性关闭和对细胞膜的稳定性起着十分重要的作用。
4)复灌后MST组很快复跳，提示经改良ST Thomas停搏液保护的心肌细胞对外界环境改变的敏感性更高，细胞膜结构功能得到了更好的保护。
, 百拇医药
5)两组开始复跳的静息电位无显著性差异，提示Na+通道复活的电位差值相对固定。
结 论
经改良ST Thomas停搏液灌流后的乳头肌复灌后RP、AP的恢复较Brestchneider液更早，停搏期间的电位更有利于细胞膜的稳定，对兔未成熟乳头肌细胞电生理特性的保护效果更佳。
参考文献
1.Cox JL,Sabiston DJ.Electrophysiologic consequences of cardioplegic preservation ischemia and reperfusion.In Engelman RM,Levitsky S(eds):A testbook of clinical cardioplegia.New York;Futura Publishing Company Inc,1982.405-417.
, 百拇医药
2.Kass RS,Lecerer WJ.Role of calcium ions in transient inward currents and aftercontractions induced by strophanthidin in cardiac Purkinje fibres.J Physiol,1978,281:187-208.
3.Bretschneider HJ.The ingredients of HTK cardioplegia solution. Leopoldina, 1992,37:161.
4.Cole WC.ATP-sensitive K+ channels in cardiac ischemia:an endogenous mechanism for protection of the heart.Cardiovasc Drugs Ther,1993,7(Suppl 3):527-537.
5.Kimose HH,Helligso P,Randsbaek F,et al.Improved recovery after cold crystalloid cardioplegia using low-dose glutamate enrichment during reperfusion after aortic unclamping:a study in isolated blood-perfused pig hearts.Thorac Cardiovasc Surg,1996,44:118-25., 百拇医药