β-防御素——上皮组织天然的化学防御屏障
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国外医学外科学分册 2002年第2期第29卷
第四军医大学西京医院烧伤外科；西安；710033 庹晓晔(综述)；徐明达(审校)
关键词：β-防御素；结构；功能；组织分布；应用前景
摘要：产生抗微生物肽(antimicrobial peptide)是真核生物宿主防御的一个重要途径。防御素(defensins)是重要的一类抗微生物肽，包括四个亚家族，即植物防御素、昆虫防御素、α-防御素和β-防御素。其中β-防御素主要分布在脊椎动物的皮肤、粘膜等上皮组织，构成机体抵御微生物侵袭的第一道化学屏障，在组织烧伤等创伤感染中发挥重要作用。本文主要对β-防御素的结构、功能、分布和作为抗生素肽的应用前景进行综述。
因感染而造成的烧伤病人死亡率一直居高不下，因此寻找新型的、无细菌耐药性的抗生素极其重要。近年研究发现，真核生物能够产生大量的抗微生物肽或蛋白，广泛参与抑制和杀灭外源致病微生物的侵袭，构成机体宿主防御的一个重要途径。因其为机体内的天然蛋白，无耐药性这虞，故有希望开发为新型的抗生素，解决临床上因传统抗生素耐药而出现的尴尬局面。本文讨论的主要是小分子的抗微生物肽(一般小于100个氨基酸)，这些内源性的短肽分子能够破坏微生物细胞膜的结构和功能。人体内的防御素可分为α和β两种。两者分子结构相似，基因位于同一基因簇中，具有共同的进化起源。α-防御素主要由哺乳动物中性粒细胞和小肠Paneth细胞产生，也见于雌性动物的生殖上皮。α-防御素对革兰阳性菌、阴性菌、真菌、螺旋菌、分支杆菌、原生动物和包膜病毒具有广谱的杀伤作用。β-防御素由哺乳动物上皮细胞产生，分布在机体宿主-环境的界面位置，构成机体抵御外界微生物侵袭的第一道化学屏障。
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1、β-防御素的结构
1.1基因定位 目前已恨现的人类β-防御素(humanbeta-defensin,hBD)有3种，即hBD-1，hBD-2和hBD-3。与其他防御素家族成员一样，其基因均定位于人第第8号染色体上8P22～8P23区间<1Mb的范围内。各种防御素基因在染色体上最可能的排列顺序为：着丝粒hBD-2BD1-hNP1-端粒。由于hBD-2基因与其他基因之间的距离比其他基因之间典型的距离要长很多，所以怀疑hBD-2附近还存在新的防御素基因。Jia等分析了人第8号染色体8P22～8P23区间的基因组序列，发现了一个新的β-防御素成员——hBD-3。该基因位于hBD-2上游13kb的位置，并与hBD-2具有一致的转录方向。cDNA克隆及编码氨基酸序列分析表明其与Harder等新近从人牛皮癣病灶皮肤和上皮细胞培养上清中分离到的hBD-3相一致。进一步的分析发现，在hBD-3上游13kb处还有HE2(human epididymis secretory protein)基因。该基因的mRNA剪接形式之一HEbetal编码一个含有同样的半胱氨酸基元(consensus cysteine motif)的潜在的β-防御素成员。
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与hBD-1不同，hBD-2基因上含有多个核因子κB(NF-κB)结合位点。NF-κB是TNF的作用元件，能够整合损伤或微生物侵袭时宿主固有的和获得性的免疫信号途径，参与LPS和前炎症细胞因子等引起的转录水平的宿主反应。hBD-1基因中缺乏类似的NF-κB元件，这或许可以解释为什么LPS和TNF不能诱导hBD-1表达。
1.2蛋白结构 人β-防御素hBD-1、hBD-2和hBD-3分别为36个氨基酸、65个氨基酸和45个氨基酸的短肽，其分子中都带有较多的正电荷，空间结构上分为疏水区和带电区；肽链折叠形成三束β-片结构。由6个半胱氨酸残基形成三个二硫键稳定其结构，分子中均富含精氨酸。其保守的6个半胱酸形成的三个链内二硫键的连接方式为：Cys-2与Cys-4、Cys-1与Cys-5和Cys-3与Cys-6相配对连接。此外，其分子中还有4个保守的残基，即甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和赖氨酸。
2、生物学活性
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2.1抗微生物活性及其作用机制 β-防御素具有广谱的抗菌活性。在体外，hBD-1在毫摩尔浓度下对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、螺旋体、分析杆菌及有包膜病毒均具有杀灭作用。hBD-2对革兰阴性菌有高效的杀菌作用，在约10μg·ml-1的浓度下就可以达到90%的杀菌效果(LD90)；对酵母也有有效的杀伤作用，LD90为μg·ml-1；而对革兰阳性hBD-2的浓度要达到100μg·ml-1时才有抑菌作用。故hBD-2对革兰阴性菌的杀伤作用强于对革兰阳性菌的作用。hBD-3与hBD-1和hBD-2一样具有抗菌活性，尤其对革兰阳性菌具有强裂杀伤作用。微克级水平的hBD-3对金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌等革兰阳性致病菌，革兰阴性的绿杆菌和大肠杆菌以及酵母都具有强烈的杀伤作用，并且对多药抗药性的金黄色葡萄球菌和抗万石霉素的粪肠球菌也可在较低浓度下发挥杀伤作用。
β-防御素的直接杀菌作用是由于β-防御素分子呈阳性，带正电荷，能够与带负电荷，呈阴性的细菌表面结合，结合后其分子中的疏水区可插入到细菌的胞膜，而其带电区(带正点荷)则与细菌胞膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用。在细胞膜上多个β-防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情况下处于胞外的离子、多肽等流入胞内，而胞内重要的盐类、大分子等泄漏到胞外，最终导致不可逆性的菌体死亡。β-防御素在细胞膜上的通道形成过程与膜的磷脂组成成分和所处的温度环境等因素有关。然而，一旦β-防御素在膜上行成了通道，上述因素便不会对其通道的活动构成本质的影响。另外，由于大多数真菌、支原体、螺旋体等致病微生物的胞膜也和细菌一样带负电荷，所以也是β-防御素的攻击的对象。β-防御素也可以通过产生单链断裂而诱导DNA损伤。高等动物的细胞则由于细胞膜中负电荷含量较低而免于受到攻击。
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对hBD-2处理过的细菌菌体进行X光衍观察，其研究结果支持以上作用机制。扫描电镜观察发现，hBD-3也可在细菌胞壁形成孔道，但其确切的机制是否与hBD-2相同尚不清楚。
内源性抗微生物活性肽作为机体上皮组织抵御环境中微生物侵袭的第一道化学屏障，其动员比特异性抗体或细胞介导的免疫反应更加简单而快速。外来信号诱导其合成不需要细胞的增殖和分化，在几小时内人就能起作用，可在感染后短期内阻遏、延缓微生物的生长，或完全消除其感染，因此在机体的固有免疫(innate immunity)防御中发挥着重要作用。
2.2免疫活性及作用机制 与α-防御素一样，β-防御素还具有间接的免疫激活作用。树突状细胞和T细胞是参与机体获得性免疫反应的得要细胞成分。研究表明，在较低的分子浓度下(在体外，最理想的浓度是1000ng·ml-1)，hBD-2能够与这些细胞表面特异性的趋化因子受体(chemokine C-C motif receptor six)相结合，趋化这些细胞朝着受致病微生物侵袭的或粘膜病灶部位迁移，从而提高机体抗微生物感染的获得性免疫反应水平。其诱导的趋化性对百日咳毒素敏感，说明β-防御素可能有一个或多个具有七次跨膜结构域的受体，或者是受体偶联着Giα蛋白。其诱导趋化作用也能被CCR6抗体阻断。Becker等对LPS诱导hBD2表达，启动机体固有免疫的信号途径进行了研究，发现LPS需要一种CD14依赖途径启动人支气管上皮(hTBE)细胞合成和分泌hBD2，并最终激活NF-κB。由此可见，β-防御素在机体抗微生物入侵的固有性免疫和获得性免疫中均具有重要作用。
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除此之外，一些防御素还可以封闭促肾上腺皮质激素的受体，并且在急性感染时能够阻断具有免疫抑制作用的肾上腺类固醇激素的产生。防御素人为信号分子的功能也许可以解释其在浓度很低而不能直接杀死致病微生物产生的生物学效应。
3、组织分布和表达调控
hBD-1最初是在人的血液滤液中发现的，随后的研究表明，hBD-1在肾小管、胰腺、肺、乳腺、腮腺、眼前房、鼻粘膜以及其他一些组织的上皮细胞中连续性表达。最近的研究报道发现人中枢神经系统的星形细胞、小胶质细胞和脑膜成纤维细胞中也有hBD-1表达，推测其在中枢神经系统对微生物感染的宿主防御中发挥作用。hBD-2主要在感染刺激后的皮肤和粘膜组织中表达。Abiko等采用免疫组化和原位杂交的方法研究了hBD-2在人口腔粘膜上皮组织中的表达，发现hBD-2蛋白在过角经上皮中的表达水平显著高于在正澥化和非角化上皮中的表达；而mRNA水平却是在非角化上皮中的表达高于弱角化或正角化上皮。除正常组织外，hBD-2在肿瘤组织如口腔鳞状细胞癌，肿瘤细胞系如MKN45胃粘膜细胞和口腔鳞状细胞癌Ca-9、SCC-9、HSC-4等细胞中也有表达。hBD-3主要由上皮细胞和内皮细胞产生。正常情况下在皮肤和扁桃体中分布最多，而在呼吸道、消化道和泌尿生殖道分布较少。
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β-防御素的表达水平除了受炎性细胞因子调节外，还受作用环境的盐浓度和离子种类的影响。通常情况下，以10mmol·L-1的磷酸盐缓冲液为最佳；过高的盐浓度(如100mmol·L-1以上PBS)会导致防御素活性水平急剧下降。另外，一价离子对防御素活性影响较小，二价离子(如钙、镁离子)则可显著降低防御素的活性。最新的研究还发现，激素(地塞米松)能够抑制hBD-3的表达，但不影响hBD-1和hBD-2的表达。这一结果或许可以部分地对大量使用激素容易引起感染提供解释。
4、应用前景
4.1代抗生素解决细菌耐药问题 细菌对传统抗生素的耐药性是当今临床医学中的全球性难题，发展新的抗感染战略势在必行。基于β-防御素的杀菌作用，可将其作为“超级”抗生素，发挥其广谱、强效的抗多种微生物感染的作用。同时，在应用上，不同的β-防御素应各取所长，协同使用，如hBD-2主要针对革兰阴性菌，而hBD-3则主要针对革兰阳性菌。
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由于β-防御素蛋白分子较小，且分子中含有3对二硫键，给基因工程表达带来了一定困难。不过，令人惊喜的是对hBD-3的表达却获得了意外的成功，融合表达的hBD-3从融合形式中酶解下来后再经过进一步的纯化，其生物学活性可达到与从组织中分离纯化到的天然蛋白一致的水平。此外，小分子的β-防御素也可通过人工合成的方法而获得。
4.2结合转基因技术赋予细胞自身抗感染能力 组织工程技术已成为近年组织和器官移植解决供体问题的重要手段，转基因等细胞修饰和改造技术则赋予组织工程组织和器官以全新的特质。采用转基因技术获得高表达β-防御素基因的人表皮细胞或成纤维细胞将对提高组织工程皮肤的抗感染能力做出贡献。
最新报道表明，hBD-2转染的人巨噬细胞获得了对结核分支杆菌的杀伤能力，成为β-防御素转基因治疗最早的尝试。
4.3用于调动机体获得性免疫 树突状细胞和记忆T细胞在机体的获得性免疫中具重要作用。要体内，β-防御素可通过与CCR6的相互作用来募集未成熟的树突状细胞和记忆T细胞到达有微生物入侵的皮肤和粘膜部位。因此，我们可以利用β-防御素在固有免疫和获得性免疫中的双重作用来辅助传统抗生素预防和治疗微生物感染。
4.4指导抗微生物短肽类药物的设计和开发 β-防御素由于分子小并具有稳定的分子结构等优点，为当今研制多肽类新药提供了理想的分子设计骨架和模板。, 百拇医药
关键词：β-防御素；结构；功能；组织分布；应用前景
摘要：产生抗微生物肽(antimicrobial peptide)是真核生物宿主防御的一个重要途径。防御素(defensins)是重要的一类抗微生物肽，包括四个亚家族，即植物防御素、昆虫防御素、α-防御素和β-防御素。其中β-防御素主要分布在脊椎动物的皮肤、粘膜等上皮组织，构成机体抵御微生物侵袭的第一道化学屏障，在组织烧伤等创伤感染中发挥重要作用。本文主要对β-防御素的结构、功能、分布和作为抗生素肽的应用前景进行综述。
因感染而造成的烧伤病人死亡率一直居高不下，因此寻找新型的、无细菌耐药性的抗生素极其重要。近年研究发现，真核生物能够产生大量的抗微生物肽或蛋白，广泛参与抑制和杀灭外源致病微生物的侵袭，构成机体宿主防御的一个重要途径。因其为机体内的天然蛋白，无耐药性这虞，故有希望开发为新型的抗生素，解决临床上因传统抗生素耐药而出现的尴尬局面。本文讨论的主要是小分子的抗微生物肽(一般小于100个氨基酸)，这些内源性的短肽分子能够破坏微生物细胞膜的结构和功能。人体内的防御素可分为α和β两种。两者分子结构相似，基因位于同一基因簇中，具有共同的进化起源。α-防御素主要由哺乳动物中性粒细胞和小肠Paneth细胞产生，也见于雌性动物的生殖上皮。α-防御素对革兰阳性菌、阴性菌、真菌、螺旋菌、分支杆菌、原生动物和包膜病毒具有广谱的杀伤作用。β-防御素由哺乳动物上皮细胞产生，分布在机体宿主-环境的界面位置，构成机体抵御外界微生物侵袭的第一道化学屏障。
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1、β-防御素的结构
1.1基因定位 目前已恨现的人类β-防御素(humanbeta-defensin,hBD)有3种，即hBD-1，hBD-2和hBD-3。与其他防御素家族成员一样，其基因均定位于人第第8号染色体上8P22～8P23区间<1Mb的范围内。各种防御素基因在染色体上最可能的排列顺序为：着丝粒hBD-2BD1-hNP1-端粒。由于hBD-2基因与其他基因之间的距离比其他基因之间典型的距离要长很多，所以怀疑hBD-2附近还存在新的防御素基因。Jia等分析了人第8号染色体8P22～8P23区间的基因组序列，发现了一个新的β-防御素成员——hBD-3。该基因位于hBD-2上游13kb的位置，并与hBD-2具有一致的转录方向。cDNA克隆及编码氨基酸序列分析表明其与Harder等新近从人牛皮癣病灶皮肤和上皮细胞培养上清中分离到的hBD-3相一致。进一步的分析发现，在hBD-3上游13kb处还有HE2(human epididymis secretory protein)基因。该基因的mRNA剪接形式之一HEbetal编码一个含有同样的半胱氨酸基元(consensus cysteine motif)的潜在的β-防御素成员。
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与hBD-1不同，hBD-2基因上含有多个核因子κB(NF-κB)结合位点。NF-κB是TNF的作用元件，能够整合损伤或微生物侵袭时宿主固有的和获得性的免疫信号途径，参与LPS和前炎症细胞因子等引起的转录水平的宿主反应。hBD-1基因中缺乏类似的NF-κB元件，这或许可以解释为什么LPS和TNF不能诱导hBD-1表达。
1.2蛋白结构 人β-防御素hBD-1、hBD-2和hBD-3分别为36个氨基酸、65个氨基酸和45个氨基酸的短肽，其分子中都带有较多的正电荷，空间结构上分为疏水区和带电区；肽链折叠形成三束β-片结构。由6个半胱氨酸残基形成三个二硫键稳定其结构，分子中均富含精氨酸。其保守的6个半胱酸形成的三个链内二硫键的连接方式为：Cys-2与Cys-4、Cys-1与Cys-5和Cys-3与Cys-6相配对连接。此外，其分子中还有4个保守的残基，即甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和赖氨酸。
2、生物学活性
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2.1抗微生物活性及其作用机制 β-防御素具有广谱的抗菌活性。在体外，hBD-1在毫摩尔浓度下对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、螺旋体、分析杆菌及有包膜病毒均具有杀灭作用。hBD-2对革兰阴性菌有高效的杀菌作用，在约10μg·ml-1的浓度下就可以达到90%的杀菌效果(LD90)；对酵母也有有效的杀伤作用，LD90为μg·ml-1；而对革兰阳性hBD-2的浓度要达到100μg·ml-1时才有抑菌作用。故hBD-2对革兰阴性菌的杀伤作用强于对革兰阳性菌的作用。hBD-3与hBD-1和hBD-2一样具有抗菌活性，尤其对革兰阳性菌具有强裂杀伤作用。微克级水平的hBD-3对金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌等革兰阳性致病菌，革兰阴性的绿杆菌和大肠杆菌以及酵母都具有强烈的杀伤作用，并且对多药抗药性的金黄色葡萄球菌和抗万石霉素的粪肠球菌也可在较低浓度下发挥杀伤作用。
β-防御素的直接杀菌作用是由于β-防御素分子呈阳性，带正电荷，能够与带负电荷，呈阴性的细菌表面结合，结合后其分子中的疏水区可插入到细菌的胞膜，而其带电区(带正点荷)则与细菌胞膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用。在细胞膜上多个β-防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情况下处于胞外的离子、多肽等流入胞内，而胞内重要的盐类、大分子等泄漏到胞外，最终导致不可逆性的菌体死亡。β-防御素在细胞膜上的通道形成过程与膜的磷脂组成成分和所处的温度环境等因素有关。然而，一旦β-防御素在膜上行成了通道，上述因素便不会对其通道的活动构成本质的影响。另外，由于大多数真菌、支原体、螺旋体等致病微生物的胞膜也和细菌一样带负电荷，所以也是β-防御素的攻击的对象。β-防御素也可以通过产生单链断裂而诱导DNA损伤。高等动物的细胞则由于细胞膜中负电荷含量较低而免于受到攻击。
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对hBD-2处理过的细菌菌体进行X光衍观察，其研究结果支持以上作用机制。扫描电镜观察发现，hBD-3也可在细菌胞壁形成孔道，但其确切的机制是否与hBD-2相同尚不清楚。
内源性抗微生物活性肽作为机体上皮组织抵御环境中微生物侵袭的第一道化学屏障，其动员比特异性抗体或细胞介导的免疫反应更加简单而快速。外来信号诱导其合成不需要细胞的增殖和分化，在几小时内人就能起作用，可在感染后短期内阻遏、延缓微生物的生长，或完全消除其感染，因此在机体的固有免疫(innate immunity)防御中发挥着重要作用。
2.2免疫活性及作用机制 与α-防御素一样，β-防御素还具有间接的免疫激活作用。树突状细胞和T细胞是参与机体获得性免疫反应的得要细胞成分。研究表明，在较低的分子浓度下(在体外，最理想的浓度是1000ng·ml-1)，hBD-2能够与这些细胞表面特异性的趋化因子受体(chemokine C-C motif receptor six)相结合，趋化这些细胞朝着受致病微生物侵袭的或粘膜病灶部位迁移，从而提高机体抗微生物感染的获得性免疫反应水平。其诱导的趋化性对百日咳毒素敏感，说明β-防御素可能有一个或多个具有七次跨膜结构域的受体，或者是受体偶联着Giα蛋白。其诱导趋化作用也能被CCR6抗体阻断。Becker等对LPS诱导hBD2表达，启动机体固有免疫的信号途径进行了研究，发现LPS需要一种CD14依赖途径启动人支气管上皮(hTBE)细胞合成和分泌hBD2，并最终激活NF-κB。由此可见，β-防御素在机体抗微生物入侵的固有性免疫和获得性免疫中均具有重要作用。
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除此之外，一些防御素还可以封闭促肾上腺皮质激素的受体，并且在急性感染时能够阻断具有免疫抑制作用的肾上腺类固醇激素的产生。防御素人为信号分子的功能也许可以解释其在浓度很低而不能直接杀死致病微生物产生的生物学效应。
3、组织分布和表达调控
hBD-1最初是在人的血液滤液中发现的，随后的研究表明，hBD-1在肾小管、胰腺、肺、乳腺、腮腺、眼前房、鼻粘膜以及其他一些组织的上皮细胞中连续性表达。最近的研究报道发现人中枢神经系统的星形细胞、小胶质细胞和脑膜成纤维细胞中也有hBD-1表达，推测其在中枢神经系统对微生物感染的宿主防御中发挥作用。hBD-2主要在感染刺激后的皮肤和粘膜组织中表达。Abiko等采用免疫组化和原位杂交的方法研究了hBD-2在人口腔粘膜上皮组织中的表达，发现hBD-2蛋白在过角经上皮中的表达水平显著高于在正澥化和非角化上皮中的表达；而mRNA水平却是在非角化上皮中的表达高于弱角化或正角化上皮。除正常组织外，hBD-2在肿瘤组织如口腔鳞状细胞癌，肿瘤细胞系如MKN45胃粘膜细胞和口腔鳞状细胞癌Ca-9、SCC-9、HSC-4等细胞中也有表达。hBD-3主要由上皮细胞和内皮细胞产生。正常情况下在皮肤和扁桃体中分布最多，而在呼吸道、消化道和泌尿生殖道分布较少。
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β-防御素的表达水平除了受炎性细胞因子调节外，还受作用环境的盐浓度和离子种类的影响。通常情况下，以10mmol·L-1的磷酸盐缓冲液为最佳；过高的盐浓度(如100mmol·L-1以上PBS)会导致防御素活性水平急剧下降。另外，一价离子对防御素活性影响较小，二价离子(如钙、镁离子)则可显著降低防御素的活性。最新的研究还发现，激素(地塞米松)能够抑制hBD-3的表达，但不影响hBD-1和hBD-2的表达。这一结果或许可以部分地对大量使用激素容易引起感染提供解释。
4、应用前景
4.1代抗生素解决细菌耐药问题 细菌对传统抗生素的耐药性是当今临床医学中的全球性难题，发展新的抗感染战略势在必行。基于β-防御素的杀菌作用，可将其作为“超级”抗生素，发挥其广谱、强效的抗多种微生物感染的作用。同时，在应用上，不同的β-防御素应各取所长，协同使用，如hBD-2主要针对革兰阴性菌，而hBD-3则主要针对革兰阳性菌。
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由于β-防御素蛋白分子较小，且分子中含有3对二硫键，给基因工程表达带来了一定困难。不过，令人惊喜的是对hBD-3的表达却获得了意外的成功，融合表达的hBD-3从融合形式中酶解下来后再经过进一步的纯化，其生物学活性可达到与从组织中分离纯化到的天然蛋白一致的水平。此外，小分子的β-防御素也可通过人工合成的方法而获得。
4.2结合转基因技术赋予细胞自身抗感染能力 组织工程技术已成为近年组织和器官移植解决供体问题的重要手段，转基因等细胞修饰和改造技术则赋予组织工程组织和器官以全新的特质。采用转基因技术获得高表达β-防御素基因的人表皮细胞或成纤维细胞将对提高组织工程皮肤的抗感染能力做出贡献。
最新报道表明，hBD-2转染的人巨噬细胞获得了对结核分支杆菌的杀伤能力，成为β-防御素转基因治疗最早的尝试。
4.3用于调动机体获得性免疫 树突状细胞和记忆T细胞在机体的获得性免疫中具重要作用。要体内，β-防御素可通过与CCR6的相互作用来募集未成熟的树突状细胞和记忆T细胞到达有微生物入侵的皮肤和粘膜部位。因此，我们可以利用β-防御素在固有免疫和获得性免疫中的双重作用来辅助传统抗生素预防和治疗微生物感染。
4.4指导抗微生物短肽类药物的设计和开发 β-防御素由于分子小并具有稳定的分子结构等优点，为当今研制多肽类新药提供了理想的分子设计骨架和模板。, 百拇医药