乙酰胆碱对豚鼠心房肌和心室肌的动作电位和收缩力的不同作用
1西安交通大学医学院心血管生理药理研究室；西安 710061；2第四军医大学生理学教研室；西安 710032 方萍1；臧伟进1*；于晓江1；孙 强1；臧益民2；吕军1
关键词：乙酰胆碱；心房肌；心室肌；动作电位；收缩力
摘要：实验采用标准玻璃微电极细胞内记录技术记录心肌细胞动作电位(action potential, AP)、 肌力换能器记录心肌收缩力(force contraction, Fc), 研究乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)对离体豚鼠心房肌、 心室肌的作用。结果表明, 10 μmol/L ACh可缩短心房肌、 心室肌动作电位的时程(action potential duration, APD)。 心房肌APD在给药前后分别为208.57±36.05 ms及101.78±14.41 ms (n=6, P<0.01), 心室肌APD在给药前后分别为286.73±36.11 ms及265.16±30.06 ms (n=6, P<0.01)。 心房肌动作电位的幅度 (action potential amplitude, APA)也降低, 给药前后分别为88.00±9.35 mV及62.62±20.50 mV (n=6, P<0.01), 而心室肌APA无明显变化。ACh还降低心房肌、 心室肌的收缩力, 心房肌、 心室肌Fc的抑制率分别为100% (n=6, P<0.01)和37.57±2.58% (n=6, P<0.01)。ACh对心房肌、 心室肌APD和Fc的抑制作用在一定范围内(1 nmol/L~100 μmol/L)随ACh浓度的增高而增强。用Scott法求出ACh对心房肌、 心室肌APD缩短作用的KD值, 分别为0.275和0.575 μmol/L, 对Fc抑制作用的KD值分别为0.135和0.676 μmol/L。各浓度下ACh对心房肌效应与心室肌效应作组间t检验, 从10 nmol/L到0.1 mmol/L均有显著的统计学差异。此外, 10 μmol/L阿托品及20 mmol/L CsCl可阻断10 μmol/L ACh对心室肌APD的缩短作用, 而0.1 mmol/L CdCl2对ACh所致心室肌APD的缩短作用影响不大。上述结果提示, ACh对心房肌、 心室肌APD及Fc均有不同程度的直接抑制作用, 并随所用ACh浓度的增大而增大, 心房肌对ACh的反应较心室肌更为敏感。ACh对心室肌APD的缩短作用与毒蕈碱型胆碱受体(muscarinic receptor, MR)及K+电流关系较为密切, 而与Ca2+电流可能关系不大。
, 百拇医药
自主神经在心脏活动的调节中起重要作用, 交感和副交感神经对心脏的作用存在部位差异性。交感神经支配心脏的各个部分, 而副交感神经主要支配除心室外的其余部分[1]。已知ACh是副交感神经末梢释放的神经递质, 它对心脏的作用可分为直接作用及间接作用两种。前者通过降低已被交感胺激活的腺苷酸环化酶 (AC)的活性, 进而降低环磷酸腺苷 (cAMP)含量实现的, 可见于心脏各个部位; 后者通过直接激活毒蕈碱型钾通道 (K(ACh)通道)实现, 主要见于除心室外的其余部分。上述两种作用均由毒蕈碱型胆碱受体 (muscarinic receptor, MR)及鸟苷酸调节蛋白 (G蛋白)介导。但随着免疫学以及分子生物学的发展, 有人发现心室上可能有副交感神经及MR分布, 尽管其含量明显少于心房[2, 3]。 本研究采用标准玻璃微电极及肌力换能器分别从组织细胞水平观察ACh对离体豚鼠心室肌有无直接作用及作用机制, 并与心房肌进行对比, 为进一步阐明自主神经对心脏活动的调节机制提供理论依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
豚鼠 (雌雄不拘, 200~250g)。击昏后取出心脏, 置于充氧加温的改良台氏液中。心脏可自行跳动, 利于排出心腔内残血。
改良台氏液成分 ( mmol/L): NaCl 147.00、 KCl 5.40、 MgCl2·6H2O 1.05、 Tris 10.00、 CaCl2 1.80、 glucose 11.10 (用HCl及NaOH调pH值至7.40±0.05), 实验当日新鲜配置, 仅供当日使用。
小心切取心耳及心室乳头肌并固定于灌流槽中, 用100%氧饱和的改良台氏液恒温 (36±0.5℃)恒速 (10 ml/min)灌流, 台氏液pH值保持在7.2~7.4之间。稳定标本1 h, 待心肌电生理特性恢复后进行实验。
以波宽2 ms、 1.5倍阈强度的刺激电压驱动标本, 以内充3 mol/L KCl的玻璃微电极 (阻抗10~30 MΩ)通过微电极放大器 (MEZ-8201, 日本光电)记录心肌细胞动作电位 (AP), 并通过肌力换能器记录心肌收缩力 (Fc), 结果分别进入微机医学信号处理系统 (RM-6281, 由第四军医大学及成都仪器厂联合研制)及LMS-2A型二道生理记录仪。
, 百拇医药
数据以mean±SD表示, 统计学方法采用配对及组间t检验, 取P<0.05为有统计学意义。用Scott法做量效曲线回归直线Y=a+bX,并求半数最大效应浓度 (KD)值。
2 结果
2.1 ACh对心房肌、 心室肌AP的直接作用
标本稳定1 h后, 在频率为1 Hz的刺激下引出心房肌AP。记录给药前正常对照, 加入10 μmol/L ACh。可见标本兴奋性降低, 所需刺激强度逐渐增加, AP各参数明显缩短, 其中动作电位时程 (action potential duration, APD)在给药前后分别为208.57±36.05 及101.78±14.41 ms (n=6, P<0.01)。同时心房肌动作电位幅度 (action potential amplitude, APA)也明显降低, 给药前后分别为88.00±9.35 及62.62±20.50 mV (n=6, P<0.01) 。洗去ACh后10 min, 心房肌AP各参数恢复至给药前水平。心室肌AP记录方法同心房肌。心室肌AP同心房肌的相比, 平台期显著, APD较宽。相同浓度ACh使心室肌标本兴奋性降低, 所需刺激强度逐渐增加。APD各参数缩短, 其中APD给药前后分别为286.73±36.11 及265.16±30.06 ms (n=6, P<0.01), 而APA变化不明显 。洗去ACh后20 min, 心室肌AP各参数恢复至给药前水平。
, http://www.100md.com
2.2 ACh对心房肌、 心室肌Fc的直接作用
实验前先用1 g砝码定标, 换算出收缩幅度为10 mm时Fc为5 mN。在频率为1 Hz的刺激下引导并记录心房肌Fc。可见10 μmol/L ACh使心房肌收缩幅度立即减低, 约10 s后, 收缩曲线呈一条直线, Fc的抑制率为100% (n=6, P<0.01)。在ACh继续存在的情况下, ACh的作用逐渐减弱, Fc降至最低后又逐渐增大, 即发生了所谓的“脱敏”现象。快速洗去ACh后心房肌Fc继续增大, 甚至超过给药前水平, 即发生了所谓的“反跳”现象, 随后又逐渐恢复至给药前水平 。心室肌Fc记录方法同心房肌。10 μmol/L ACh可使心室肌收缩幅度逐渐减低, 约15 s后, 收缩幅度降至最低, 此时Fc抑制率为37.57±2.58% (n=6, P<0.01)。同心房肌一样, ACh对心室肌Fc的作用也出现了“脱敏”及“反跳”现象 。
2.3 ACh对心房肌、 心室肌AP及Fc直接作用的浓度效应关系
, 百拇医药
刺激频率为1 Hz。结果表明ACh对离体豚鼠心房肌APD的缩短作用 (n=33)及负性肌力 (n=38)作用均随ACh浓度的增大而增强。图3A、 B中的空心圆点曲线分别为以ACh浓度的对数值为横坐标和以APD及Fc出现最大反应的变化率为纵坐标所作的浓度-效应关系曲线。采用自身配对t检验统计, 结果表明, ACh对心房肌的最低作用浓度约为1 nmol/L, 用Scott法将曲线直线化后求得ACh对二指标的KD值分别为 0.275 和 0.135 μmol/L。 ACh 对离体豚鼠心室肌APD的缩短作用 (n=36)及负性变力作用 (n=36)也随ACh浓度的增大而增强 。但与心房肌不同的是ACh对心室肌APD的缩短作用及负性变力作用较弱。自身配对t检验统计表明ACh对心室肌的最低作用浓度约为10 nmol/L, 同样用Scott法求得ACh对心室肌APD及Fc作用的KD值分别为0.575和0.676 μmol/L。采用组间t检验将各浓度下ACh对心房肌的效应与心室肌效应对比, 从10 nmol/L到0.1 mmol/L均有显著的统计学差异 (P<0.01), 可见心房肌对ACh的敏感性大于心室肌。
, 百拇医药
2.4 ACh对心室肌APD缩短作用的机制
2.4.1 阿托品对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 10 μmol/L ACh使心室肌APD由296.72±33.79 缩短至275.18±28.87 ms (n=6, P<0.01), 而APA变化不明显。此时再加入10 μmol/L阿托品, 可见AP逐渐恢复, APD由275.18±28.87 变宽至302.40±35.22 ms (n=6, 与ACh组比P<0.01) (表2)。已知阿托品是M受体的非选择性竞争性阻断剂, 单独使用对心室肌细胞AP几乎无作用, 可见该药阻断了等摩尔浓度ACh对心室肌AP的直接作用 (图4A)。
2.4.2 CsCl对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 加入ACh前, 在台氏液中事先加入20 mmol/L CsCl, 可见心室肌APD由282.42±15.43增宽至302.70±24.07 ms (n=6, P<0.01)。此时再加入10 μmol/L ACh, 可见APD各参数变化不明显, 加入ACh前后的APD分别为302.70±24.07及298.64±25.01 ms (n=6, 与CsCl组比P>0.05) (图4B, 表3)。
, 百拇医药
2.4.3 CdCl2对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 加入ACh前, 在台氏液中事先加入0.1 mmol/L CdCl2, 可见心室肌APD由278.40±23.54 缩短至216.18±54.88 ms (n=6, P<0.01), APA由90.54±9.35 降低至76.96±6.36 mV (n=6, P<0.01)。此时再加入10 μmol/L ACh, APD继续缩短, 由216.18±54.88 缩短至184.98±56.06 ms (n=6, 与CdCl2组比 P<0.01), 而加入ACh 前后APA分别为76.96±6.36及74.79±7.26 mV (n=6, 与CdCl2组比P>0.05)。
3 讨论
副交感神经递质ACh对心房肌具有直接抑制作用的观点已被证实, ACh与心房M受体结合后偶联G蛋白直接激活心房K(ACh)通道, 使复极期K+外流加速, APD缩短, 并且ACh可能通过影响心房Ca2+电流或Na+电流进而降低心房APA[4, 5], 但其具体机制目前仍不清楚。有关ACh对心室肌有无直接作用的观点仍存在很多争议。以往观点认为, 在心室肌没有被儿茶酚胺类物质激活时, ACh对其无直接作用。而我们的实验从AP、 Fc等方面证实了ACh对离体豚鼠心室肌有直接抑制作用。它可使标本兴奋性降低, APD缩短, Fc降低。这与Boyett等与Litovsky等在离体雪貂和狗心室肌上观察的结果一致[5, 6]。本研究表明, 阿托品可拮抗等摩尔浓度ACh对离体豚鼠心室肌AP的直接作用, 由此可推断ACh对心室肌AP的直接作用是M受体介导的。已知M受体是鸟苷酸调节蛋白 (G蛋白)偶联的受体家族成员之一, 因此推测ACh对心室肌的直接作用可能由G蛋白介导[7, 8]。已知CdCl2是钙通道的竞争性拮抗剂, 0.1 mmol/L CdCl2可从细胞外阻断Ca2+电流。在CdCl2存在的情况下, 10 μmol/L ACh仍可缩短心室肌APD, 此时APD的变化率与ACh单独作用的变化率相比无统计学差异 (n=6, P>0.05)。由此推测, ACh对心室肌APD的缩短作用与Ca2+电流可能关系不大[9]。本实验采用20 mmol/L CsCl从细胞外阻断K+电流, 此时10 μmol/L ACh不再使心室肌APD缩短, 此时APD的变化率与ACh单独作用时APD的变化率比有统计学差异 (n=6, P<0.01)。由此推测, ACh对心室肌APD的缩短作用与K+电流关系较为密切[10]。但参与心室肌AP复极过程的IK有多种, 如IK1、 IK(ACh)等, 而CsCl是非选择性的K+通道阻断剂, 因此, 本研究尚不能明确ACh究竟通过何种K+通道发挥作用。此外实验结果表明, ACh对离体豚鼠心房、心室肌APD及Fc的作用均随ACh浓度的增大而增大, 相同浓度ACh对心房肌APD及Fc的直接抑制作用明显大于心室肌。部分解剖学方法提示, 心室肌可能具有迷走神经分布, 但其分布密度少于心房肌[2]。受体学研究表明心脏的M受体主要分布于心房肌, 但新近的免疫学及分子生物学方法均表明心室也有少量M受体分布。并且已有研究在部分动物心室肌上发现了K(ACh)通道, 并证实该通道与心房肌K (ACh)单通道特性相同, 但其分布密度及对ACh的敏感性不同于心房肌[11]。因此我们推测, ACh对心室肌的直接抑制作用机制可能与心房肌相同, ACh对心房、 心室肌抑制作用的差异性可能是神经、 受体、 离子通道等多水平差异的综合体现。
, 百拇医药
实验还发现, 相同浓度ACh对心房、 心室肌APD及Fc的抑制程度不同。已知APD缩短可使Ca2+内流减少, 从而降低Fc, 但决定Fc大小的因素很多。以前的实验已证实ACh对心房、心室肌APD的抑制作用是由M受体介导的, 而目前认为心脏M受体经由三条信号转导途径来介导心脏肌力效应: (1) 抑制AC使cAMP降低; (2)开放K+通道; (3)水解磷酸肌醇 (phosphoinosilol, PI)。其中前两条途径介导负性肌力作用, 而后一条途径介导正性肌力作用[12]。因此ACh对心房、 心室肌的负性肌力作用可能不仅仅由APD的缩短来决定, 其具体机制尚需深入研究。
有关研究表明, “脱敏”及“反跳”现象在心房、 心室肌APD及Fc等多部位、 多指标均有发生, 是一个普遍存在的现象, 但其机制目前还不清楚。已有研究表明“脱敏”可发生于受体及受体后水平。受体水平的“脱敏”可能与受体的磷酸化或受体效应器脱偶联有关。受体后水平的“脱敏”可能与ACh激活的钾通道或与之相关的调节蛋白的磷酸化及去磷酸化有关。有个别研究推测“反跳”可能是“脱敏”的镜相反映, 其具体机制仍需深入研究[13, 14]。生理水平“脱敏”时出现的受体敏感性降低或急剧受体丧失具有保护细胞免受过度或过强刺激的作用, 对信号传播调节起重要作用。
, 百拇医药
参 考 文 献
[1] 陈 修, 陈维洲, 曾贵云. 心血管药理学. 北京: 人民卫生出版社, 1997,3.
[2]Cremers [KG*4]TIFH, [KG*4]Teisman ACH, Vangilst WH, Westerink BHC. Use of microdialysis for monitoring sympathetic and parasympathetic innervation of heart in conscious rats . Am J Physiol, 1997,273(6 Pt 2):H2850~H2856.
[3] Sharma VK, Colecraft HM, Rubin LE. Does mammalian heart contain only the M2 muscarinic receptor subtype. Life Sci, 1997,60(13-14):1023~1029.
, 百拇医药
[4] Zang WJ (臧伟进), Yu XJ (于晓江), Zang YM (臧益民). Effect of halothane on the muscarinic potassium current of the heart. Acta Physiolo Sini (生理学报), 2000,52:175~178 (Chinese, English abstract).
[5] Boyett MR, Kirby MS, Orchard CH, Roberts A. The negative inotropic effect of acetylcholine on ferret ventricular myocardium. J Physiol, 1988,404:613~615.
[6] Litovsky SH, Antzelevitch C. Differences in the electrophysiological response of canine ventricular subendocardium and subepicardium to acetylcholine and isoproterenol. A direct effect of acetylcholine in ventricular myocardium. Circ Res, 1990,67:615~627.
, http://www.100md.com
[7] Evikostenis, Zeng FY, Wess JG. Structure-function analysis of muscarinic receptors and their associated G proteins. Life Sci, 1999,64(6/7):355~362.
[8] Nadler LS, Rosoff ML, Hamilton SE. Molecular analysis of the regulation of muscarinic receptor expression and function. Life Sci, 1999,64:375~380.
[9] Kim D. Modulation of acetylcholine-activated K+ channel function in rat atrial cells by phosphorylation. J Physiol, 1991,437:133~155.
, http://www.100md.com
[10] Matsuda JJ, Lee HC, Shibata EF. Acetylcholine reversal of isoproterenol-stimulated sodium currents in rabbit ventricular myocytes. Circ Res, 1993,72 (3):517~525.
[11] Koumi SI, Wasserstrom JA. Acetylcholine-sensitive muscarinic K+ channels in mammalian ventricular myocytes . Am J Physiol, 1994,266:H1812~H1821.
[12] 金正均, 王永铭, 苏定冯. 药理学进展. 上海: 科学出版社, 1999,232~241.
[13] Shui ZG, Yamanushi TT, Boyett MR.Evidence of involvement of GIRK1/GIRK4 in long-term desensitization of cardiac muscarinic K+ channels.Am J Physiol, 2001,280(6):H2554~H2562.
[14] Zang WJ, Yu XJ, Honjo H, Boyett MR. On the role of G protein activation and phosphorylation in desensitization to acetylcholine in guinea-pig atrial cells. J Physiol, 1993,464:649~679., http://www.100md.com
关键词：乙酰胆碱；心房肌；心室肌；动作电位；收缩力
摘要：实验采用标准玻璃微电极细胞内记录技术记录心肌细胞动作电位(action potential, AP)、 肌力换能器记录心肌收缩力(force contraction, Fc), 研究乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)对离体豚鼠心房肌、 心室肌的作用。结果表明, 10 μmol/L ACh可缩短心房肌、 心室肌动作电位的时程(action potential duration, APD)。 心房肌APD在给药前后分别为208.57±36.05 ms及101.78±14.41 ms (n=6, P<0.01), 心室肌APD在给药前后分别为286.73±36.11 ms及265.16±30.06 ms (n=6, P<0.01)。 心房肌动作电位的幅度 (action potential amplitude, APA)也降低, 给药前后分别为88.00±9.35 mV及62.62±20.50 mV (n=6, P<0.01), 而心室肌APA无明显变化。ACh还降低心房肌、 心室肌的收缩力, 心房肌、 心室肌Fc的抑制率分别为100% (n=6, P<0.01)和37.57±2.58% (n=6, P<0.01)。ACh对心房肌、 心室肌APD和Fc的抑制作用在一定范围内(1 nmol/L~100 μmol/L)随ACh浓度的增高而增强。用Scott法求出ACh对心房肌、 心室肌APD缩短作用的KD值, 分别为0.275和0.575 μmol/L, 对Fc抑制作用的KD值分别为0.135和0.676 μmol/L。各浓度下ACh对心房肌效应与心室肌效应作组间t检验, 从10 nmol/L到0.1 mmol/L均有显著的统计学差异。此外, 10 μmol/L阿托品及20 mmol/L CsCl可阻断10 μmol/L ACh对心室肌APD的缩短作用, 而0.1 mmol/L CdCl2对ACh所致心室肌APD的缩短作用影响不大。上述结果提示, ACh对心房肌、 心室肌APD及Fc均有不同程度的直接抑制作用, 并随所用ACh浓度的增大而增大, 心房肌对ACh的反应较心室肌更为敏感。ACh对心室肌APD的缩短作用与毒蕈碱型胆碱受体(muscarinic receptor, MR)及K+电流关系较为密切, 而与Ca2+电流可能关系不大。
, 百拇医药
自主神经在心脏活动的调节中起重要作用, 交感和副交感神经对心脏的作用存在部位差异性。交感神经支配心脏的各个部分, 而副交感神经主要支配除心室外的其余部分[1]。已知ACh是副交感神经末梢释放的神经递质, 它对心脏的作用可分为直接作用及间接作用两种。前者通过降低已被交感胺激活的腺苷酸环化酶 (AC)的活性, 进而降低环磷酸腺苷 (cAMP)含量实现的, 可见于心脏各个部位; 后者通过直接激活毒蕈碱型钾通道 (K(ACh)通道)实现, 主要见于除心室外的其余部分。上述两种作用均由毒蕈碱型胆碱受体 (muscarinic receptor, MR)及鸟苷酸调节蛋白 (G蛋白)介导。但随着免疫学以及分子生物学的发展, 有人发现心室上可能有副交感神经及MR分布, 尽管其含量明显少于心房[2, 3]。 本研究采用标准玻璃微电极及肌力换能器分别从组织细胞水平观察ACh对离体豚鼠心室肌有无直接作用及作用机制, 并与心房肌进行对比, 为进一步阐明自主神经对心脏活动的调节机制提供理论依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
豚鼠 (雌雄不拘, 200~250g)。击昏后取出心脏, 置于充氧加温的改良台氏液中。心脏可自行跳动, 利于排出心腔内残血。
改良台氏液成分 ( mmol/L): NaCl 147.00、 KCl 5.40、 MgCl2·6H2O 1.05、 Tris 10.00、 CaCl2 1.80、 glucose 11.10 (用HCl及NaOH调pH值至7.40±0.05), 实验当日新鲜配置, 仅供当日使用。
小心切取心耳及心室乳头肌并固定于灌流槽中, 用100%氧饱和的改良台氏液恒温 (36±0.5℃)恒速 (10 ml/min)灌流, 台氏液pH值保持在7.2~7.4之间。稳定标本1 h, 待心肌电生理特性恢复后进行实验。
以波宽2 ms、 1.5倍阈强度的刺激电压驱动标本, 以内充3 mol/L KCl的玻璃微电极 (阻抗10~30 MΩ)通过微电极放大器 (MEZ-8201, 日本光电)记录心肌细胞动作电位 (AP), 并通过肌力换能器记录心肌收缩力 (Fc), 结果分别进入微机医学信号处理系统 (RM-6281, 由第四军医大学及成都仪器厂联合研制)及LMS-2A型二道生理记录仪。
, 百拇医药
数据以mean±SD表示, 统计学方法采用配对及组间t检验, 取P<0.05为有统计学意义。用Scott法做量效曲线回归直线Y=a+bX,并求半数最大效应浓度 (KD)值。
2 结果
2.1 ACh对心房肌、 心室肌AP的直接作用
标本稳定1 h后, 在频率为1 Hz的刺激下引出心房肌AP。记录给药前正常对照, 加入10 μmol/L ACh。可见标本兴奋性降低, 所需刺激强度逐渐增加, AP各参数明显缩短, 其中动作电位时程 (action potential duration, APD)在给药前后分别为208.57±36.05 及101.78±14.41 ms (n=6, P<0.01)。同时心房肌动作电位幅度 (action potential amplitude, APA)也明显降低, 给药前后分别为88.00±9.35 及62.62±20.50 mV (n=6, P<0.01) 。洗去ACh后10 min, 心房肌AP各参数恢复至给药前水平。心室肌AP记录方法同心房肌。心室肌AP同心房肌的相比, 平台期显著, APD较宽。相同浓度ACh使心室肌标本兴奋性降低, 所需刺激强度逐渐增加。APD各参数缩短, 其中APD给药前后分别为286.73±36.11 及265.16±30.06 ms (n=6, P<0.01), 而APA变化不明显 。洗去ACh后20 min, 心室肌AP各参数恢复至给药前水平。
, http://www.100md.com
2.2 ACh对心房肌、 心室肌Fc的直接作用
实验前先用1 g砝码定标, 换算出收缩幅度为10 mm时Fc为5 mN。在频率为1 Hz的刺激下引导并记录心房肌Fc。可见10 μmol/L ACh使心房肌收缩幅度立即减低, 约10 s后, 收缩曲线呈一条直线, Fc的抑制率为100% (n=6, P<0.01)。在ACh继续存在的情况下, ACh的作用逐渐减弱, Fc降至最低后又逐渐增大, 即发生了所谓的“脱敏”现象。快速洗去ACh后心房肌Fc继续增大, 甚至超过给药前水平, 即发生了所谓的“反跳”现象, 随后又逐渐恢复至给药前水平 。心室肌Fc记录方法同心房肌。10 μmol/L ACh可使心室肌收缩幅度逐渐减低, 约15 s后, 收缩幅度降至最低, 此时Fc抑制率为37.57±2.58% (n=6, P<0.01)。同心房肌一样, ACh对心室肌Fc的作用也出现了“脱敏”及“反跳”现象 。
2.3 ACh对心房肌、 心室肌AP及Fc直接作用的浓度效应关系
, 百拇医药
刺激频率为1 Hz。结果表明ACh对离体豚鼠心房肌APD的缩短作用 (n=33)及负性肌力 (n=38)作用均随ACh浓度的增大而增强。图3A、 B中的空心圆点曲线分别为以ACh浓度的对数值为横坐标和以APD及Fc出现最大反应的变化率为纵坐标所作的浓度-效应关系曲线。采用自身配对t检验统计, 结果表明, ACh对心房肌的最低作用浓度约为1 nmol/L, 用Scott法将曲线直线化后求得ACh对二指标的KD值分别为 0.275 和 0.135 μmol/L。 ACh 对离体豚鼠心室肌APD的缩短作用 (n=36)及负性变力作用 (n=36)也随ACh浓度的增大而增强 。但与心房肌不同的是ACh对心室肌APD的缩短作用及负性变力作用较弱。自身配对t检验统计表明ACh对心室肌的最低作用浓度约为10 nmol/L, 同样用Scott法求得ACh对心室肌APD及Fc作用的KD值分别为0.575和0.676 μmol/L。采用组间t检验将各浓度下ACh对心房肌的效应与心室肌效应对比, 从10 nmol/L到0.1 mmol/L均有显著的统计学差异 (P<0.01), 可见心房肌对ACh的敏感性大于心室肌。
, 百拇医药
2.4 ACh对心室肌APD缩短作用的机制
2.4.1 阿托品对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 10 μmol/L ACh使心室肌APD由296.72±33.79 缩短至275.18±28.87 ms (n=6, P<0.01), 而APA变化不明显。此时再加入10 μmol/L阿托品, 可见AP逐渐恢复, APD由275.18±28.87 变宽至302.40±35.22 ms (n=6, 与ACh组比P<0.01) (表2)。已知阿托品是M受体的非选择性竞争性阻断剂, 单独使用对心室肌细胞AP几乎无作用, 可见该药阻断了等摩尔浓度ACh对心室肌AP的直接作用 (图4A)。
2.4.2 CsCl对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 加入ACh前, 在台氏液中事先加入20 mmol/L CsCl, 可见心室肌APD由282.42±15.43增宽至302.70±24.07 ms (n=6, P<0.01)。此时再加入10 μmol/L ACh, 可见APD各参数变化不明显, 加入ACh前后的APD分别为302.70±24.07及298.64±25.01 ms (n=6, 与CsCl组比P>0.05) (图4B, 表3)。
, 百拇医药
2.4.3 CdCl2对ACh所致心室肌APD缩短作用的影响 加入ACh前, 在台氏液中事先加入0.1 mmol/L CdCl2, 可见心室肌APD由278.40±23.54 缩短至216.18±54.88 ms (n=6, P<0.01), APA由90.54±9.35 降低至76.96±6.36 mV (n=6, P<0.01)。此时再加入10 μmol/L ACh, APD继续缩短, 由216.18±54.88 缩短至184.98±56.06 ms (n=6, 与CdCl2组比 P<0.01), 而加入ACh 前后APA分别为76.96±6.36及74.79±7.26 mV (n=6, 与CdCl2组比P>0.05)。
3 讨论
副交感神经递质ACh对心房肌具有直接抑制作用的观点已被证实, ACh与心房M受体结合后偶联G蛋白直接激活心房K(ACh)通道, 使复极期K+外流加速, APD缩短, 并且ACh可能通过影响心房Ca2+电流或Na+电流进而降低心房APA[4, 5], 但其具体机制目前仍不清楚。有关ACh对心室肌有无直接作用的观点仍存在很多争议。以往观点认为, 在心室肌没有被儿茶酚胺类物质激活时, ACh对其无直接作用。而我们的实验从AP、 Fc等方面证实了ACh对离体豚鼠心室肌有直接抑制作用。它可使标本兴奋性降低, APD缩短, Fc降低。这与Boyett等与Litovsky等在离体雪貂和狗心室肌上观察的结果一致[5, 6]。本研究表明, 阿托品可拮抗等摩尔浓度ACh对离体豚鼠心室肌AP的直接作用, 由此可推断ACh对心室肌AP的直接作用是M受体介导的。已知M受体是鸟苷酸调节蛋白 (G蛋白)偶联的受体家族成员之一, 因此推测ACh对心室肌的直接作用可能由G蛋白介导[7, 8]。已知CdCl2是钙通道的竞争性拮抗剂, 0.1 mmol/L CdCl2可从细胞外阻断Ca2+电流。在CdCl2存在的情况下, 10 μmol/L ACh仍可缩短心室肌APD, 此时APD的变化率与ACh单独作用的变化率相比无统计学差异 (n=6, P>0.05)。由此推测, ACh对心室肌APD的缩短作用与Ca2+电流可能关系不大[9]。本实验采用20 mmol/L CsCl从细胞外阻断K+电流, 此时10 μmol/L ACh不再使心室肌APD缩短, 此时APD的变化率与ACh单独作用时APD的变化率比有统计学差异 (n=6, P<0.01)。由此推测, ACh对心室肌APD的缩短作用与K+电流关系较为密切[10]。但参与心室肌AP复极过程的IK有多种, 如IK1、 IK(ACh)等, 而CsCl是非选择性的K+通道阻断剂, 因此, 本研究尚不能明确ACh究竟通过何种K+通道发挥作用。此外实验结果表明, ACh对离体豚鼠心房、心室肌APD及Fc的作用均随ACh浓度的增大而增大, 相同浓度ACh对心房肌APD及Fc的直接抑制作用明显大于心室肌。部分解剖学方法提示, 心室肌可能具有迷走神经分布, 但其分布密度少于心房肌[2]。受体学研究表明心脏的M受体主要分布于心房肌, 但新近的免疫学及分子生物学方法均表明心室也有少量M受体分布。并且已有研究在部分动物心室肌上发现了K(ACh)通道, 并证实该通道与心房肌K (ACh)单通道特性相同, 但其分布密度及对ACh的敏感性不同于心房肌[11]。因此我们推测, ACh对心室肌的直接抑制作用机制可能与心房肌相同, ACh对心房、 心室肌抑制作用的差异性可能是神经、 受体、 离子通道等多水平差异的综合体现。
, 百拇医药
实验还发现, 相同浓度ACh对心房、 心室肌APD及Fc的抑制程度不同。已知APD缩短可使Ca2+内流减少, 从而降低Fc, 但决定Fc大小的因素很多。以前的实验已证实ACh对心房、心室肌APD的抑制作用是由M受体介导的, 而目前认为心脏M受体经由三条信号转导途径来介导心脏肌力效应: (1) 抑制AC使cAMP降低; (2)开放K+通道; (3)水解磷酸肌醇 (phosphoinosilol, PI)。其中前两条途径介导负性肌力作用, 而后一条途径介导正性肌力作用[12]。因此ACh对心房、 心室肌的负性肌力作用可能不仅仅由APD的缩短来决定, 其具体机制尚需深入研究。
有关研究表明, “脱敏”及“反跳”现象在心房、 心室肌APD及Fc等多部位、 多指标均有发生, 是一个普遍存在的现象, 但其机制目前还不清楚。已有研究表明“脱敏”可发生于受体及受体后水平。受体水平的“脱敏”可能与受体的磷酸化或受体效应器脱偶联有关。受体后水平的“脱敏”可能与ACh激活的钾通道或与之相关的调节蛋白的磷酸化及去磷酸化有关。有个别研究推测“反跳”可能是“脱敏”的镜相反映, 其具体机制仍需深入研究[13, 14]。生理水平“脱敏”时出现的受体敏感性降低或急剧受体丧失具有保护细胞免受过度或过强刺激的作用, 对信号传播调节起重要作用。
, 百拇医药
参 考 文 献
[1] 陈 修, 陈维洲, 曾贵云. 心血管药理学. 北京: 人民卫生出版社, 1997,3.
[2]Cremers [KG*4]TIFH, [KG*4]Teisman ACH, Vangilst WH, Westerink BHC. Use of microdialysis for monitoring sympathetic and parasympathetic innervation of heart in conscious rats . Am J Physiol, 1997,273(6 Pt 2):H2850~H2856.
[3] Sharma VK, Colecraft HM, Rubin LE. Does mammalian heart contain only the M2 muscarinic receptor subtype. Life Sci, 1997,60(13-14):1023~1029.
, 百拇医药
[4] Zang WJ (臧伟进), Yu XJ (于晓江), Zang YM (臧益民). Effect of halothane on the muscarinic potassium current of the heart. Acta Physiolo Sini (生理学报), 2000,52:175~178 (Chinese, English abstract).
[5] Boyett MR, Kirby MS, Orchard CH, Roberts A. The negative inotropic effect of acetylcholine on ferret ventricular myocardium. J Physiol, 1988,404:613~615.
[6] Litovsky SH, Antzelevitch C. Differences in the electrophysiological response of canine ventricular subendocardium and subepicardium to acetylcholine and isoproterenol. A direct effect of acetylcholine in ventricular myocardium. Circ Res, 1990,67:615~627.
, http://www.100md.com
[7] Evikostenis, Zeng FY, Wess JG. Structure-function analysis of muscarinic receptors and their associated G proteins. Life Sci, 1999,64(6/7):355~362.
[8] Nadler LS, Rosoff ML, Hamilton SE. Molecular analysis of the regulation of muscarinic receptor expression and function. Life Sci, 1999,64:375~380.
[9] Kim D. Modulation of acetylcholine-activated K+ channel function in rat atrial cells by phosphorylation. J Physiol, 1991,437:133~155.
, http://www.100md.com
[10] Matsuda JJ, Lee HC, Shibata EF. Acetylcholine reversal of isoproterenol-stimulated sodium currents in rabbit ventricular myocytes. Circ Res, 1993,72 (3):517~525.
[11] Koumi SI, Wasserstrom JA. Acetylcholine-sensitive muscarinic K+ channels in mammalian ventricular myocytes . Am J Physiol, 1994,266:H1812~H1821.
[12] 金正均, 王永铭, 苏定冯. 药理学进展. 上海: 科学出版社, 1999,232~241.
[13] Shui ZG, Yamanushi TT, Boyett MR.Evidence of involvement of GIRK1/GIRK4 in long-term desensitization of cardiac muscarinic K+ channels.Am J Physiol, 2001,280(6):H2554~H2562.
[14] Zang WJ, Yu XJ, Honjo H, Boyett MR. On the role of G protein activation and phosphorylation in desensitization to acetylcholine in guinea-pig atrial cells. J Physiol, 1993,464:649~679., http://www.100md.com