植物性雌激素genistein对豚鼠乳头肌的电生理效应
河北医科大学基础医学研究所生理室；石家庄 050017 马韬；范振中；何瑞荣
关键词：植物性雌激素；genistein；乳头肌；电生理；17β-雌二醇
摘要：应用细胞内微电极技术, 观察了genistein (GST)对豚鼠乳头肌的电生理效应。结果显示: (1) GST (10～100 μmol/L)浓度依赖地缩短正常乳头肌动作电位时程; (2)对部分去极化乳头肌, GST (50 μmol/L)除缩短动作电位时程外, 还使动作电位幅值和超射值降低, 零相最大上升速度减慢; (3)预先应用一氧化氮合酶抑制剂L-NNA (5 mmol/L), 不影响GST (50 μmol/L)的电生理效应; (4)单独应用17β-雌二醇(E2, 5 μmol/L)或GST (10 μmol/L)时, 动作电位各参数无明显变化, 而预先应用同剂量的GST再加入E2, 则动作电位时程缩短。结果提示, GST可能通过非NO途径抑制Ca2+内流, 从而影响豚鼠乳头肌电生理效应, 并与E2有加强或协同效应。
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Genistein (GST)属于植物性雌激素中的异黄酮类, 主要来源于豆类。1987年, Akiyama等的研究证实GST还是一种特异性酪氨酸蛋白激酶 (PTK)抑制剂[1]。已有大量研究表明, 以GST为代表的植物性雌激素对于心血管系统具有良好的保护作用。Figtree等发现GST可剂量依赖性地舒张离体家兔冠脉血管环[2]。Deodato等报道GST对大鼠实验性心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用[3]。大量实验证据表明, 植物性雌激素还具有抗动脉粥样硬化作用[4～6]。GST对于心肌电生理的研究也有所报道, 业已发现, GST可影响心肌细胞L-型钙通道电流 (ICa·L)[7～9]、超极化激活的离子流(If)[10,11]、 延迟整流钾电流(IK)[12,13]以及cAMP-依赖性氯离子流(ICl·cAMP)[14～16]等, 但所得结果不尽一致, 其确切作用机制尚未阐明。本研究旨在观察GST对豚鼠乳头肌的电生理效应, 并进而探讨其作用机制及对17β-雌二醇(E2)电生理效应的影响。
实验用250～300 g豚鼠, 雌雄不拘, 击昏后迅速打开胸腔, 取出心脏, 浸泡于氧饱和的Krebs-Henseleit (0～4℃)液中。打开右心室, 剪下乳头肌, 用不锈钢针固定于标本槽底部的硅胶上。用35±0.5℃的K-H液(pH 7.39±0.03)恒速灌流, 流速4 ml/min。用双极起搏电极以场刺激驱动标本, 由刺激器(SEN-3201, Nihon Kohden)经隔离器提供波宽1 ms、 频率1 Hz、 强度为1.5倍阈刺激的方波信号。借助于微推进器将充灌了3 mol/L KCl、 尖端电阻10～30 MΩ的玻璃微电极缓慢插入乳头肌细胞内, 记录动作电位。生物电信号经微电极放大器(MEZ-8201, Nihon Kohden)放大后, 一路输入监听器, 另一路经高速模数转换器输入计算机, 自动显示并分析动作电位各参数, 包括静息电位(RP), 超射值(OS), 动作电位幅值(APA), 0相最大上升速度(Vmax), 复极化50%、 90%和100%的时间(APD50、 APD90和APD); 对复极化2期和3期进行回归分析, 自动测算动作电位平台期时间(plateau period duration, PPD)[17]。动作电位图形及各参数贮存于计算机中, 供日后分析。
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实验数据以means±SE表示, 自身前后对比用配对t检验, 组间各参数变化用单因素方差分析和t检验。以P<0.05为差异有显著性。
1.不同浓度的GST对乳头肌的电生理效应
标本在灌流液中平衡1 h后记录三个动作电位作为对照, 然后用含GST (10～100 μmol/L)的K-H液灌流30 min, 记录灌流后1、 3、 5、 10、 15、 20和30 min时上述动作电位各参数的变化, 再用K-H液冲洗标本, 观察动作电位的恢复。结果表明, GST浓度依赖地缩短PPD、 APD50、 APD90和APD, 于灌流后5～10 min达最大效应。用10 μmol/L GST灌流时, 仅有PPD轻度缩短 (P<0.05), 其余各参数无显著差异 (P>0.05); 用50 μmol/L GST灌流时, PPD、 APD50、 APD90和APD均明显缩短 (P<0.01), 而RP、 OS、 APA和Vmax未受影响; 当GST的浓度增至100 μmol/L时, PPD、 APD50、 APD90和APD进一步明显缩短 (表1和图1)。
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2. GST对部分去极化乳头肌的电生理效应
标本在正常K-H液中平衡1 h后, 改用含1.5 μmol/L异丙肾上腺素的高K+ (KCl 18 mmol/L) K-H液灌流, 即可引出幅值低、上升速度慢的慢反应动作电位。加入50 μmol/L GST后, 动作电位的PPD、 APD50、 APD90和APD缩短 (P<0.05), APA、 OS和Vmax降低 (P<0.05) 。
3. NOS抑制剂L-NNA对GST效应的影响
记录对照后, 用含Nω-nitro-L-arginine (L-NNA, 5 mmol/L)的K-H液预先灌流标本15 min, 动作电位各参数与对照组相比无显著差异(P>0.05)。再以含有GST (50 μmol/L)的K-H液灌流, 动作电位的PPD, APD50, APD90和APD仍缩短(P<0.05) 。
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4. GST对E2效应的影响
单独应用E2 (5 μmol/L)或GST (10 μmol/L)灌流标本, 动作电位各参数与对照组相比, 无显著差异 (P>0.05)。预先用含GST (10 μmol/L)的K-H液灌流标本, 5 min后加入E2 (5 μmol/L), PPD, APD50, APD90和APD均明显缩短(P<0.01), 说明10 μmol/L的GST对5 μmol/L E2有加强或协同作用。
本研究表明, GST (10～100 μmol/L)可浓度依赖性地缩短乳头肌动作电位时程。动作电位时程主要决定于平台期长短, 而后者受Ca2+内流和K+外流的影响, 任何抑制Ca2+内流和促进K+外流的因素, 都可使平台期缩短。为进一步确定导致平台期缩短的离子流, 我们利用含异丙肾上腺素的高钾K-H液灌流标本, 使心肌细胞膜部分去极化, 引出慢反应动作电位。 在这种情况下, 动作电位的除极过程主要依赖于Ca2+内流。GST显著降低慢反应动作电位的APA, OS和Vmax, 缩短PPD, APD50, APD90和APD。此结果说明, GST有抑制Ca2+内流的作用, 提示上述PPD的缩短与其抑制L-型钙通道、 减少Ca2+内流有关。无论在正常还是部分去极化乳头肌, GST对RP均无显著影响, 似表明其并不影响背景K+电流。
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植物性雌激素的结构与雌激素近似, 且可通过与雌激素受体结合发挥作用。已有研究证实雌激素的心血管效应有NO的参与[18]; 但 Figtree等在离体家兔冠脉血管环上的研究表明, GST对血管的舒张效应与NO合成无关[2]； Wang和Lipsius也认为， GST对猫心房肌细胞ICa.L的效应并无NO参与[19]。然而, Squadrito等报道, 在卵巢切除术后的大鼠, 其受损的血管内皮功能可在应用GST后得到恢复, 而此恢复与内皮型NOS活性增加有关[20]。我们在实验中应用NOS抑制剂L-NNA未能影响GST的心肌电生理效应, 似表明在GST的作用中并无NO参与。
Jiang等和Nakajima等的研究均表明E2可抑制豚鼠心肌细胞ICa.L, 缩短动作电位时程[21,22], 此作用应归于雌激素的非基因组效应。我们应用小剂量E2 (5 μmol/L)未引起APD显著缩短, 单独应用GST (10 μmol/L)亦未引起APD明显变化。而在预先应用GST, 再加入E2后, APD显著缩短, 这一结果表明, GST可易化E2的作用。关于GST作用的细胞内机制, 还有待于进一步研究。
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综上所述, GST可能通过非NO途径抑制Ca2+内流, 从而影响豚鼠乳头肌电生理效应, 并与E2有加强或协同的效应。
参考文献
[1]Akiyame T, Ishida J, Nakagawa S, Ogawara H, Watanabe S, Itoh N, Shibuya M, Fukami Y. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. J Biol Chem, 1987,262:5592～5595.
[2]Figtree GA, Griffiths H, Lu YQ, Webb CM, Macleod K, Collins P. Plant-derived estrogens relax coronary arteries in vitro by a calcium antagonistic mechanism. J Am Coll Cardiol, 2000,35:1977～1985.
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[3]Deodato B, Altavilla D,Squadrito G, Campo GM, Arlotta M, Minutoli L, Saitta A, Cucinotta D, Calapai G, Caputi AP, Miano M, Squadrito F. Cardioprotection by the phytoestrogen genistein in experimental myocardial ischaemia-reperfusion injury. Br J Pharmacol, 1999,128:1683～1690.
[4]Anthony MS, Clarkson TB, Williams JK. Effects of soy isoflavones on atherosclerosis: potential mechanisms. Am J Clin Nutr, 1998,68 Suppl:1390S～1393S.
, http://www.100md.com [5]Anthony MS, Clarkson TB. Association between plasma isoflavone and plasma lipoprotein concentrations. J Med Food, 1999,2:263～266.
[6]Anthony MS, Clarkson TB, Bullock BC, Wagner JD. Soy protein versus soy phytoestrogens in the prevention of diet induced coronary artery atherosclerosis of male cynomolgus monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997,17:2524～2531.
[7]Katsube Y, Yokoshiki H, Nguyen L, Yamamoto M, Sperelakis N. Inhibition of Ca2+ current in neonatal and adult rat ventricular myocytes by the tyrosine kinase inhibitor, genistein. Eur J Pharmacol, 1998,345:309～314.
, 百拇医药
[8]Chiang CE, Chen SA, Chang MS, Lin CI, Luk HN. Genistein directly inhibits L-type calcium currents but potentiates cAMP-dependent chloride currents in cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun, 1996,223:598～603.
[9]Yokoshike H, Sumii K, Sperelakis N. Inhibition of L-type calcium current in rat ventricular cells by the tyrosine kinase inhibitor, genistein and its inactive analog, daidzein. J Mol Cell Cardiol, 1996,28:807～814.
, http://www.100md.com [10]Shibata S, Ono K, Iijima T. Inhibition by genistein of the hyperpolarization-activated cation current in porcine sino-atrial node cells. Br J Pharmacol, 1999,128:1284～1290.
[11]Wu JY, Cohen IS. Tyrosine kinase inhibition reduces If in rabbit sinoatrial node myocytes. Pflugers Arch, 1997,434:509～514.
[12]Washizuka T, Horie M, Obayashi K, Sasayama S. Genistein inhibits slow component delayed-rectifier K currents via a tyrosine kinase-independent pathway. J Mol Cell Cardiol, 1998,30:2577～2590.
, 百拇医药
[13]Washizuka T, Horie M, Obayashi K, Sasayama S. Does tyrosine kinase modulate delayed-rectifier K channels in guinea pig ventricular cells? Heart Vessels, 1997,Suppl 12:173～174.
[14]Obayashi K, Horie M, Washizuka T, Nishimoto T, Sasayama S.On the mechanism of genistein-induced activation of protein kinase A-dependent Cl-conductance in cardiac myocytes. Pflugers Arch, 1999,438:269～277.
[15]Zhou SS, Hazama A, Okada Y. Tyrosine kinase-independent extracellular action of genistein on the CFTR Cl-channel in guinea pig ventricular myocytes and CFTR-transfected mouse fibroblasts. Jpn J Physiol, 1998,48:389～396.
, 百拇医药
[16]Chiang CE, Chen SA, Chang MS, Lin CI, Luk HN. Genistein directly induces cardiac CFTR chloride current by a tyrosine kinase-independent and protein kinase A-independent pathway in guinea pig ventricular myocytes. Biochem Biophys Res Commun, 1997,235:74～78.
[17]An RH (安瑞海), He RR (何瑞荣). Electrophysiological effects of m-nisoldipine and nisodipine on papillary muscles of guinea pig. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1990,11:310～314.
, 百拇医药 [18]Kim HP， Lee JY， Jeong JK, Bae SW, Lee HK, Jo I. Nongenomic stimulation of nitric oxide release by estrogen is mediated by estrogen receptor α localized in caveolae. Biochem Biophys Res Commun, 1999,263:257～262.
[19]Wang YG, Lipsius SL. Genistein elicits biphasic ef- fects on L-type Ca2+ current in feline atrial myocytes. Am J Physiol, 1998,275:H204～H212.
[20]Squadrito F， Altavilla D， Squadrito G， Saitta A, Cucinotta D, Minutoli L, Deodato B, Ferlito M, Campo GM, Bova A, Caputi AP.Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovasc Res, 2000,45:454～462.
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[21]Jiang C， Poole-Wilson PA， Sarrel PM， Mochizuki S, Collins P, Macleod KT. Effect of 17β-oestradiol on contraction, Ca2+ current and intracellular free Ca2+ in guinea-pig isolated cardiac myocytes. Br J Pharmacol, 1992,106:739～745.
[22]Nakajima T， Iwasawa K， Oonuma H， Morita T, Goto A, Wang Y, Hazama H. Antiarrhythmic effect and its underlying ionic mechanism of 17β-estradiol in cardiac myocytes. Br J Pharmacol, 1999,127:429～440., 百拇医药
关键词：植物性雌激素；genistein；乳头肌；电生理；17β-雌二醇
摘要：应用细胞内微电极技术, 观察了genistein (GST)对豚鼠乳头肌的电生理效应。结果显示: (1) GST (10～100 μmol/L)浓度依赖地缩短正常乳头肌动作电位时程; (2)对部分去极化乳头肌, GST (50 μmol/L)除缩短动作电位时程外, 还使动作电位幅值和超射值降低, 零相最大上升速度减慢; (3)预先应用一氧化氮合酶抑制剂L-NNA (5 mmol/L), 不影响GST (50 μmol/L)的电生理效应; (4)单独应用17β-雌二醇(E2, 5 μmol/L)或GST (10 μmol/L)时, 动作电位各参数无明显变化, 而预先应用同剂量的GST再加入E2, 则动作电位时程缩短。结果提示, GST可能通过非NO途径抑制Ca2+内流, 从而影响豚鼠乳头肌电生理效应, 并与E2有加强或协同效应。
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Genistein (GST)属于植物性雌激素中的异黄酮类, 主要来源于豆类。1987年, Akiyama等的研究证实GST还是一种特异性酪氨酸蛋白激酶 (PTK)抑制剂[1]。已有大量研究表明, 以GST为代表的植物性雌激素对于心血管系统具有良好的保护作用。Figtree等发现GST可剂量依赖性地舒张离体家兔冠脉血管环[2]。Deodato等报道GST对大鼠实验性心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用[3]。大量实验证据表明, 植物性雌激素还具有抗动脉粥样硬化作用[4～6]。GST对于心肌电生理的研究也有所报道, 业已发现, GST可影响心肌细胞L-型钙通道电流 (ICa·L)[7～9]、超极化激活的离子流(If)[10,11]、 延迟整流钾电流(IK)[12,13]以及cAMP-依赖性氯离子流(ICl·cAMP)[14～16]等, 但所得结果不尽一致, 其确切作用机制尚未阐明。本研究旨在观察GST对豚鼠乳头肌的电生理效应, 并进而探讨其作用机制及对17β-雌二醇(E2)电生理效应的影响。
实验用250～300 g豚鼠, 雌雄不拘, 击昏后迅速打开胸腔, 取出心脏, 浸泡于氧饱和的Krebs-Henseleit (0～4℃)液中。打开右心室, 剪下乳头肌, 用不锈钢针固定于标本槽底部的硅胶上。用35±0.5℃的K-H液(pH 7.39±0.03)恒速灌流, 流速4 ml/min。用双极起搏电极以场刺激驱动标本, 由刺激器(SEN-3201, Nihon Kohden)经隔离器提供波宽1 ms、 频率1 Hz、 强度为1.5倍阈刺激的方波信号。借助于微推进器将充灌了3 mol/L KCl、 尖端电阻10～30 MΩ的玻璃微电极缓慢插入乳头肌细胞内, 记录动作电位。生物电信号经微电极放大器(MEZ-8201, Nihon Kohden)放大后, 一路输入监听器, 另一路经高速模数转换器输入计算机, 自动显示并分析动作电位各参数, 包括静息电位(RP), 超射值(OS), 动作电位幅值(APA), 0相最大上升速度(Vmax), 复极化50%、 90%和100%的时间(APD50、 APD90和APD); 对复极化2期和3期进行回归分析, 自动测算动作电位平台期时间(plateau period duration, PPD)[17]。动作电位图形及各参数贮存于计算机中, 供日后分析。
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实验数据以means±SE表示, 自身前后对比用配对t检验, 组间各参数变化用单因素方差分析和t检验。以P<0.05为差异有显著性。
1.不同浓度的GST对乳头肌的电生理效应
标本在灌流液中平衡1 h后记录三个动作电位作为对照, 然后用含GST (10～100 μmol/L)的K-H液灌流30 min, 记录灌流后1、 3、 5、 10、 15、 20和30 min时上述动作电位各参数的变化, 再用K-H液冲洗标本, 观察动作电位的恢复。结果表明, GST浓度依赖地缩短PPD、 APD50、 APD90和APD, 于灌流后5～10 min达最大效应。用10 μmol/L GST灌流时, 仅有PPD轻度缩短 (P<0.05), 其余各参数无显著差异 (P>0.05); 用50 μmol/L GST灌流时, PPD、 APD50、 APD90和APD均明显缩短 (P<0.01), 而RP、 OS、 APA和Vmax未受影响; 当GST的浓度增至100 μmol/L时, PPD、 APD50、 APD90和APD进一步明显缩短 (表1和图1)。
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2. GST对部分去极化乳头肌的电生理效应
标本在正常K-H液中平衡1 h后, 改用含1.5 μmol/L异丙肾上腺素的高K+ (KCl 18 mmol/L) K-H液灌流, 即可引出幅值低、上升速度慢的慢反应动作电位。加入50 μmol/L GST后, 动作电位的PPD、 APD50、 APD90和APD缩短 (P<0.05), APA、 OS和Vmax降低 (P<0.05) 。
3. NOS抑制剂L-NNA对GST效应的影响
记录对照后, 用含Nω-nitro-L-arginine (L-NNA, 5 mmol/L)的K-H液预先灌流标本15 min, 动作电位各参数与对照组相比无显著差异(P>0.05)。再以含有GST (50 μmol/L)的K-H液灌流, 动作电位的PPD, APD50, APD90和APD仍缩短(P<0.05) 。
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4. GST对E2效应的影响
单独应用E2 (5 μmol/L)或GST (10 μmol/L)灌流标本, 动作电位各参数与对照组相比, 无显著差异 (P>0.05)。预先用含GST (10 μmol/L)的K-H液灌流标本, 5 min后加入E2 (5 μmol/L), PPD, APD50, APD90和APD均明显缩短(P<0.01), 说明10 μmol/L的GST对5 μmol/L E2有加强或协同作用。
本研究表明, GST (10～100 μmol/L)可浓度依赖性地缩短乳头肌动作电位时程。动作电位时程主要决定于平台期长短, 而后者受Ca2+内流和K+外流的影响, 任何抑制Ca2+内流和促进K+外流的因素, 都可使平台期缩短。为进一步确定导致平台期缩短的离子流, 我们利用含异丙肾上腺素的高钾K-H液灌流标本, 使心肌细胞膜部分去极化, 引出慢反应动作电位。 在这种情况下, 动作电位的除极过程主要依赖于Ca2+内流。GST显著降低慢反应动作电位的APA, OS和Vmax, 缩短PPD, APD50, APD90和APD。此结果说明, GST有抑制Ca2+内流的作用, 提示上述PPD的缩短与其抑制L-型钙通道、 减少Ca2+内流有关。无论在正常还是部分去极化乳头肌, GST对RP均无显著影响, 似表明其并不影响背景K+电流。
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植物性雌激素的结构与雌激素近似, 且可通过与雌激素受体结合发挥作用。已有研究证实雌激素的心血管效应有NO的参与[18]; 但 Figtree等在离体家兔冠脉血管环上的研究表明, GST对血管的舒张效应与NO合成无关[2]； Wang和Lipsius也认为， GST对猫心房肌细胞ICa.L的效应并无NO参与[19]。然而, Squadrito等报道, 在卵巢切除术后的大鼠, 其受损的血管内皮功能可在应用GST后得到恢复, 而此恢复与内皮型NOS活性增加有关[20]。我们在实验中应用NOS抑制剂L-NNA未能影响GST的心肌电生理效应, 似表明在GST的作用中并无NO参与。
Jiang等和Nakajima等的研究均表明E2可抑制豚鼠心肌细胞ICa.L, 缩短动作电位时程[21,22], 此作用应归于雌激素的非基因组效应。我们应用小剂量E2 (5 μmol/L)未引起APD显著缩短, 单独应用GST (10 μmol/L)亦未引起APD明显变化。而在预先应用GST, 再加入E2后, APD显著缩短, 这一结果表明, GST可易化E2的作用。关于GST作用的细胞内机制, 还有待于进一步研究。
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综上所述, GST可能通过非NO途径抑制Ca2+内流, 从而影响豚鼠乳头肌电生理效应, 并与E2有加强或协同的效应。
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