肾性高血压大鼠延髓尾端神经元型一氧化氮合酶表达的改变
1福建医科大学生理学教研室；福州 350004；2福建省立医院外科；福州 350001;中山医科大学 3病理学教研室、 4生理学教研室；广州 510089 王晶1*；陈志江2；罗灿乔3；潘敬运4
关键词：延髓腹面降压区；延髓尾端加压区；神经元型一氧化氮合酶；L-精氨酸；N-硝基-L-精氨酸甲酯
摘要：实验采用免疫组织化学方法观察两肾一夹肾性高血压大鼠延髓尾端两个区域 (延髓腹面降压区和尾端加压区) 内神经元型一氧化氮合酶 (neuronal nitric oxide synthase, nNOS) 表达的变化。肾性高血压大鼠延髓尾端这两个区域的nNOS的表达均增加, 说明高血压时L-Arg-NO通路活性增强。NO的前体L-Arg能增强nNOS的表达, nNOS抑制剂L-NAME则降低nNOS的表达。以上两个区域nNOS表达变化的特点在肾性高血压4周和7周的动物相同, 肾性高血压7周的nNOS表达和4周比较, 未见明显差异。
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近年的研究表明, 在不同的脑区一氧化氮(NO)对心血管活动有不同的作用[1,2] , 在延髓尾端心血管中枢, NO的作用与L-Glu能递质相反, 在升压区表现降压, 在降压区表现升压。我们先前的研究证明, NO的这一作用可能是通过抑制L-Glu能递质系统而实现的[3,4]。为进一步明确高血压期间不同脑区的NO含量是否发生变化, 以及NO的前体L-Arg和NOS抑制剂L-NAME对NOS表达的影响, 本实验采用免疫组化方法, 测定两肾一夹(two-kidney one clip, 2K1C)肾性高血压大鼠延髓尾端两个区域延髓腹面降压区(depressor area of the ventral surface of medulla oblongata, VSMd)和延髓尾端加压区(caudal pressor area, CPA)内神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)表达的变化。由于NO的半衰期短,难以直接检测, 而NOS在细胞内的分布和NO基本一致, 所以观察NOS的变化可推测L-Arg-NO通路的活性。
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实验动物及其分组雄性SD大鼠(150~200 g), 由中山医科大学实验动物中心提供。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉。在无菌条件下分离左肾动脉, 并安装内径为0.2 mm的“U”型银夹, 使左肾动脉部分狭窄, 右肾保持完好, 造成2K1C肾性高血压模型。术后将这些动物分成4组(每组10只)：(1)假手术组, 该组大鼠只做左肾动脉分离而不上银夹; (2)2K1C组; (3)2K1C+NAME组, 在2K1C大鼠由腹腔注射NOS抑制剂L-NAME [10 mg/(kg·d)]; (4)2K1C+Arg 组, 在2K1C大鼠饮水中加NO的前体L-Arg, 摄入量为每天150 mg/kg; 分别在4周和7周麻醉后测定血压, 取出尾端延髓, 用免疫组织化学方法测定nNOS的表达。
VSMd和CPA的定位VSMd 的降压反应点位于延髓腹面尾端Ⅻ对脑神经根丛中部联线上方, 中线旁1.2~2.5 mm的范围[3]; CPA的升压反应点位于延髓腹面Ⅻ对脑神经根中部联线下方0.8~1.5 mm, 中线旁1.2~1.5 mm 的范围[4] 。 本实验动物 VSMd 和 CPA 的定位是用同一标本 HE染色切片, 根据Paxinos 和Watson图谱定位。
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nNOS的免疫组化实验大鼠深麻醉后开胸, 暴露心脏, 经左心室快速灌注生理盐水和多聚甲醛, 断头取尾端延髓, 置入多聚甲醛中固定, 蔗糖脱水, 石蜡包埋, 连续切片, 用免疫组织染色ABC法检测nNOS阳性神经元。
试剂NOS1免疫盒、SABC(兔IgG)、 PBS为博士德公司产品。
数据处理用计算机全自动图像分析系统(德国KONTRON IBAS 2.5)测量反应的灰度值。计算每个标本的平均灰度值, 对所得的结果做配对计量资料t检验。
实验结果如下：
1. 术后各组大鼠的平均动脉压(MAP)
2. 2K1C各组大鼠VSMd和CPA nNOS表达的变化
光镜下观察, 上述两区域中nNOS阳性的细胞多为不规则的中小型细胞, 胞浆浓染成褐色, 可见短而粗的突起。用计算机全自动图像分析系统测量nNOS阳性细胞反应的灰度值, 灰度值分256个等级, 免疫组化的反应强弱与灰度值呈反比。
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肾性高血压根据其时间的长短可分为早期(3周)和晚期(6周以后)两个阶段, 早期的血压升高和血浆内肾素-血管紧张素增加有关, 晚期则更多依赖于血液动力学的改变, 包括钠水潴留[2]。本文选择了4周和7周两个不同的高血压时期, 分别对延髓尾端的升压和降压两个区域的nNOS含量做了检测。
VSMd是体内重要的降压区, 它的紧张性活动抑制延髓头端的加压神经元。很多证据表明, 自发性高血压动物的VSMd紧张性活动减弱是高血压发病的原因之一[5]。本实验观察到2K1C大鼠VSMd nNOS的表达增加, 提示高血压时该区域NO含量有所增高, 这和NO在该区的升压作用一致。NO的增加抑制了该区谷氨酸能神经元的活性, 从而对延髓头端加压区加压神经元的紧张性抑制活动减弱, 这一作用可能参与肾性高血压的发病过程。
CPA是体内除了延髓头端加压区外的另一个重要加压区, 由Feldberg等在1986年首次报道。本实验观察到2K1C大鼠CPA nNOS 表达也增加, 这可能是2K1C大鼠血压升高时导致交感神经活性增高[6], 激活了CPA的L-Arg-NO通路, 从而抑制交感紧张性。因为作为延髓头端加压区紧张性来源的CPA, nNOS表达的增加能增强NO对抗L-Glu能递质的作用, 减弱CPA传至延髓头端加压区的紧张性驱动。
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本文还观察了NO的前体L-Arg和NOS抑制剂L-NAME对nNOS 表达的影响, 观察到补充L-Arg可诱导大鼠nNOS 表达, 而L-NAME则抑制nNOS 表达, 说明L-Arg 既是NO的前体, 又可通过提高作为nNOS氧化还原辅基的四氢叶酸与酶的亲和力促使自身向NO转化[7]。另有人认为 L-Arg增强nNOS的表达可能还与其增强结构型NOS活性二聚体的稳定性有关[8]。而L-NAME可能通过抑制细胞内NO合成, 降低细胞内cGMP的水平从而抑制NOS阳性神经元c-fos基因的表达[9]。本文还观察到, 虽然L-Arg可以增强nNOS的表达, 但对降压似无作用, 因L-Arg给药既不能降低2K1C组动物的高血压, 也不能降低 2K1C+ NAME组动物的高血压。Matsuoka也曾报道慢性长期L-Arg给药可减轻高血压动物的心肌肥厚并恢复动脉血管对ACh的舒张反应, 但对高血压无降低作用, 其机制仍有待于探讨。此外, 本文还对两个不同时期的肾性高血压大鼠nNOS的表达做了比较, 发现不论是VSMd或CPA, nNOS表达变化的特点在肾性高血压4周时和7周时的动物相同。而在同一组中7周的表达比4周略为减少, 但无统计学意义。 另外, nNOS的表达与血压的增高亦无相关性, 说明NO在中枢神经系统的不同的脑区有不同的心血管效应。
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参考文献
[1]Krukoffo TL, Mactavish D, Jhamandas JH. Activation by hypotension of neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus that project to the brainstem. J Comp Neurol, 1997, 385(2)：285~296.
[2]Krukoffo TL, Gehlen F, Ganten D. Gene expression of brain nitric oxide synthase and soluble guanglyl cyclase in hypothalamus and medulla of two-kidney one clip hypertensive rats. Hypertension, 1995, 26(1)：171~176.
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[3]Wang J(王 晶), Pan JY(潘敬运), Jia BJ(贾秉钧). Effect of microinjection of L-Arginine into the depressor area of ventral surface of medulla oblongata on cardiovascular responses in rats. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 2001, 17(2)：153~156 (Chinese, English abstract).
[4]Wang J (王 晶), Pan JY (潘敬运), Jia BJ (贾秉钧). Effect of microinjection of L-Arginine into the caudal pressor area of medulla oblongata on cardiovascular responses in rats. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 2001, 17(3)：267~270 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药
[5]Smith JK, Barron KW. The rostral and caudal ventrolateral medulla in young spontaneously hypertensive rats. Brain Res, 1990, 506：153~158.
[6]Brody M, Haywood R, Touw K. Neural mechanisms in hypertension. Annu Rev Physiol, 1980, 42: 441~453.
[7]Mayer B, Wermer ER. In search of a function for tetrahydrobiopterin of nitric oxide. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 1995, 351：453~463.
[8]Klatt P, Schimidt K, Lehner D, Leopold E. Structural analysis of porcine brain nitric oxide synthase reveals a role for tetrahydrobiopterin and L-arginine in the formation of SDS-resistant dimer. EMBOJ, 1995, 14：3687~3695.
[9]Lee JH, Wilcox GL, Beitz N. Nitric oxide mediates Fos expression in the spinal cord induced by mechanical noxious stimulation. Neuroreport, 1992, 3 (10): 841~844., 百拇医药
关键词：延髓腹面降压区；延髓尾端加压区；神经元型一氧化氮合酶；L-精氨酸；N-硝基-L-精氨酸甲酯
摘要：实验采用免疫组织化学方法观察两肾一夹肾性高血压大鼠延髓尾端两个区域 (延髓腹面降压区和尾端加压区) 内神经元型一氧化氮合酶 (neuronal nitric oxide synthase, nNOS) 表达的变化。肾性高血压大鼠延髓尾端这两个区域的nNOS的表达均增加, 说明高血压时L-Arg-NO通路活性增强。NO的前体L-Arg能增强nNOS的表达, nNOS抑制剂L-NAME则降低nNOS的表达。以上两个区域nNOS表达变化的特点在肾性高血压4周和7周的动物相同, 肾性高血压7周的nNOS表达和4周比较, 未见明显差异。
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近年的研究表明, 在不同的脑区一氧化氮(NO)对心血管活动有不同的作用[1,2] , 在延髓尾端心血管中枢, NO的作用与L-Glu能递质相反, 在升压区表现降压, 在降压区表现升压。我们先前的研究证明, NO的这一作用可能是通过抑制L-Glu能递质系统而实现的[3,4]。为进一步明确高血压期间不同脑区的NO含量是否发生变化, 以及NO的前体L-Arg和NOS抑制剂L-NAME对NOS表达的影响, 本实验采用免疫组化方法, 测定两肾一夹(two-kidney one clip, 2K1C)肾性高血压大鼠延髓尾端两个区域延髓腹面降压区(depressor area of the ventral surface of medulla oblongata, VSMd)和延髓尾端加压区(caudal pressor area, CPA)内神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)表达的变化。由于NO的半衰期短,难以直接检测, 而NOS在细胞内的分布和NO基本一致, 所以观察NOS的变化可推测L-Arg-NO通路的活性。
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实验动物及其分组雄性SD大鼠(150~200 g), 由中山医科大学实验动物中心提供。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉。在无菌条件下分离左肾动脉, 并安装内径为0.2 mm的“U”型银夹, 使左肾动脉部分狭窄, 右肾保持完好, 造成2K1C肾性高血压模型。术后将这些动物分成4组(每组10只)：(1)假手术组, 该组大鼠只做左肾动脉分离而不上银夹; (2)2K1C组; (3)2K1C+NAME组, 在2K1C大鼠由腹腔注射NOS抑制剂L-NAME [10 mg/(kg·d)]; (4)2K1C+Arg 组, 在2K1C大鼠饮水中加NO的前体L-Arg, 摄入量为每天150 mg/kg; 分别在4周和7周麻醉后测定血压, 取出尾端延髓, 用免疫组织化学方法测定nNOS的表达。
VSMd和CPA的定位VSMd 的降压反应点位于延髓腹面尾端Ⅻ对脑神经根丛中部联线上方, 中线旁1.2~2.5 mm的范围[3]; CPA的升压反应点位于延髓腹面Ⅻ对脑神经根中部联线下方0.8~1.5 mm, 中线旁1.2~1.5 mm 的范围[4] 。 本实验动物 VSMd 和 CPA 的定位是用同一标本 HE染色切片, 根据Paxinos 和Watson图谱定位。
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nNOS的免疫组化实验大鼠深麻醉后开胸, 暴露心脏, 经左心室快速灌注生理盐水和多聚甲醛, 断头取尾端延髓, 置入多聚甲醛中固定, 蔗糖脱水, 石蜡包埋, 连续切片, 用免疫组织染色ABC法检测nNOS阳性神经元。
试剂NOS1免疫盒、SABC(兔IgG)、 PBS为博士德公司产品。
数据处理用计算机全自动图像分析系统(德国KONTRON IBAS 2.5)测量反应的灰度值。计算每个标本的平均灰度值, 对所得的结果做配对计量资料t检验。
实验结果如下：
1. 术后各组大鼠的平均动脉压(MAP)
2. 2K1C各组大鼠VSMd和CPA nNOS表达的变化
光镜下观察, 上述两区域中nNOS阳性的细胞多为不规则的中小型细胞, 胞浆浓染成褐色, 可见短而粗的突起。用计算机全自动图像分析系统测量nNOS阳性细胞反应的灰度值, 灰度值分256个等级, 免疫组化的反应强弱与灰度值呈反比。
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肾性高血压根据其时间的长短可分为早期(3周)和晚期(6周以后)两个阶段, 早期的血压升高和血浆内肾素-血管紧张素增加有关, 晚期则更多依赖于血液动力学的改变, 包括钠水潴留[2]。本文选择了4周和7周两个不同的高血压时期, 分别对延髓尾端的升压和降压两个区域的nNOS含量做了检测。
VSMd是体内重要的降压区, 它的紧张性活动抑制延髓头端的加压神经元。很多证据表明, 自发性高血压动物的VSMd紧张性活动减弱是高血压发病的原因之一[5]。本实验观察到2K1C大鼠VSMd nNOS的表达增加, 提示高血压时该区域NO含量有所增高, 这和NO在该区的升压作用一致。NO的增加抑制了该区谷氨酸能神经元的活性, 从而对延髓头端加压区加压神经元的紧张性抑制活动减弱, 这一作用可能参与肾性高血压的发病过程。
CPA是体内除了延髓头端加压区外的另一个重要加压区, 由Feldberg等在1986年首次报道。本实验观察到2K1C大鼠CPA nNOS 表达也增加, 这可能是2K1C大鼠血压升高时导致交感神经活性增高[6], 激活了CPA的L-Arg-NO通路, 从而抑制交感紧张性。因为作为延髓头端加压区紧张性来源的CPA, nNOS表达的增加能增强NO对抗L-Glu能递质的作用, 减弱CPA传至延髓头端加压区的紧张性驱动。
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本文还观察了NO的前体L-Arg和NOS抑制剂L-NAME对nNOS 表达的影响, 观察到补充L-Arg可诱导大鼠nNOS 表达, 而L-NAME则抑制nNOS 表达, 说明L-Arg 既是NO的前体, 又可通过提高作为nNOS氧化还原辅基的四氢叶酸与酶的亲和力促使自身向NO转化[7]。另有人认为 L-Arg增强nNOS的表达可能还与其增强结构型NOS活性二聚体的稳定性有关[8]。而L-NAME可能通过抑制细胞内NO合成, 降低细胞内cGMP的水平从而抑制NOS阳性神经元c-fos基因的表达[9]。本文还观察到, 虽然L-Arg可以增强nNOS的表达, 但对降压似无作用, 因L-Arg给药既不能降低2K1C组动物的高血压, 也不能降低 2K1C+ NAME组动物的高血压。Matsuoka也曾报道慢性长期L-Arg给药可减轻高血压动物的心肌肥厚并恢复动脉血管对ACh的舒张反应, 但对高血压无降低作用, 其机制仍有待于探讨。此外, 本文还对两个不同时期的肾性高血压大鼠nNOS的表达做了比较, 发现不论是VSMd或CPA, nNOS表达变化的特点在肾性高血压4周时和7周时的动物相同。而在同一组中7周的表达比4周略为减少, 但无统计学意义。 另外, nNOS的表达与血压的增高亦无相关性, 说明NO在中枢神经系统的不同的脑区有不同的心血管效应。
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参考文献
[1]Krukoffo TL, Mactavish D, Jhamandas JH. Activation by hypotension of neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus that project to the brainstem. J Comp Neurol, 1997, 385(2)：285~296.
[2]Krukoffo TL, Gehlen F, Ganten D. Gene expression of brain nitric oxide synthase and soluble guanglyl cyclase in hypothalamus and medulla of two-kidney one clip hypertensive rats. Hypertension, 1995, 26(1)：171~176.
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[3]Wang J(王 晶), Pan JY(潘敬运), Jia BJ(贾秉钧). Effect of microinjection of L-Arginine into the depressor area of ventral surface of medulla oblongata on cardiovascular responses in rats. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 2001, 17(2)：153~156 (Chinese, English abstract).
[4]Wang J (王 晶), Pan JY (潘敬运), Jia BJ (贾秉钧). Effect of microinjection of L-Arginine into the caudal pressor area of medulla oblongata on cardiovascular responses in rats. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 2001, 17(3)：267~270 (Chinese, English abstract).
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[5]Smith JK, Barron KW. The rostral and caudal ventrolateral medulla in young spontaneously hypertensive rats. Brain Res, 1990, 506：153~158.
[6]Brody M, Haywood R, Touw K. Neural mechanisms in hypertension. Annu Rev Physiol, 1980, 42: 441~453.
[7]Mayer B, Wermer ER. In search of a function for tetrahydrobiopterin of nitric oxide. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 1995, 351：453~463.
[8]Klatt P, Schimidt K, Lehner D, Leopold E. Structural analysis of porcine brain nitric oxide synthase reveals a role for tetrahydrobiopterin and L-arginine in the formation of SDS-resistant dimer. EMBOJ, 1995, 14：3687~3695.
[9]Lee JH, Wilcox GL, Beitz N. Nitric oxide mediates Fos expression in the spinal cord induced by mechanical noxious stimulation. Neuroreport, 1992, 3 (10): 841~844., 百拇医药