乙酰胆碱对三种人垂体腺瘤细胞增殖及凋亡的影响
第四军医大学 1生理学教研室、2西京医院全军皮肤性病中心、3西京医院脑外科；西安 710032 迟素敏1*；李承新2；刘亚莉1；朱运龙1；顾建文3；杜亮1；王复周1
关键词：乙酰胆碱；垂体；腺瘤；增殖；凋亡
摘要：为了解乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)在人垂体腺瘤发生、发展中的作用, 本研究首先观察了人垂体腺瘤细胞内是否存在合成ACh必需的胆碱乙酰转移酶, 并应用MTT实验、[3H]TdR掺入实验、细胞周期分析和TUNEL法测定了ACh对体外培养的人垂体无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果发现: (1)三种垂体腺瘤细胞中均有胆碱酯酶的表达, 但明显少于正常垂体; (2)ACh对三种类型的人垂体腺瘤细胞增殖代谢的影响相类似, 不同浓度的ACh能明显抑制体外培养的三种人垂体腺瘤细胞的增殖, 呈明显的剂量效应关系, 同时ACh能减少垂体腺瘤细胞进入S、G2期的细胞比例, 而使处于G1期的细胞比例增加; (3)ACh的这种作用可被阿托品阻断, 但不受筒箭毒的影响; (4)ACh对体外培养的三种人垂体腺瘤细胞凋亡无明显影响。该结果提示, ACh可能以旁分泌或自分泌的方式作用于垂体前叶细胞, 对垂体腺瘤细胞增殖分化有调控作用, 而且是通过ACh M受体来实现的。
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垂体腺瘤是临床内分泌系统和神经外科中的常见病变, 发病率约占颅内肿瘤的15%, 绝大多数为良性肿瘤, 但有三分之一为侵袭性的, 有一少部分(约1%)可转变为恶性肿瘤[1]。因此, 深入研究垂体腺瘤的发病机制及影响因素有着重要的意义。目前认为, 垂体腺瘤是由于垂体细胞首先发生突变(编码G蛋白α亚单位的基因存在突变), 然后在内外因素的促进下突变的细胞增生, 发展为垂体腺瘤。下丘脑的促激素和垂体内的旁分泌因子可能在垂体腺瘤形成的促进阶段起重要作用[2]。这些旁分泌因子包括乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)、激活素、神经肽、生长因子、细胞因子、催乳素片段等。
研究表明, 多种动物的正常垂体前叶细胞及肿瘤细胞都可以合成并分泌ACh[3~5]。但是, 人垂体腺瘤细胞是否也可以合成、分泌ACh尚无直接的证据。而且, 虽然早在80年代初就有学者开始研究ACh与腺垂体功能的关系, 但到目前为止, 关于ACh作用的研究基本限于ACh对垂体和对垂体腺瘤细胞系的分泌功能的影响。由于实验方法的不同以及所使用的实验对象的不同, 众多学者对所观察到的结果尚未取得一致性的认识[6~8]。关于ACh对垂体前叶细胞增殖代谢的影响更无直接研究资料, 仅Fedotov观察了ACh对不同年龄组大鼠垂体细胞总蛋白及DNA合成的影响, 结果发现, ACh可减少青春期大鼠垂体细胞总蛋白合成, 但对新生鼠无影响, 而且ACh对新生鼠垂体细胞DNA合成亦无影响[9]。因此, 本实验通过免疫组化观察人的正常垂体前叶细胞及人无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤细胞的胞浆内是否存在合成ACh的限速酶胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase, ChAT), 并利用多种手段探讨ACh对培养的人三种垂体腺瘤细胞增殖及凋亡的影响。
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1材料和方法
1.1 材料 新鲜人垂体腺瘤手术标本56例, 其中无功能瘤20例, 催乳素瘤25例, 生长激素瘤11例, 由西京医院神经外科提供, 诊断均经临床表现和病理组织学检查证实。将手术取下的瘤组织置于无菌生理盐水中暂时保存。正常人垂体标本(尸检标本)由本校病理学教研室提供。
1.2 主要试剂和药品 ACh、胶原酶、胰蛋白酶、DNA酶、MTT(噻唑蓝)购自美国Sigma公司; DF-12培养基购自美国Gibco公司; 新生牛血清为杭州四季青生物制品公司产品; [3H]TdR购自上海原子能科学研究院。
1.3 免疫组织化学 取垂体腺瘤组织放入Bouin′s固定液中固定4 h (正常人垂体的尸检标本经多聚甲醛常规固定), 用系列酒精脱水, 二甲苯透明, 常规石蜡包埋, 切片(厚5 μm), 脱蜡入水, 100% 甲醇+0.3% H2O2处理10 min, 以去除内源性过氧化物酶活性, 用10% BSA封闭非特异抗原。滴加兔抗人ChAT多克隆抗体(Sigma公司, 工作浓度为1∶1000, 稀释液为含10 g/L BSA, 3 ml/L Triton X-100和1 g/L NaN3的0.01 mol/L PBS)于载玻片上, 4℃孵育48 h, 然后行ABC法免疫组织化学染色, DAB呈色。脱水、 透明、 中性树胶封片, 镜检观察, 对胞浆有明确棕黄色着色者判定为阳性细胞。空白对照用抗体稀释液代替一抗。
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1.4 垂体腺瘤细胞的分离和培养 在超净台内, 用DF-12培养液清洗瘤组织的血液3次, 置于青霉素小瓶中剪碎至糊状, 分别加入2.5 g/L胰蛋白酶、6.7 mkat/L的胶原酶、3.3 mkat/L的DNA酶各5 ml, 37℃水浴振摇消化25 min, 加牛血清, 用200目滤网过滤, 离心弃上清, 加DF-12培养液, 轻轻吹起细胞, 离心弃上清, 加含100 ml/L胎牛血清的DF-12培养液, 轻轻吹起细胞, 调整为5×108/L, 并接种于96孔板, 每孔100 μl, 移入CO2孵箱中, 在37℃、 50 ml/L CO2及饱和湿度条件下培养。24 h换液, 之后48 h换液1次。
1.5 MTT试验 垂体腺瘤细胞培养至第6天换无血清DF-12培养液, 24 h后换含不同浓度的ACh (0.1、1 和10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+阿托品 (10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+筒箭毒 (10 μmol/L)和碳酰胆碱(10 μmol/L)的无血清DF-12培养液。 对照组为无血清DF-12培养液, 每组设5个重复孔。孵育24 h, 每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl, 继续孵育4 h, 终止培养。 小心吸弃孔内上清液, 每孔加入DMSO 150 μl, 振荡10 min, 选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A490 nm值), 记录结果, 计算变化率, 变化率(%)＝(实验组A490 nm值/对照组A490 nm值)×100。
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1.6 [3H]TdR掺入实验 垂体腺瘤细胞培养至第6天换无血清DF-12培养液, 24 h后换含不同浓度的ACh (0.1、1 和10 μmol/L)、ACh(10 μmol/L)+阿托品(10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+筒箭毒(10 μmol/L)和碳酰胆碱(10 μmol/L)的无血清DF-12培养液, 对照组为无血清DF-12培养液, 每组设5个重复孔。24 h后, 每孔加入[3H]TdR(1.85 MBq/L), 继续孵育12 h, 终止反应。 经ZT-2型微量多头细胞收集器收集细胞于9999型玻璃纤维滤纸上, 滤纸经红外线烘干后置入闪烁瓶中, 加入PPO/POPOP/二甲苯闪烁液, 用液闪计数器进行[3H]TdR掺入率的测定, 记录cpm值, 计算变化率, 变化率(%)＝(实验组cpm值/对照组cpm值)×100。
1.7 用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期 垂体腺瘤细胞分离方法和细胞悬液浓度同上, 取1.5 ml接种于25 ml培养瓶中, 在CO2孵箱中培养, 条件同上。24 h换液, 之后48 h换液1次, 第6天换无血清DF-12培养液, 24 h后换含ACh (10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+阿托品 (10 μmol/L)、ACh(10 μmol/L)+筒箭毒(10 μmol/L)和碳酰胆碱(10 μmol/L)的无血清培养液。 对照组为无血清DF-12培养液, 继续孵育24 h后, 用2.5 g/L胰蛋白酶-0.2 g/LEDTA消化, 离心, 收集细胞, PBS洗2次, 1000 r/min离心5 min, 吸弃上清, 加PBS 1 ml, 轻轻吹匀细胞, 加无水乙醇2 ml固定。用FCM EPICS Profile Ⅱ型测定细胞周期。
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1.8 TUNEL实验检测细胞凋亡 培养至第6天, 吸弃8孔载玻片盒内的培养液, 分别加入含不同浓度的ACh(0.1、1 和10 μmol/L)、ACh(10 μmol/L)+阿托品(10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+筒箭毒 (10 μmol/L) 和碳酰胆碱 (10 μmol/L) 的无血清DF-12培养液。 阴性对照组为含1 ml/L二甲基亚砜的50 g/L胎牛血清培养液。孵育48 h, 吸弃培养液, 40 g/L多聚甲醛固定25 min, 0.01 mol/L PBS洗5 min×3次。用TUNEL(Tdt-mediated dUTP nick end labeling)试剂盒的方法, 采用末端探针标记检测凋亡细胞。在每例每组(8孔板的1孔)中, 计数10个视野(20×物镜)中凋亡细胞的百分比作为凋亡指数(apoptosis index, AI)。
1.9 实验分组及统计学分析 所有数据均以mean±SD表示, 两组间均数比较用t检验处理, 多组间均数采用Origin 5.0软件中单因素方差分析进行统计学处理。
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2结果
2.1 胆碱乙酰转移酶在人正常垂体及人垂体腺瘤中的表达
ABC免疫组织化学法证实, 人正常垂体及人垂体无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤中均有胆碱乙酰转移酶的表达, 但表达ChAT 的阳性细胞数量明显不同。人三种垂体腺瘤表达ChAT 的阳性细胞数量较少, 散在分布, 但染色呈强阳性, 以DAB显色, 可见棕黄色颗粒分布于细胞浆中。正常人垂体表达ChAT 的阳性细胞数量较多, 大部分细胞胞浆内可见棕黄色颗粒, 但强度较垂体腺瘤细胞弱。由于该例正常人垂体并非严格意义上的正常垂体, 因而部分细胞可见明显空泡化。
2.2 ACh对人垂体腺瘤细胞凋亡的影响
凋亡细胞经TUNEL染色后表现为细胞核的棕黄色着色。ACh虽然可抑制体外培养的人垂体腺瘤细胞的增殖代谢, 但TUNEL检测结果表明, ACh不能诱导体外培养的人垂体腺瘤细胞发生凋亡, 其凋亡指数与其他各组相比无明显差异。
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2.3 ACh对垂体腺瘤细胞增殖和DNA合成的影响
酶消化法制备的垂体腺瘤细胞为单个、散在、圆形, 折光性强, 轮廓清晰。18 h后细胞贴壁, 48 h后部分细胞开始生长, 细胞仍呈圆形或近圆形。部分细胞散在而部分细胞聚集在一起,并可重叠生长。
2.4 ACh对垂体腺瘤细胞增殖周期的影响
由于ACh对三种类型的人垂体腺瘤细胞增殖代谢的影响均表现出类似的抑制作用, 故将三种类型的垂体腺瘤细胞在10 μmol/L ACh的条件下培养24 h后作流式细胞仪测定细胞周期变化的结果进行统一分析。结果发现, G1期的细胞比例从对照组的68.2±3.9%上升为93.3±4.2%; S期的细胞比例从对照组的12.2±3.1%下降为1.6±0.7%; G2期的细胞比例从对照组的19.6±2.8%下降为5.1±2.0%。表明10 μmol/L ACh能减少垂体腺瘤细胞进入S、G2期的细胞比例, 而使处于G1期的细胞比例增加(P<0.01,)。而在ACh(10 μmol/L)加阿托品(10 μmol/L)的条件下培养24 h后的细胞比例与对照组相比无明显差异(P>0.05)。
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3讨论
人垂体前叶至少有6种内分泌细胞, 每一种分泌细胞都可合成和分泌多种旁分泌因子作用于本身或其他细胞, 同时又作为靶细胞接受本身和其他细胞的旁分泌因子的作用[2,10]。在垂体前叶发现的活性物质有几十种之多, ACh便是其中之一。由于ACh大部分是由胆碱能神经细胞合成和释放, 正常情况下释放后在局部起作用, 然后由乙酰胆碱酯酶迅速水解或回摄, 很难作远距离扩散。而且, 目前尚未发现垂体前叶有直接的胆碱能神经支配的证据, 因此, 垂体前叶细胞或垂体腺瘤细胞是否能够合成ACh, 是ACh在垂体前叶能否发挥作用的一个关键问题。由于ChAT是合成ACh的限速酶, 因此, ChAT的存在与否则是表明垂体前叶细胞能否合成与释放ACh的关键。
既往研究表明, 多种动物的正常垂体前叶细胞及肿瘤细胞都可以合成并分泌ACh。正常的促肾上腺皮质激素细胞及其肿瘤细胞均能合成并释放乙酰胆碱[3]。大鼠GH3细胞也能释放ACh, 当对实验中的GH3细胞停止灌流时, GH3细胞释放的ACh会逐渐升高并表现出对GH3细胞的影响, 而一旦加入阿托品后ACh的影响则立即消失[4,5]。Strien在对蟾蜍的研究中发现促黑素细胞内均含有ChAT, 可在体外合成ACh, ACh能增加促黑素细胞的活性[11]。我们应用免疫组织化学的方法, 表明在人的正常垂体前叶细胞及人无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤细胞的胞浆内均明显存在ChAT阳性染色。说明ACh可以在垂体前叶细胞内和/或垂体腺瘤细胞内合成并释放, 提示ACh能够在垂体前叶内和/或垂体腺瘤内以旁分泌或自分泌的形式起作用, 影响着垂体前叶细胞的分泌功能以及细胞的增殖与分化。
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尽管ACh是第一个被证明的神经递质, 但由于定量和组织化学显示较困难, 关于ACh的研究远不如单胺类递质。早在80年代初就有学者开始研究ACh与腺垂体功能的关系, 但到目前为止, ACh作用的研究基本限于ACh对垂体分泌功能的影响, 即便如此, 也尚未取得一致性的认识。Wood[6]证明, ACh能够增加培养的牛腺垂体细胞内的钙浓度, 进而增加生长激素(growth hormone, GH)的分泌, Pinter[8]却观察到, ACh对新生大鼠(<3周)垂体分泌GH有刺激作用, 但对成年大鼠没有作用。关于ACh对催乳素分泌的影响同样看法不一致[7]。这些结果的差异可能与实验方法不一及种属差异有关。而ACh对垂体前叶细胞增殖代谢的影响更是不清楚, 仅Fedotov[9]观察了ACh对不同年龄组大鼠垂体细胞总蛋白及DNA合成的影响。 他们发现, ACh可减少青春期大鼠垂体细胞总蛋白合成, 但对新生鼠无影响, 而且对新生鼠垂体细胞DNA合成亦无影响。近来资料表明, 鼠垂体前叶细胞表面存在着功能性的M型胆碱能受体[12], 该受体可以调节GH3细胞的Ca2+的振荡频率[13], 提示ACh能够以旁分泌或自分泌的方式作用于垂体前叶细胞。但到目前为止, ACh对人垂体腺瘤细胞的影响尚未见报道。
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本实验发现, ACh对三种垂体腺瘤: 催乳素瘤、无功能瘤和生长激素瘤都具有明显的抑制细胞增殖代谢的作用, 依ACh作用浓度的不同(0.1~10 μmol/L), 抑制的程度也不同, 从10%左右到近40%, 呈现明显的剂量依赖效应。ACh+Atropine (10 μmol/L)组中, ACh的抑制作用消失, 而ACh+Tubocurarine (10 μmol/L)组中, ACh的抑制作用仍然存在, 表明ACh对垂体腺瘤细胞增殖的抑制作用可被乙酰胆碱M受体拮抗剂阻断, 而乙酰胆碱N受体拮抗剂对此作用无影响, 提示ACh对垂体腺瘤细胞增殖和代谢的抑制作用是通过M型受体起作用的。这与目前在垂体前叶细胞膜表面仅有M1、M3受体发现的结果相一致[12]。M型乙酰胆碱受体的激动剂, 碳酰胆碱(carbachol)对三种垂体腺瘤细胞的增殖和DNA合成的抑制作用进一步证实了这一点。流式细胞仪检测细胞周期的结果发现, ACh可使垂体腺瘤细胞阻滞于G1期, 使进入S期和G2期的细胞减少, 同样表明人垂体腺瘤细胞经ACh作用后DNA合成减少, 细胞的增殖受抑制。
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本实验还选用了两种方法来检测ACh对培养人垂体腺瘤细胞凋亡的影响: 流式细胞仪检测DNA含量的PI染色法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP nick end labeling, TUNEL)。前者方法简便易行并可定量检测, 但其敏感性较差: 因为凋亡早期虽有DNA裂点出现, 但尚未出现DNA片段的大量丢失, 因此该方法检测不出早期凋亡细胞。后者灵敏性及特异性均较高, 两者结合可以较好地反映出细胞凋亡的真实情况。应用这两种检测方法, 我们观察到培养垂体腺瘤细胞在ACh、碳酰胆碱等因素处理后, 未检测到明显的凋亡指征。提示ACh仅对培养人垂体腺瘤细胞的增殖代谢和DNA合成有抑制作用, 但不诱导其凋亡。
我们的实验结果表明, ACh可以明显抑制体外培养人垂体腺瘤细胞的增殖代谢, 这种作用是普遍性的, 对无功能瘤细胞、催乳素瘤细胞和生长激素瘤细胞均有明显的抑制作用。深入研究这种调控作用的机制, 将有助于了解垂体瘤的发生、侵袭机制和认识垂体的旁分泌通讯网络, 也将有可能对垂体瘤的治疗产生推动作用。
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参考文献
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关键词：乙酰胆碱；垂体；腺瘤；增殖；凋亡
摘要：为了解乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)在人垂体腺瘤发生、发展中的作用, 本研究首先观察了人垂体腺瘤细胞内是否存在合成ACh必需的胆碱乙酰转移酶, 并应用MTT实验、[3H]TdR掺入实验、细胞周期分析和TUNEL法测定了ACh对体外培养的人垂体无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果发现: (1)三种垂体腺瘤细胞中均有胆碱酯酶的表达, 但明显少于正常垂体; (2)ACh对三种类型的人垂体腺瘤细胞增殖代谢的影响相类似, 不同浓度的ACh能明显抑制体外培养的三种人垂体腺瘤细胞的增殖, 呈明显的剂量效应关系, 同时ACh能减少垂体腺瘤细胞进入S、G2期的细胞比例, 而使处于G1期的细胞比例增加; (3)ACh的这种作用可被阿托品阻断, 但不受筒箭毒的影响; (4)ACh对体外培养的三种人垂体腺瘤细胞凋亡无明显影响。该结果提示, ACh可能以旁分泌或自分泌的方式作用于垂体前叶细胞, 对垂体腺瘤细胞增殖分化有调控作用, 而且是通过ACh M受体来实现的。
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研究表明, 多种动物的正常垂体前叶细胞及肿瘤细胞都可以合成并分泌ACh[3~5]。但是, 人垂体腺瘤细胞是否也可以合成、分泌ACh尚无直接的证据。而且, 虽然早在80年代初就有学者开始研究ACh与腺垂体功能的关系, 但到目前为止, 关于ACh作用的研究基本限于ACh对垂体和对垂体腺瘤细胞系的分泌功能的影响。由于实验方法的不同以及所使用的实验对象的不同, 众多学者对所观察到的结果尚未取得一致性的认识[6~8]。关于ACh对垂体前叶细胞增殖代谢的影响更无直接研究资料, 仅Fedotov观察了ACh对不同年龄组大鼠垂体细胞总蛋白及DNA合成的影响, 结果发现, ACh可减少青春期大鼠垂体细胞总蛋白合成, 但对新生鼠无影响, 而且ACh对新生鼠垂体细胞DNA合成亦无影响[9]。因此, 本实验通过免疫组化观察人的正常垂体前叶细胞及人无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤细胞的胞浆内是否存在合成ACh的限速酶胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase, ChAT), 并利用多种手段探讨ACh对培养的人三种垂体腺瘤细胞增殖及凋亡的影响。
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1.1 材料 新鲜人垂体腺瘤手术标本56例, 其中无功能瘤20例, 催乳素瘤25例, 生长激素瘤11例, 由西京医院神经外科提供, 诊断均经临床表现和病理组织学检查证实。将手术取下的瘤组织置于无菌生理盐水中暂时保存。正常人垂体标本(尸检标本)由本校病理学教研室提供。
1.2 主要试剂和药品 ACh、胶原酶、胰蛋白酶、DNA酶、MTT(噻唑蓝)购自美国Sigma公司; DF-12培养基购自美国Gibco公司; 新生牛血清为杭州四季青生物制品公司产品; [3H]TdR购自上海原子能科学研究院。
1.3 免疫组织化学 取垂体腺瘤组织放入Bouin′s固定液中固定4 h (正常人垂体的尸检标本经多聚甲醛常规固定), 用系列酒精脱水, 二甲苯透明, 常规石蜡包埋, 切片(厚5 μm), 脱蜡入水, 100% 甲醇+0.3% H2O2处理10 min, 以去除内源性过氧化物酶活性, 用10% BSA封闭非特异抗原。滴加兔抗人ChAT多克隆抗体(Sigma公司, 工作浓度为1∶1000, 稀释液为含10 g/L BSA, 3 ml/L Triton X-100和1 g/L NaN3的0.01 mol/L PBS)于载玻片上, 4℃孵育48 h, 然后行ABC法免疫组织化学染色, DAB呈色。脱水、 透明、 中性树胶封片, 镜检观察, 对胞浆有明确棕黄色着色者判定为阳性细胞。空白对照用抗体稀释液代替一抗。
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1.4 垂体腺瘤细胞的分离和培养 在超净台内, 用DF-12培养液清洗瘤组织的血液3次, 置于青霉素小瓶中剪碎至糊状, 分别加入2.5 g/L胰蛋白酶、6.7 mkat/L的胶原酶、3.3 mkat/L的DNA酶各5 ml, 37℃水浴振摇消化25 min, 加牛血清, 用200目滤网过滤, 离心弃上清, 加DF-12培养液, 轻轻吹起细胞, 离心弃上清, 加含100 ml/L胎牛血清的DF-12培养液, 轻轻吹起细胞, 调整为5×108/L, 并接种于96孔板, 每孔100 μl, 移入CO2孵箱中, 在37℃、 50 ml/L CO2及饱和湿度条件下培养。24 h换液, 之后48 h换液1次。
1.5 MTT试验 垂体腺瘤细胞培养至第6天换无血清DF-12培养液, 24 h后换含不同浓度的ACh (0.1、1 和10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+阿托品 (10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+筒箭毒 (10 μmol/L)和碳酰胆碱(10 μmol/L)的无血清DF-12培养液。 对照组为无血清DF-12培养液, 每组设5个重复孔。孵育24 h, 每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl, 继续孵育4 h, 终止培养。 小心吸弃孔内上清液, 每孔加入DMSO 150 μl, 振荡10 min, 选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A490 nm值), 记录结果, 计算变化率, 变化率(%)＝(实验组A490 nm值/对照组A490 nm值)×100。
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1.6 [3H]TdR掺入实验 垂体腺瘤细胞培养至第6天换无血清DF-12培养液, 24 h后换含不同浓度的ACh (0.1、1 和10 μmol/L)、ACh(10 μmol/L)+阿托品(10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+筒箭毒(10 μmol/L)和碳酰胆碱(10 μmol/L)的无血清DF-12培养液, 对照组为无血清DF-12培养液, 每组设5个重复孔。24 h后, 每孔加入[3H]TdR(1.85 MBq/L), 继续孵育12 h, 终止反应。 经ZT-2型微量多头细胞收集器收集细胞于9999型玻璃纤维滤纸上, 滤纸经红外线烘干后置入闪烁瓶中, 加入PPO/POPOP/二甲苯闪烁液, 用液闪计数器进行[3H]TdR掺入率的测定, 记录cpm值, 计算变化率, 变化率(%)＝(实验组cpm值/对照组cpm值)×100。
1.7 用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期 垂体腺瘤细胞分离方法和细胞悬液浓度同上, 取1.5 ml接种于25 ml培养瓶中, 在CO2孵箱中培养, 条件同上。24 h换液, 之后48 h换液1次, 第6天换无血清DF-12培养液, 24 h后换含ACh (10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+阿托品 (10 μmol/L)、ACh(10 μmol/L)+筒箭毒(10 μmol/L)和碳酰胆碱(10 μmol/L)的无血清培养液。 对照组为无血清DF-12培养液, 继续孵育24 h后, 用2.5 g/L胰蛋白酶-0.2 g/LEDTA消化, 离心, 收集细胞, PBS洗2次, 1000 r/min离心5 min, 吸弃上清, 加PBS 1 ml, 轻轻吹匀细胞, 加无水乙醇2 ml固定。用FCM EPICS Profile Ⅱ型测定细胞周期。
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1.8 TUNEL实验检测细胞凋亡 培养至第6天, 吸弃8孔载玻片盒内的培养液, 分别加入含不同浓度的ACh(0.1、1 和10 μmol/L)、ACh(10 μmol/L)+阿托品(10 μmol/L)、ACh (10 μmol/L)+筒箭毒 (10 μmol/L) 和碳酰胆碱 (10 μmol/L) 的无血清DF-12培养液。 阴性对照组为含1 ml/L二甲基亚砜的50 g/L胎牛血清培养液。孵育48 h, 吸弃培养液, 40 g/L多聚甲醛固定25 min, 0.01 mol/L PBS洗5 min×3次。用TUNEL(Tdt-mediated dUTP nick end labeling)试剂盒的方法, 采用末端探针标记检测凋亡细胞。在每例每组(8孔板的1孔)中, 计数10个视野(20×物镜)中凋亡细胞的百分比作为凋亡指数(apoptosis index, AI)。
1.9 实验分组及统计学分析 所有数据均以mean±SD表示, 两组间均数比较用t检验处理, 多组间均数采用Origin 5.0软件中单因素方差分析进行统计学处理。
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2结果
2.1 胆碱乙酰转移酶在人正常垂体及人垂体腺瘤中的表达
ABC免疫组织化学法证实, 人正常垂体及人垂体无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤中均有胆碱乙酰转移酶的表达, 但表达ChAT 的阳性细胞数量明显不同。人三种垂体腺瘤表达ChAT 的阳性细胞数量较少, 散在分布, 但染色呈强阳性, 以DAB显色, 可见棕黄色颗粒分布于细胞浆中。正常人垂体表达ChAT 的阳性细胞数量较多, 大部分细胞胞浆内可见棕黄色颗粒, 但强度较垂体腺瘤细胞弱。由于该例正常人垂体并非严格意义上的正常垂体, 因而部分细胞可见明显空泡化。
2.2 ACh对人垂体腺瘤细胞凋亡的影响
凋亡细胞经TUNEL染色后表现为细胞核的棕黄色着色。ACh虽然可抑制体外培养的人垂体腺瘤细胞的增殖代谢, 但TUNEL检测结果表明, ACh不能诱导体外培养的人垂体腺瘤细胞发生凋亡, 其凋亡指数与其他各组相比无明显差异。
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2.3 ACh对垂体腺瘤细胞增殖和DNA合成的影响
酶消化法制备的垂体腺瘤细胞为单个、散在、圆形, 折光性强, 轮廓清晰。18 h后细胞贴壁, 48 h后部分细胞开始生长, 细胞仍呈圆形或近圆形。部分细胞散在而部分细胞聚集在一起,并可重叠生长。
2.4 ACh对垂体腺瘤细胞增殖周期的影响
由于ACh对三种类型的人垂体腺瘤细胞增殖代谢的影响均表现出类似的抑制作用, 故将三种类型的垂体腺瘤细胞在10 μmol/L ACh的条件下培养24 h后作流式细胞仪测定细胞周期变化的结果进行统一分析。结果发现, G1期的细胞比例从对照组的68.2±3.9%上升为93.3±4.2%; S期的细胞比例从对照组的12.2±3.1%下降为1.6±0.7%; G2期的细胞比例从对照组的19.6±2.8%下降为5.1±2.0%。表明10 μmol/L ACh能减少垂体腺瘤细胞进入S、G2期的细胞比例, 而使处于G1期的细胞比例增加(P<0.01,)。而在ACh(10 μmol/L)加阿托品(10 μmol/L)的条件下培养24 h后的细胞比例与对照组相比无明显差异(P>0.05)。
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3讨论
人垂体前叶至少有6种内分泌细胞, 每一种分泌细胞都可合成和分泌多种旁分泌因子作用于本身或其他细胞, 同时又作为靶细胞接受本身和其他细胞的旁分泌因子的作用[2,10]。在垂体前叶发现的活性物质有几十种之多, ACh便是其中之一。由于ACh大部分是由胆碱能神经细胞合成和释放, 正常情况下释放后在局部起作用, 然后由乙酰胆碱酯酶迅速水解或回摄, 很难作远距离扩散。而且, 目前尚未发现垂体前叶有直接的胆碱能神经支配的证据, 因此, 垂体前叶细胞或垂体腺瘤细胞是否能够合成ACh, 是ACh在垂体前叶能否发挥作用的一个关键问题。由于ChAT是合成ACh的限速酶, 因此, ChAT的存在与否则是表明垂体前叶细胞能否合成与释放ACh的关键。
既往研究表明, 多种动物的正常垂体前叶细胞及肿瘤细胞都可以合成并分泌ACh。正常的促肾上腺皮质激素细胞及其肿瘤细胞均能合成并释放乙酰胆碱[3]。大鼠GH3细胞也能释放ACh, 当对实验中的GH3细胞停止灌流时, GH3细胞释放的ACh会逐渐升高并表现出对GH3细胞的影响, 而一旦加入阿托品后ACh的影响则立即消失[4,5]。Strien在对蟾蜍的研究中发现促黑素细胞内均含有ChAT, 可在体外合成ACh, ACh能增加促黑素细胞的活性[11]。我们应用免疫组织化学的方法, 表明在人的正常垂体前叶细胞及人无功能瘤、催乳素瘤和生长激素瘤等三种垂体腺瘤细胞的胞浆内均明显存在ChAT阳性染色。说明ACh可以在垂体前叶细胞内和/或垂体腺瘤细胞内合成并释放, 提示ACh能够在垂体前叶内和/或垂体腺瘤内以旁分泌或自分泌的形式起作用, 影响着垂体前叶细胞的分泌功能以及细胞的增殖与分化。
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尽管ACh是第一个被证明的神经递质, 但由于定量和组织化学显示较困难, 关于ACh的研究远不如单胺类递质。早在80年代初就有学者开始研究ACh与腺垂体功能的关系, 但到目前为止, ACh作用的研究基本限于ACh对垂体分泌功能的影响, 即便如此, 也尚未取得一致性的认识。Wood[6]证明, ACh能够增加培养的牛腺垂体细胞内的钙浓度, 进而增加生长激素(growth hormone, GH)的分泌, Pinter[8]却观察到, ACh对新生大鼠(<3周)垂体分泌GH有刺激作用, 但对成年大鼠没有作用。关于ACh对催乳素分泌的影响同样看法不一致[7]。这些结果的差异可能与实验方法不一及种属差异有关。而ACh对垂体前叶细胞增殖代谢的影响更是不清楚, 仅Fedotov[9]观察了ACh对不同年龄组大鼠垂体细胞总蛋白及DNA合成的影响。 他们发现, ACh可减少青春期大鼠垂体细胞总蛋白合成, 但对新生鼠无影响, 而且对新生鼠垂体细胞DNA合成亦无影响。近来资料表明, 鼠垂体前叶细胞表面存在着功能性的M型胆碱能受体[12], 该受体可以调节GH3细胞的Ca2+的振荡频率[13], 提示ACh能够以旁分泌或自分泌的方式作用于垂体前叶细胞。但到目前为止, ACh对人垂体腺瘤细胞的影响尚未见报道。
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本实验发现, ACh对三种垂体腺瘤: 催乳素瘤、无功能瘤和生长激素瘤都具有明显的抑制细胞增殖代谢的作用, 依ACh作用浓度的不同(0.1~10 μmol/L), 抑制的程度也不同, 从10%左右到近40%, 呈现明显的剂量依赖效应。ACh+Atropine (10 μmol/L)组中, ACh的抑制作用消失, 而ACh+Tubocurarine (10 μmol/L)组中, ACh的抑制作用仍然存在, 表明ACh对垂体腺瘤细胞增殖的抑制作用可被乙酰胆碱M受体拮抗剂阻断, 而乙酰胆碱N受体拮抗剂对此作用无影响, 提示ACh对垂体腺瘤细胞增殖和代谢的抑制作用是通过M型受体起作用的。这与目前在垂体前叶细胞膜表面仅有M1、M3受体发现的结果相一致[12]。M型乙酰胆碱受体的激动剂, 碳酰胆碱(carbachol)对三种垂体腺瘤细胞的增殖和DNA合成的抑制作用进一步证实了这一点。流式细胞仪检测细胞周期的结果发现, ACh可使垂体腺瘤细胞阻滞于G1期, 使进入S期和G2期的细胞减少, 同样表明人垂体腺瘤细胞经ACh作用后DNA合成减少, 细胞的增殖受抑制。
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本实验还选用了两种方法来检测ACh对培养人垂体腺瘤细胞凋亡的影响: 流式细胞仪检测DNA含量的PI染色法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP nick end labeling, TUNEL)。前者方法简便易行并可定量检测, 但其敏感性较差: 因为凋亡早期虽有DNA裂点出现, 但尚未出现DNA片段的大量丢失, 因此该方法检测不出早期凋亡细胞。后者灵敏性及特异性均较高, 两者结合可以较好地反映出细胞凋亡的真实情况。应用这两种检测方法, 我们观察到培养垂体腺瘤细胞在ACh、碳酰胆碱等因素处理后, 未检测到明显的凋亡指征。提示ACh仅对培养人垂体腺瘤细胞的增殖代谢和DNA合成有抑制作用, 但不诱导其凋亡。
我们的实验结果表明, ACh可以明显抑制体外培养人垂体腺瘤细胞的增殖代谢, 这种作用是普遍性的, 对无功能瘤细胞、催乳素瘤细胞和生长激素瘤细胞均有明显的抑制作用。深入研究这种调控作用的机制, 将有助于了解垂体瘤的发生、侵袭机制和认识垂体的旁分泌通讯网络, 也将有可能对垂体瘤的治疗产生推动作用。
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参考文献
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