白介素-1β 通过JNK/p38信号转导通路调控肾系膜细胞表达α-平滑肌肌动蛋白
1北京大学第一医院肾内科；2北京大学肾脏病研究所；北京 100034 王玉1；李晓玫2*；王海燕1
关键词：平滑肌肌动蛋白；系膜细胞；白细胞介素-1；丝裂素原活化蛋白激酶
摘要：为探讨细胞内丝裂素原活化蛋白激酶(MAPK)家族各亚类信号转导通路在炎症性细胞因子白介素-1β (IL-1β )对大鼠肾系膜细胞(rMC)表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及其分布中的调控作用, 以IL-1β (10 ng/ml)刺激体外培养的rMC, 用电穿孔基因转染及免疫杂交法观察IL-1β 对α-SMA基因启动子活性及蛋白表达的作用, 并用共聚焦荧光显微镜及透射电镜观察IL-1β 刺激前后细胞内α-SMA及微丝的分布变化。通过应用PD98059和SB203580特异阻断ERK和 p38通路、共转染显性失活JNKK基因特异阻断JNK通路, 观察阻断对IL-1β 刺激所致α-SMA表达或启动子活性的影响。结果显示, IL-1β 刺激6 h可明显上调α-SMA启动子活性, 在1~2 d内显著促进其蛋白合成; IL-1β 刺激24 h后, 细胞内α-SMA及微丝在细胞核周的分布增加。阻断ERK通路对IL-1β 诱导的α-SMA表达无明显影响; 阻断JNK及p38通路均可使IL-1β 诱导的α-SMA表达明显受抑; 阻断p38通路的作用比阻断JNK通路更强, 而且对基础状态的α-SMA表达也有抑制作用。上述结果提示, IL-1β 可刺激rMC发生表型转化, 其表型标志物α-SMA可通过基因转录增强而增加蛋白表达, 在细胞内的分布向核周转位积聚。JNK及p38通路是介导IL-1β 刺激rMC α-SMA表达的主要信号转导途径, 而ERK通路不影响IL-1β 的这一作用。
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系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是我国最为常见的免疫介导性肾小球疾病。免疫损伤可使肾小球局部浸润的炎症细胞释放多种炎症介质, 刺激并活化肾小球系膜细胞(MC), 使之从正常的静止表型转化为增殖/分泌表型。表型转化的MC可异常增殖, 表达细胞骨架蛋白或胚胎期蛋白, 自分泌炎症介质, 合成分泌细胞外基质增加等, 进而主动参与肾小球疾病的进展及肾小球硬化的发生[1]。国外学者和我们的研究均已证实, 细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的高表达是MC增殖/分泌表型的良好标志物, 在人类MsPGN中其表达与MC异常增殖及细胞外基质积聚程度密切相关[1,2]。然而, 各种炎症介质如何影响MC的表型转化及其细胞内调控机制迄今知之甚少。
白细胞介素-1β (IL-1β )是MsPGN中刺激MC活化的主要细胞因子之一, 在动物和人类肾炎过程中均已证实MC可分泌IL-1β 并表达其受体[3]。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族作为细胞内一类重要的信号转导分子, 其不同亚类可调控细胞增殖、凋亡、应激、分化等多种生物学效应[4]。我们曾发现血小板源生长因子(PDGF)对MC表达α-SMA的影响可能是通过MAPK 家族中的Raf-1和JNK活性变化调控的[5]。国外研究发现, 外源性IL-1β 在不同细胞中可激活MAPK的不同亚类, 我们也曾证实IL-1β 可刺激MC的JNK活化[6], 但MAPK各亚类信号转导通路对IL-1β 引起的MC表型改变是否具有调控作用目前尚未见报道。本研究中, 我们通过探讨IL-1β 对大鼠系膜细胞(rMC)表达α-SMA的影响以及MAPK家族各亚类信号转导通路的调控作用, 以期进一步加深对MsPGN发病机制的认识。
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1材料和方法
1.1 主要试剂 IL-1β 购自美国R&D公司, MEK-1特异阻断剂PD98059购自英国Biolabs公司, p38特异阻断剂SB203580购自美国Biochem公司。RPMI-1640培养液及蛋白电泳分子量标准品均购自美国GIBCO公司, 胎牛血清购自美国Hyclone公司。小鼠抗α-SMA单克隆抗体购自德国Boehringer Mannheim公司, 单克隆小鼠抗人P-JNK抗体、多克隆兔抗JNK1抗体购自美国Santa Cruz公司。Maxi Plasmid Kit购自德国QIAGEN公司。
1.2 质粒扩增、提取及纯化 所用质粒均由美国科罗拉多大学医学中心Raphael A. Nemenoff教授提供, 包括(1) α-SMA启动子(α-SMA-promotor)质粒: 7110 bp, 载体为PA3-Luciferase, 插入的α-SMA启动子片段为764 bp, 两端均可为限制性内切酶HindIII识别。(2) β-半乳糖苷酶(β-gal)质粒: 6900 bp, 具有可被限制性内切酶HindIII识别的单位点。(3) PA3-luciferase质粒: 6356 bp, 为α-SMA启动子的载体, 用作模拟转染(Mock)。(4) D-JNKK(SEC1)质粒: 显性失活JNKK, 4500 bp, 以SRα3为载体, 插入片段两端可为HindIII和Xba1识别。采用氯化钙法制备感受态细菌(DH-5α), 进行质粒转化、扩增, 然后用质粒提取纯化试剂盒(QIAGEN公司)进行提取与纯化。所有质粒经酶切鉴定均符合质粒图谱。
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1.3 rMC培养 正常rMC按本所常规方法培养鉴定。手术分离雄性SD大鼠(150～200 g)肾脏, 切碎研磨, 分别通过140、80、240目筛网过滤收集肾小球, 经胶原酶消化后, 用含20%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养液, 在37℃、95%空气、5%二氧化碳的条件下进行原代培养, 并经过常规相差显微镜形态学、透射电镜行超微结构及免疫组化染色等鉴定, 证实符合系膜细胞表型特征; 实验中采用第3～12代细胞。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞刺激方法 细胞根据实验需要以适当密度转种于细胞培养板或培养皿中, 在正常培养条件下生长适当时间。于实验前换用含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培养液继续培养24 h, 使其处于生长静止状态。然后加入IL-1β 10 ng/ml分别在不同时间内予以刺激, 以不加刺激的细胞为正常对照。
1.4.2 α-SMA的表达与分布检测
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(1) α-SMA蛋白表达检测: 采用蛋白质免疫印迹法。IL-1β 分别刺激2、6、24、48和72 h。各组细胞裂解后取5 μg蛋白为样品, 行10%SPS-PAGE电泳, 经90 V恒压电转移2 h, 将样品蛋白转移至硝酸纤维素膜上, 经封闭、洗膜, 在室温下与1∶1000稀释的抗α-SMA抗体反应1 h, 再经洗膜数次并与羊抗鼠HRP-IgG孵育后进行化学发光反应, X线胶片曝光显示条带并经扫描后定量。
(2) α-SMA启动子基因转染及活性测定: 采用电穿孔法。100 μl细胞悬液(3×106/ml)与α-SMA启动子质粒15 μg和β -gal 质粒5 μg于打孔杯内充分混匀, 以细胞外基质630基因转导仪进行电打孔基因转染。转染后细胞种入培养皿中, 加适量含20% FCS的培养液, 于孵箱中培养24 h后用于实验。IL-1β 刺激时间为3、6和24 h。各组细胞分别以发光仪(LKB-1251)检测萤火虫荧光素酶(luciferase)和β-gal 的活性, α-SMA启动子活性为同一样品中经β-gal 活性校正转染效率后的萤火虫荧光素酶活性, 实验结果以实验组与空质粒转染组的比值表示。
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(3) α-SMA细胞内分布: 细胞转种于盖玻片上, 加IL-1β刺激24 h。细胞经冷丙酮固定、1% BSA封闭后行免疫荧光染色(小鼠抗α-SMA单克隆抗体1∶50, 4℃孵育过夜; FITC标记抗小鼠IgG 1∶50, 37℃孵育30 min), 于共聚焦荧光显微镜下观察α-SMA染色情况。对照组与IL-1β 刺激组均各取6～8个视野, 每个视野中≥3个细胞, 分别测定每个细胞及其核周固定区域的平均灰度值, 计算α-SMA核周分布量占总细胞分布量的比值。
(4) 细胞超微结构变化: 正常或IL-1β 刺激后细胞经离心沉淀, 加1%戊二醛固定30 min后, 常规包埋、切片, 用透射电镜观察细胞的变化。
1.4.3 MAPK各亚类通路的阻断实验
(1) ERK和p38通路的阻断: 分别给予50 μmol/L的 MEK-1特异阻断剂PD98059 或50 μmol/L的p38特异阻断剂 SB203580预孵育细胞24 h, 然后给予IL-1β 刺激24 h, 再按前述检测α-SMA蛋白表达。
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(2) JNK通路的阻断: 将D-JNKK质粒按前述方法与α-SMA启动子质粒进行共转染, 细胞经IL-1β 刺激5、20和60 min后, 采用蛋白质免疫印迹法分别用磷酸化抗体(P-JNK)和非磷酸化抗体(JNK)(稀释度均为1∶ 2000)进行免疫杂交及条带扫描定量确认JNK活性测定变化。于IL-1β 刺激6、24 h后检测α-SMA启动子活性及蛋白表达变化。
(3) JNK和p38通路的双重阻断: 按上法对D-JNKK转染的细胞于IL-1β 刺激前预先给予50 μmol/L SB203580预孵育24 h, 随后检测α-SMA蛋白表达变化。
1.5 统计学处理 实验结果以mean±SD表示, 各组间比较用ANOVA或t检验分析, 数据用Instat 3.0软件处理, P<0.05被认为差异有统计学意义。
2结果
, http://www.100md.com 2.1 IL-1β 刺激α-SMA表达的特点
IL-1β 刺激6 h即可明显激活α-SMA启动子的活性; 刺激24 h后, IL-1β 对α-SMA启动子的激活作用已经消失。IL-1β 作用早期(2～6 h)对rMC合成α-SMA蛋白无明显影响, 至刺激24 h可明显上调α-SMA蛋白表达, 到72 h其刺激作用基本消失。
2.2 IL-1β 刺激后α-SMA细胞内分布的变化
正常情况下, rMC的α-SMA表达水平很低, 主要呈丝样结构, 贯穿细胞全长, 细胞核无着染。IL-1β 刺激后α-SMA表达量明显增加, 荧光染色增强, 除仍有如前的分布外, 细胞核周还出现α-SMA免疫荧光染色的聚集(图2A、 B)。对核周α-SMA免疫荧光染色分布量占总细胞的比值计算结果显示, IL-1β 刺激组核周α-SMA分布(0.86±0.09, n=46)较对照组(0.61±0.07, n=49)明显增多(P<0.001)。
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2.3 细胞超微结构改变
IL-1β 刺激后细胞内微丝样结构较对照组增多, 并伴有核周分布增多。
2.4 ERK信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用
单纯应用MEK-1特异阻断剂PD98059作用后rMC的α-SMA表达(30288±19299)与基础状态时(33674±20668)无明显差异。在IL-1β 刺激的同时加用PD98059(39717±19144)也未能抑制IL-1β 刺激24 h导致的α-SMA表达上调反应(40196±21037)。
2.5 p38信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用
加入p38信号通路阻断剂SB203580后, 可使基础状态rMC表达α-SMA减少51.4%, 并可明显抑制IL-1β 刺激24 h导致的α-SMA表达上调(70.5%)。
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2.6 JNK信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用
转染显性失活JNKK基因的rMC该基因表达的JNKK蛋白不能被磷酸化, 同时D-JNKK还可抑制正常的JNKK磷酸化, 因而使其下游的JNK不能激活, 从而阻断JNK通路。本组中转染细胞的JNK蛋白表达无差异, 而其活性明显降低, 证实对JNK通路阻断是成功的。
阻断JNK通路后, 对rMC基础状态的α-SMA启动子活性和蛋白表达无明显影响, 但可使IL-1β 刺激6 h上调的α-SMA启动子活性被抑制, 并可抑制IL-1β 刺激24 h对α-SMA表达的上调作用。
2.7 双重阻断JNK及p38通路对IL-1β 刺激α-SMA表达的影响
应用D-JNKK基因和SB203580共同作用可使rMC的α-SMA基础表达及IL-1β 刺激的α-SMA表达水平明显下降, 分别为原水平的9.5%和7.8%。
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3讨论
细胞表型转化是指细胞在特定的生理或病理情况下发生的分化或去分化, 常表现为细胞形态、结构的重塑及其功能改变, 前者呈现细胞骨架及胚胎期蛋白的表达变化和重组, 后者涉及细胞收缩、迁移、异常增殖、膜蛋白脱落、转运功能异常以及与邻近细胞或细胞外基质的关系异常等等。近年来, 人们对肾小球炎症早期MC的异常增殖和晚期硬化时系膜区细胞外基质的合成与降解失调均已有了 较深入的认识, 但对于调控MC表型转化的细胞内关键信号尚了解甚少。
IL-1β 作为肾小球炎症发病过程中关键的病变进展调控因子, 可从多方面调控肾小球炎症及病变进展过程[3,7]。本研究观察到短时间(6 h)IL-1β 刺激即可使α-SMA启动子活性上升约3倍, 并继而出现蛋白表达增加, 其刺激作用可延续48 h, 证实IL-1β 刺激MC α-SMA表达增加是通过诱导其基因表达使蛋白合成增加所致, 验证了IL-1β 对MC确有诱导表型转化的作用。目前关于IL-1β 调控α-SMA 表达的细胞内信号转导机制国内外均未见报道。MAPKs作为广泛分布于胞浆内的具有丝/苏氨酸双重磷酸化的蛋白激酶, 主要包括ERK、 JNK/SAPK和p38亚类, 在调控细胞外信号引起细胞核内与细胞增殖、分化相关基因转录的方面具有极其重要的作用[4]。其中, ERK主要与传递一些多肽类丝裂原刺激的细胞内信号有关, 与细胞增殖反应关系密切; 而JNK/SAPK与p38亚类则是介导细胞因子及应激刺激导致的细胞凋亡、分化及炎性反应的重要细胞内信号转导途径。已有研究显示, IL-1β 在不同的细胞中可能通过活化MAPKs中的不同亚类, 引起增殖/凋亡、 细胞分化等不同反应。在本研究中, 我们应用特异阻断的方法， 观察了MAPKs的三个不同亚类在介导IL-1β 诱导MC表达α-SMA的信号传递中的作用。本室在既往研究PDGF对rMC的作用中曾发现, ERK活化主要与其刺激DNA合成速率增高相关, 可能部分参与对α-SMA表达的调控[5,8]。在本实验中, 应用MEK1的特异阻断剂PD98059阻断ERK通路后, 未能影响IL-1β 刺激α-SMA表达上调的作用, 提示ERK通路不是介导IL-1β 刺激MC表达α-SMA的主要信号转导途径。已有证据表明, IL-1β 可在5~30 min内迅速激活JNK和p38激酶 [6,9]。本室以往在raf-1基因持续高表达的rMC中曾观察到, JNK基础活性减低的同时伴有α-SMA蛋白表达的缺失, 提示JNK活性的存在可能与α-SMA表达调控有关[8]。在本实验中, 当用显性失活的D-JNKK质粒转入系膜细胞后, 可以观察到IL-1β 诱导的JNK活化受到抑制, 同时也明显抑制了IL-1β 对α-SMA启动子活性及其蛋白表达的刺激作用, 证实IL-1β 诱导α-SMA表达的信号转导过程部分通过JNK通路所介导。进一步应用SB203580特异性阻断p38通路得到了与阻断JNK通路相似的结果, 即阻断p38通路也可抑制IL-1β 对α-SMA表达的刺激作用。但所不同的是其抑制作用更强, 且对MC α-SMA的基础表达也有明显的抑制作用。双重阻断JNK和p38通路则可同时抑制α-SMA的基础表达和IL-1β 的诱导表达。由此可见, MC表型标志物α-SMA的表达可通过细胞内信号转导途径中的JNK和p38通路共同调节, 其中, p38通路对维持基础α-SMA表达可能是必需的, 而IL-1β 诱导的MCα-SMA表达上调作用则由JNK和p38通路两者共同介导而实现。
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我们同时还发现, IL-1β 刺激后不但α-SMA蛋白合成增加, 而且出现细胞内分布的变化, 除原有均匀有序的沿细胞长轴分布外, 还出现细胞核周密集分布。超微结构检查亦证实细胞核周的微丝样结构明显增多。这些结果提示, IL-1β 诱导的MC表型改变伴有细胞骨架蛋白在细胞内的重组或重新分布现象。IL-1β 刺激引起的MC α-SMA表达和分布改变的细胞生物学意义尚不清楚。我们在另一研究中(待发表资料)已初步观察到经IL-1β 刺激的MC收缩能力有所增强, 提示α-SMA在细胞内分布的改变可能具有调控MC功能的直接意义。
综上所述, MAPK家族各亚类在IL-1β 介导的MC表型转化中具有不同的信号调控作用。 进一步探讨不同细胞内信号调控的α-SMA变化与病理情况下细胞状态、功能改变的关系, 将有助于阐明MC表型转化的病理生理意义, 并将为更深入地认识肾小球疾病的发生、发展进程提供理论依据。
参考文献
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[1]Johnson RJ. Nephrology forum: the glomerular response to injury. Mechanisms of progression and resolution. Kidney Int, 1994, 45:1769～1782.
[2]Wang Y (王玉), Zou WZ (邹万忠), Li XM (李晓玫). Expression of α-SMA correlate with phenotype change of mesangial cells in human glomerulonephritis. Chin J Nephrol (中华肾脏病杂志), 1998, 14: 206～209 (Chinese, English abstract).
[3]Sedor JR, Nakazato Y, Konieczkowaski M. Interleukin-1 and mesangial cell. Kidney Int, 1992, 41: 595～599.
, 百拇医药
[4]唐朝枢, 刘秀华. 细胞外信号引起核反应的细胞信号转导途径。药理学进展, 金正均主编. 北京科学出版社. 1998, 72～85.
[5]Li XM (李晓玫), Tang JW (唐嘉薇), Li B (李 彪). Regulatory effects of signal transduction through MAPK pathways on PDGF-induced phenotypic changes in rat glomerular mesangial cells. Chin J Nephrol (中华肾脏病杂志), 2000, 16(6): 347～351 (Chinese, English abstract).
[6]Li XM (李晓玫), Tang JW (唐嘉薇), Wang HY (王海燕). Effect of interleukin-1 on subfamily of mitogen-activated protein kinases in renal mesangial cells. Chin J Immunol (中国免疫学杂志), 1998, 14(4):300～303 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药
[7]Atkins RC. Interleukin-1 in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int, 1995, 48:576～586.
[8]Li B (李 彪), Li XM (李晓玫). Effects of raf-1 gene overexpression on proliferative phenotype of rat mesangial cells. Natl Med J Chin (中华医学杂志), 1999, 79(7): 529～532 (Chinese, English abstract).
[9]Uciechowski P, von Saklatvala J, von der Ohe J, Resch K, Szamel M, Kracht M. Interleukin-1 activates jun N-terminal kinases JNK1 and JNK2 but not extracellular regulated MAP kinase (ERK) in human glomerular mesangial cells. FEBS Lett, 1996, 394:273～278., 百拇医药
关键词：平滑肌肌动蛋白；系膜细胞；白细胞介素-1；丝裂素原活化蛋白激酶
摘要：为探讨细胞内丝裂素原活化蛋白激酶(MAPK)家族各亚类信号转导通路在炎症性细胞因子白介素-1β (IL-1β )对大鼠肾系膜细胞(rMC)表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及其分布中的调控作用, 以IL-1β (10 ng/ml)刺激体外培养的rMC, 用电穿孔基因转染及免疫杂交法观察IL-1β 对α-SMA基因启动子活性及蛋白表达的作用, 并用共聚焦荧光显微镜及透射电镜观察IL-1β 刺激前后细胞内α-SMA及微丝的分布变化。通过应用PD98059和SB203580特异阻断ERK和 p38通路、共转染显性失活JNKK基因特异阻断JNK通路, 观察阻断对IL-1β 刺激所致α-SMA表达或启动子活性的影响。结果显示, IL-1β 刺激6 h可明显上调α-SMA启动子活性, 在1~2 d内显著促进其蛋白合成; IL-1β 刺激24 h后, 细胞内α-SMA及微丝在细胞核周的分布增加。阻断ERK通路对IL-1β 诱导的α-SMA表达无明显影响; 阻断JNK及p38通路均可使IL-1β 诱导的α-SMA表达明显受抑; 阻断p38通路的作用比阻断JNK通路更强, 而且对基础状态的α-SMA表达也有抑制作用。上述结果提示, IL-1β 可刺激rMC发生表型转化, 其表型标志物α-SMA可通过基因转录增强而增加蛋白表达, 在细胞内的分布向核周转位积聚。JNK及p38通路是介导IL-1β 刺激rMC α-SMA表达的主要信号转导途径, 而ERK通路不影响IL-1β 的这一作用。
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系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是我国最为常见的免疫介导性肾小球疾病。免疫损伤可使肾小球局部浸润的炎症细胞释放多种炎症介质, 刺激并活化肾小球系膜细胞(MC), 使之从正常的静止表型转化为增殖/分泌表型。表型转化的MC可异常增殖, 表达细胞骨架蛋白或胚胎期蛋白, 自分泌炎症介质, 合成分泌细胞外基质增加等, 进而主动参与肾小球疾病的进展及肾小球硬化的发生[1]。国外学者和我们的研究均已证实, 细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的高表达是MC增殖/分泌表型的良好标志物, 在人类MsPGN中其表达与MC异常增殖及细胞外基质积聚程度密切相关[1,2]。然而, 各种炎症介质如何影响MC的表型转化及其细胞内调控机制迄今知之甚少。
白细胞介素-1β (IL-1β )是MsPGN中刺激MC活化的主要细胞因子之一, 在动物和人类肾炎过程中均已证实MC可分泌IL-1β 并表达其受体[3]。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族作为细胞内一类重要的信号转导分子, 其不同亚类可调控细胞增殖、凋亡、应激、分化等多种生物学效应[4]。我们曾发现血小板源生长因子(PDGF)对MC表达α-SMA的影响可能是通过MAPK 家族中的Raf-1和JNK活性变化调控的[5]。国外研究发现, 外源性IL-1β 在不同细胞中可激活MAPK的不同亚类, 我们也曾证实IL-1β 可刺激MC的JNK活化[6], 但MAPK各亚类信号转导通路对IL-1β 引起的MC表型改变是否具有调控作用目前尚未见报道。本研究中, 我们通过探讨IL-1β 对大鼠系膜细胞(rMC)表达α-SMA的影响以及MAPK家族各亚类信号转导通路的调控作用, 以期进一步加深对MsPGN发病机制的认识。
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1.1 主要试剂 IL-1β 购自美国R&D公司, MEK-1特异阻断剂PD98059购自英国Biolabs公司, p38特异阻断剂SB203580购自美国Biochem公司。RPMI-1640培养液及蛋白电泳分子量标准品均购自美国GIBCO公司, 胎牛血清购自美国Hyclone公司。小鼠抗α-SMA单克隆抗体购自德国Boehringer Mannheim公司, 单克隆小鼠抗人P-JNK抗体、多克隆兔抗JNK1抗体购自美国Santa Cruz公司。Maxi Plasmid Kit购自德国QIAGEN公司。
1.2 质粒扩增、提取及纯化 所用质粒均由美国科罗拉多大学医学中心Raphael A. Nemenoff教授提供, 包括(1) α-SMA启动子(α-SMA-promotor)质粒: 7110 bp, 载体为PA3-Luciferase, 插入的α-SMA启动子片段为764 bp, 两端均可为限制性内切酶HindIII识别。(2) β-半乳糖苷酶(β-gal)质粒: 6900 bp, 具有可被限制性内切酶HindIII识别的单位点。(3) PA3-luciferase质粒: 6356 bp, 为α-SMA启动子的载体, 用作模拟转染(Mock)。(4) D-JNKK(SEC1)质粒: 显性失活JNKK, 4500 bp, 以SRα3为载体, 插入片段两端可为HindIII和Xba1识别。采用氯化钙法制备感受态细菌(DH-5α), 进行质粒转化、扩增, 然后用质粒提取纯化试剂盒(QIAGEN公司)进行提取与纯化。所有质粒经酶切鉴定均符合质粒图谱。
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1.3 rMC培养 正常rMC按本所常规方法培养鉴定。手术分离雄性SD大鼠(150～200 g)肾脏, 切碎研磨, 分别通过140、80、240目筛网过滤收集肾小球, 经胶原酶消化后, 用含20%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养液, 在37℃、95%空气、5%二氧化碳的条件下进行原代培养, 并经过常规相差显微镜形态学、透射电镜行超微结构及免疫组化染色等鉴定, 证实符合系膜细胞表型特征; 实验中采用第3～12代细胞。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞刺激方法 细胞根据实验需要以适当密度转种于细胞培养板或培养皿中, 在正常培养条件下生长适当时间。于实验前换用含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培养液继续培养24 h, 使其处于生长静止状态。然后加入IL-1β 10 ng/ml分别在不同时间内予以刺激, 以不加刺激的细胞为正常对照。
1.4.2 α-SMA的表达与分布检测
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(1) α-SMA蛋白表达检测: 采用蛋白质免疫印迹法。IL-1β 分别刺激2、6、24、48和72 h。各组细胞裂解后取5 μg蛋白为样品, 行10%SPS-PAGE电泳, 经90 V恒压电转移2 h, 将样品蛋白转移至硝酸纤维素膜上, 经封闭、洗膜, 在室温下与1∶1000稀释的抗α-SMA抗体反应1 h, 再经洗膜数次并与羊抗鼠HRP-IgG孵育后进行化学发光反应, X线胶片曝光显示条带并经扫描后定量。
(2) α-SMA启动子基因转染及活性测定: 采用电穿孔法。100 μl细胞悬液(3×106/ml)与α-SMA启动子质粒15 μg和β -gal 质粒5 μg于打孔杯内充分混匀, 以细胞外基质630基因转导仪进行电打孔基因转染。转染后细胞种入培养皿中, 加适量含20% FCS的培养液, 于孵箱中培养24 h后用于实验。IL-1β 刺激时间为3、6和24 h。各组细胞分别以发光仪(LKB-1251)检测萤火虫荧光素酶(luciferase)和β-gal 的活性, α-SMA启动子活性为同一样品中经β-gal 活性校正转染效率后的萤火虫荧光素酶活性, 实验结果以实验组与空质粒转染组的比值表示。
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(3) α-SMA细胞内分布: 细胞转种于盖玻片上, 加IL-1β刺激24 h。细胞经冷丙酮固定、1% BSA封闭后行免疫荧光染色(小鼠抗α-SMA单克隆抗体1∶50, 4℃孵育过夜; FITC标记抗小鼠IgG 1∶50, 37℃孵育30 min), 于共聚焦荧光显微镜下观察α-SMA染色情况。对照组与IL-1β 刺激组均各取6～8个视野, 每个视野中≥3个细胞, 分别测定每个细胞及其核周固定区域的平均灰度值, 计算α-SMA核周分布量占总细胞分布量的比值。
(4) 细胞超微结构变化: 正常或IL-1β 刺激后细胞经离心沉淀, 加1%戊二醛固定30 min后, 常规包埋、切片, 用透射电镜观察细胞的变化。
1.4.3 MAPK各亚类通路的阻断实验
(1) ERK和p38通路的阻断: 分别给予50 μmol/L的 MEK-1特异阻断剂PD98059 或50 μmol/L的p38特异阻断剂 SB203580预孵育细胞24 h, 然后给予IL-1β 刺激24 h, 再按前述检测α-SMA蛋白表达。
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(2) JNK通路的阻断: 将D-JNKK质粒按前述方法与α-SMA启动子质粒进行共转染, 细胞经IL-1β 刺激5、20和60 min后, 采用蛋白质免疫印迹法分别用磷酸化抗体(P-JNK)和非磷酸化抗体(JNK)(稀释度均为1∶ 2000)进行免疫杂交及条带扫描定量确认JNK活性测定变化。于IL-1β 刺激6、24 h后检测α-SMA启动子活性及蛋白表达变化。
(3) JNK和p38通路的双重阻断: 按上法对D-JNKK转染的细胞于IL-1β 刺激前预先给予50 μmol/L SB203580预孵育24 h, 随后检测α-SMA蛋白表达变化。
1.5 统计学处理 实验结果以mean±SD表示, 各组间比较用ANOVA或t检验分析, 数据用Instat 3.0软件处理, P<0.05被认为差异有统计学意义。
2结果
, http://www.100md.com 2.1 IL-1β 刺激α-SMA表达的特点
IL-1β 刺激6 h即可明显激活α-SMA启动子的活性; 刺激24 h后, IL-1β 对α-SMA启动子的激活作用已经消失。IL-1β 作用早期(2～6 h)对rMC合成α-SMA蛋白无明显影响, 至刺激24 h可明显上调α-SMA蛋白表达, 到72 h其刺激作用基本消失。
2.2 IL-1β 刺激后α-SMA细胞内分布的变化
正常情况下, rMC的α-SMA表达水平很低, 主要呈丝样结构, 贯穿细胞全长, 细胞核无着染。IL-1β 刺激后α-SMA表达量明显增加, 荧光染色增强, 除仍有如前的分布外, 细胞核周还出现α-SMA免疫荧光染色的聚集(图2A、 B)。对核周α-SMA免疫荧光染色分布量占总细胞的比值计算结果显示, IL-1β 刺激组核周α-SMA分布(0.86±0.09, n=46)较对照组(0.61±0.07, n=49)明显增多(P<0.001)。
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2.3 细胞超微结构改变
IL-1β 刺激后细胞内微丝样结构较对照组增多, 并伴有核周分布增多。
2.4 ERK信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用
单纯应用MEK-1特异阻断剂PD98059作用后rMC的α-SMA表达(30288±19299)与基础状态时(33674±20668)无明显差异。在IL-1β 刺激的同时加用PD98059(39717±19144)也未能抑制IL-1β 刺激24 h导致的α-SMA表达上调反应(40196±21037)。
2.5 p38信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用
加入p38信号通路阻断剂SB203580后, 可使基础状态rMC表达α-SMA减少51.4%, 并可明显抑制IL-1β 刺激24 h导致的α-SMA表达上调(70.5%)。
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2.6 JNK信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用
转染显性失活JNKK基因的rMC该基因表达的JNKK蛋白不能被磷酸化, 同时D-JNKK还可抑制正常的JNKK磷酸化, 因而使其下游的JNK不能激活, 从而阻断JNK通路。本组中转染细胞的JNK蛋白表达无差异, 而其活性明显降低, 证实对JNK通路阻断是成功的。
阻断JNK通路后, 对rMC基础状态的α-SMA启动子活性和蛋白表达无明显影响, 但可使IL-1β 刺激6 h上调的α-SMA启动子活性被抑制, 并可抑制IL-1β 刺激24 h对α-SMA表达的上调作用。
2.7 双重阻断JNK及p38通路对IL-1β 刺激α-SMA表达的影响
应用D-JNKK基因和SB203580共同作用可使rMC的α-SMA基础表达及IL-1β 刺激的α-SMA表达水平明显下降, 分别为原水平的9.5%和7.8%。
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3讨论
细胞表型转化是指细胞在特定的生理或病理情况下发生的分化或去分化, 常表现为细胞形态、结构的重塑及其功能改变, 前者呈现细胞骨架及胚胎期蛋白的表达变化和重组, 后者涉及细胞收缩、迁移、异常增殖、膜蛋白脱落、转运功能异常以及与邻近细胞或细胞外基质的关系异常等等。近年来, 人们对肾小球炎症早期MC的异常增殖和晚期硬化时系膜区细胞外基质的合成与降解失调均已有了 较深入的认识, 但对于调控MC表型转化的细胞内关键信号尚了解甚少。
IL-1β 作为肾小球炎症发病过程中关键的病变进展调控因子, 可从多方面调控肾小球炎症及病变进展过程[3,7]。本研究观察到短时间(6 h)IL-1β 刺激即可使α-SMA启动子活性上升约3倍, 并继而出现蛋白表达增加, 其刺激作用可延续48 h, 证实IL-1β 刺激MC α-SMA表达增加是通过诱导其基因表达使蛋白合成增加所致, 验证了IL-1β 对MC确有诱导表型转化的作用。目前关于IL-1β 调控α-SMA 表达的细胞内信号转导机制国内外均未见报道。MAPKs作为广泛分布于胞浆内的具有丝/苏氨酸双重磷酸化的蛋白激酶, 主要包括ERK、 JNK/SAPK和p38亚类, 在调控细胞外信号引起细胞核内与细胞增殖、分化相关基因转录的方面具有极其重要的作用[4]。其中, ERK主要与传递一些多肽类丝裂原刺激的细胞内信号有关, 与细胞增殖反应关系密切; 而JNK/SAPK与p38亚类则是介导细胞因子及应激刺激导致的细胞凋亡、分化及炎性反应的重要细胞内信号转导途径。已有研究显示, IL-1β 在不同的细胞中可能通过活化MAPKs中的不同亚类, 引起增殖/凋亡、 细胞分化等不同反应。在本研究中, 我们应用特异阻断的方法， 观察了MAPKs的三个不同亚类在介导IL-1β 诱导MC表达α-SMA的信号传递中的作用。本室在既往研究PDGF对rMC的作用中曾发现, ERK活化主要与其刺激DNA合成速率增高相关, 可能部分参与对α-SMA表达的调控[5,8]。在本实验中, 应用MEK1的特异阻断剂PD98059阻断ERK通路后, 未能影响IL-1β 刺激α-SMA表达上调的作用, 提示ERK通路不是介导IL-1β 刺激MC表达α-SMA的主要信号转导途径。已有证据表明, IL-1β 可在5~30 min内迅速激活JNK和p38激酶 [6,9]。本室以往在raf-1基因持续高表达的rMC中曾观察到, JNK基础活性减低的同时伴有α-SMA蛋白表达的缺失, 提示JNK活性的存在可能与α-SMA表达调控有关[8]。在本实验中, 当用显性失活的D-JNKK质粒转入系膜细胞后, 可以观察到IL-1β 诱导的JNK活化受到抑制, 同时也明显抑制了IL-1β 对α-SMA启动子活性及其蛋白表达的刺激作用, 证实IL-1β 诱导α-SMA表达的信号转导过程部分通过JNK通路所介导。进一步应用SB203580特异性阻断p38通路得到了与阻断JNK通路相似的结果, 即阻断p38通路也可抑制IL-1β 对α-SMA表达的刺激作用。但所不同的是其抑制作用更强, 且对MC α-SMA的基础表达也有明显的抑制作用。双重阻断JNK和p38通路则可同时抑制α-SMA的基础表达和IL-1β 的诱导表达。由此可见, MC表型标志物α-SMA的表达可通过细胞内信号转导途径中的JNK和p38通路共同调节, 其中, p38通路对维持基础α-SMA表达可能是必需的, 而IL-1β 诱导的MCα-SMA表达上调作用则由JNK和p38通路两者共同介导而实现。
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我们同时还发现, IL-1β 刺激后不但α-SMA蛋白合成增加, 而且出现细胞内分布的变化, 除原有均匀有序的沿细胞长轴分布外, 还出现细胞核周密集分布。超微结构检查亦证实细胞核周的微丝样结构明显增多。这些结果提示, IL-1β 诱导的MC表型改变伴有细胞骨架蛋白在细胞内的重组或重新分布现象。IL-1β 刺激引起的MC α-SMA表达和分布改变的细胞生物学意义尚不清楚。我们在另一研究中(待发表资料)已初步观察到经IL-1β 刺激的MC收缩能力有所增强, 提示α-SMA在细胞内分布的改变可能具有调控MC功能的直接意义。
综上所述, MAPK家族各亚类在IL-1β 介导的MC表型转化中具有不同的信号调控作用。 进一步探讨不同细胞内信号调控的α-SMA变化与病理情况下细胞状态、功能改变的关系, 将有助于阐明MC表型转化的病理生理意义, 并将为更深入地认识肾小球疾病的发生、发展进程提供理论依据。
参考文献
, 百拇医药
[1]Johnson RJ. Nephrology forum: the glomerular response to injury. Mechanisms of progression and resolution. Kidney Int, 1994, 45:1769～1782.
[2]Wang Y (王玉), Zou WZ (邹万忠), Li XM (李晓玫). Expression of α-SMA correlate with phenotype change of mesangial cells in human glomerulonephritis. Chin J Nephrol (中华肾脏病杂志), 1998, 14: 206～209 (Chinese, English abstract).
[3]Sedor JR, Nakazato Y, Konieczkowaski M. Interleukin-1 and mesangial cell. Kidney Int, 1992, 41: 595～599.
, 百拇医药
[4]唐朝枢, 刘秀华. 细胞外信号引起核反应的细胞信号转导途径。药理学进展, 金正均主编. 北京科学出版社. 1998, 72～85.
[5]Li XM (李晓玫), Tang JW (唐嘉薇), Li B (李 彪). Regulatory effects of signal transduction through MAPK pathways on PDGF-induced phenotypic changes in rat glomerular mesangial cells. Chin J Nephrol (中华肾脏病杂志), 2000, 16(6): 347～351 (Chinese, English abstract).
[6]Li XM (李晓玫), Tang JW (唐嘉薇), Wang HY (王海燕). Effect of interleukin-1 on subfamily of mitogen-activated protein kinases in renal mesangial cells. Chin J Immunol (中国免疫学杂志), 1998, 14(4):300～303 (Chinese, English abstract).
, 百拇医药
[7]Atkins RC. Interleukin-1 in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int, 1995, 48:576～586.
[8]Li B (李 彪), Li XM (李晓玫). Effects of raf-1 gene overexpression on proliferative phenotype of rat mesangial cells. Natl Med J Chin (中华医学杂志), 1999, 79(7): 529～532 (Chinese, English abstract).
[9]Uciechowski P, von Saklatvala J, von der Ohe J, Resch K, Szamel M, Kracht M. Interleukin-1 activates jun N-terminal kinases JNK1 and JNK2 but not extracellular regulated MAP kinase (ERK) in human glomerular mesangial cells. FEBS Lett, 1996, 394:273～278., 百拇医药