一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制
中山医科大学生理学教研室；广州 510089 刘培庆；鲁伟；潘敬运*
关键词：丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1；蛋白激酶K；心肌细胞；肥大反应；血管紧张素Ⅱ；一氧化氮；精氨酸
摘要：本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮(NO)信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽(ANP)的表达作为心肌肥大反应的指标, 以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平, 以免疫印迹法测定MKP-1蛋白表达, 以RT-PCR测定eNOS mRNA水平。结果发现: (1) L-精氨酸 (L-Arg) 10、 100 μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16%及31%, L-Arg (100 μmol/L)还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 其作用可被NOS抑制剂L-NAME所抑制; (2) L-Arg (100 μmol/L)可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平和蛋白合成速率, 而在L-Arg处理之前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 蛋白合成速率明显增加, 可取消L-Arg的抑制作用, 甚至超过AngⅡ组; (3) L-Arg (100 μmol/L)明显增加MKP-1蛋白表达, 比对照组增加225%, NOS抑制剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达, 分别抑制88%、 83%, 而AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达, 较对照组增加365%, 增强了L-Arg的作用。以上结果表明, NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG, 促进MKP-1的表达, 从而增加MAPK去磷酸化实现的。
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心肌肥大是高血压最常见的并发症之一, 它既是高血压时心脏负荷过大引起心肌组织代偿性生长的结果, 也是心脏的病理性重构过程。临床流行病学资料表明, 高血压合并心肌肥厚时猝死、 心律失常、 心绞痛、 心力衰竭等心血管疾病的发病率和死亡率明显增高, 严重影响高血压患者的预后, 心肌肥大目前已被列为心血管疾病的独立危险因子[1, 2]。因此, 探讨心肌肥大的发生机制、 寻求合理的防治措施具有重要的理论及实践意义。
近年来的研究表明, 寻找信号传导通路的调控机制是揭示心肌肥大细胞分子机制的关键[3]。由于心肌细胞存在共同的分子效应信号, 胞外多种刺激都可导致最终的心肌细胞肥大反应。现已明确, 压力超负荷及某些生长因子如血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、 α1受体激动剂、 内皮素-1(endothelin 1, ET-1)及某些细胞因子是导致心肌肥大的重要因子[4]。 亦有资料提示， 某些扩张血管、 抑制蛋白合成的因子可能具有抑制心肌肥大的作用[5]。本研究室近几年的研究揭示一氧化氮(nitric oxide, NO)对心肌肥大具有明显抑制作用, 可抑制多种致心肌肥大因子如AngⅡ、 ET-1等介导的心肌肥大反应。我们最近的研究表明, NO前体L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)可抑制肾性高血压大鼠心肌肥厚, 同时心肌组织的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)表达发生了重要的改变[6~8]。 为了进一步揭示L-Arg及NO抑制心肌肥大反应的机制, 本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 以心肌细胞蛋白合成速率、 心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide, ANP) 表达为心肌肥大反应的指标, 从细胞学及分子生物学角度研究NO信号系统在AngⅡ诱导心肌肥大反应中的作用及机制。
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1材料和方法
1.1 试剂及仪器 TRIzol试剂盒购自Gibco公司; 兔抗鼠MKP-1单克隆抗体、 leupeptin、 apoprotinin、 PMSF、 蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为TTYADFIASGRRANA-IHD)均为Sigma公司产品; 化学发光增强剂(ECL)试剂盒(Phototope-HRP Western Blot Detection Kit)为New England Biolab公司产品, 其它试剂均为国产分析纯。Revco超低温冰箱(美国); Eppendorf 5417R型低温离心机(德国); Mini-ProteanⅡ电泳槽、电转印槽、 基因扩增(美国Bio-Rad公司); Mettler AE260型万分之一天平(瑞士); IBAS图像分析系统 (Kontron Elektronik公司, 德国); UVP-GDS8000 凝胶成像系统(英国); UV紫外分光光度计(英国CECIL2020)。
1.2 心肌细胞培养 按Simpson等[9]描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。以0.06%胰蛋白酶分离1~3 d龄的Sprague-Dawley大鼠心室肌细胞, 采用差速贴壁法纯化心肌细胞。在培养的前48 h, 在心肌细胞培养液中加入 0.1 mmol/L 5′-溴脱氧尿苷, 以抑制非心肌细胞增殖。然后换无血清培养液, 72 h开始用于药物实验。
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1.3 心肌细胞[3H]亮氨酸的掺入测定 调细胞浓度3×105个/ ml, 接种于24孔培养板上, 每孔1 ml。培养48 h后换为无血清培养基, 24 h后加入 37 kBq [3H]亮氨酸及各种处理因子, 继续培养48 h。收集细胞于玻璃纤维素膜上, 以三氯乙酸固定, 洗去游离的同位素标记物。滤膜烘干后置于含5 ml闪烁液的闪烁瓶中, 以LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射强度。
1.4 用免疫印迹法测定eNOS和MKP-1蛋白表达 用各种干预因素处理心肌细胞不同时间后, 弃去培养瓶中的液体, 加入0.15 ml蛋白提取液, 其组成为(mmol/L): β-磷酸甘油 20, 苯甲酰胺 (benzamidine) 10, 焦磷酸钠 50, NaF 50, NaCl 50, EDTA 5, EGTA 5, Na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH 7.4), 0.1% Triton X-100, PMSF 0.5, aprotinin 0.1, leupeptin 0.02, 0.03% β-巯基乙醇。收集细胞提取物, 4℃离心(13000 r/min×10 min), 取上清液, 按Bradford法测量蛋白浓度[10], 调蛋白质浓度至200 μg/μl, 然后进行SDS-PAGE电泳, 上样量为25 μl, 电印迹转移法将凝胶内的蛋白质转至硝酸纤维素膜上, 用含1%小牛血清白蛋白(BSA)的TBST溶液室温封闭1.5 h, 再分别与一抗: 兔抗大鼠MKP-1单克隆抗体(稀释度为1∶5000)和兔抗大鼠eNOS单克隆抗体(稀释度为1∶4000), 4 ℃孵育过夜, 用TBST溶液洗脱3次, 再与二抗: HRP标记的羊抗兔IgG抗体及羊抗小鼠IgG抗体(稀释度为1∶2000)室温孵育1 h, 以TBST溶液洗脱3次后与ECL试剂反应1 min, X光胶片压片曝光10 s～1 min, 以IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理。
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1.5 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测eNOS mRNA、 ANP mRNA表达 (1)细胞总RNA的提取: 弃去培养瓶中的液体, 加入TRIzol试剂, 按使用指南提取总RNA, 经紫外分光光度计检测纯度, OD260/OD280比值在1.8~2.0之间, 并根据OD260值计算样品总RNA浓度。(2)引物: 内标设计为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydroge-nase, GAPDH), 寡聚核苷酸引物序列根据Fort等[11]文献中所列: 上游 5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCC-3′, 下游5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′。可扩增出长度为443 bp的GAPDH cDNA片段; eNOS寡聚核苷酸引物序列根据Nadaud等[12]文献中所列: 上游 5′-TTC CGG CTG CCA CCT GAT CCT AA-3′, 下游 5′-AAC ATG TGT CCT TGC TCG AGG CA-3′。可扩增出长度为340 bp (+268~+568 bp)的eNOS cDNA片段; ANP引物序列根据Lee等[13]文献所列: 上游 5′-GGC TCC TTC TCC ATC ACC AA-3′, 下游 5′-TGT TAT CTT CGG TAC CG-3′。可扩增出长度为458 bp (+4~+461 bp)的片段。以上引物寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成。(3)RT-PCR: TitanTM一管法RT-PCR试剂盒进行内标(GAPDH)、 eNOS、 ANP等相应片段的扩增, 总反应体积为50 μl, RT-PCR条件为: 55℃ 30 min; 94℃ 2 min; 94℃ 30 s、 45℃ 30 s、 68℃ 1 min, 10次循环; 94℃ 30 s、 45℃ 30 s、 68℃ 45 s (每循环递增5 s), 25次循环; 68℃ 7 min。(4) RT-PCR产物的检测和分析: 取RT-PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用GDS凝胶成像系统拍摄打印实验结果, 电泳条带用IBAS 计算机图像分析系统扫描分析。
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1.6 NOx含量的测定 (1)样品制备: 弃去培养瓶中的液体, 加入冰预冷的0.3 mol/L高氯酸(冰浴), 收集细胞提取液于1.5 ml离心管中, 12000 r/min, 4℃离心10 min, 取上清于另一离心管中, 待测。(2)亚硝酸盐/硝酸盐含量的测定: 按照亚硝酸盐/硝酸盐比色法试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品), 以亚硝酸钠、 硝酸钾为标准品, 制作亚硝酸盐/硝酸盐标准曲线, 求出相应的直线回归方程; 然后测定样品的光密度值, 根据标准曲线方程求出相应的亚硝酸盐/硝酸盐含量; 最后根据各样品的蛋白定量, 求出每mg蛋白中亚硝酸盐/硝酸盐含量。
1.7 统计学处理 数据以mean±SD表示, 经SPSS软件进行统计检验, P<0.05表示差异有显著性意义。
2结果
2.1 L-Arg对心肌细胞NO信号系统的影响
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L-Arg处理心肌细胞, 可以增加NO代谢产物(硝酸盐及亚硝酸盐)水平, 且在10、 100 μmol/L浓度分别比对照组增加31%及16%, 提示L-Arg增加NO产量的作用与剂量有关, 而L-Arg增加NO代谢产物水平可被NOS抑制剂L-NAME所抑制(抑制率为33%), 提示L-Arg的上述作用是通过心肌细胞NOS实现的; L-Arg (100 μmol/L)可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 该作用亦可被L-NAME所抑制; 另外观察到AngⅡ可减弱eNOS mRNA表达, 且能抑制L-Arg的作用。2.2 L-Arg对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的影响L-Arg (100 μmol/L) 预处理心肌细胞, 可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平(图3)和蛋白合成速率, 从而抑制AngⅡ诱导的心肌肥大反应; 而在L-Arg处理前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 蛋白合成速率可明显增加, 甚至超过AngⅡ组, 故MKP-1的反义寡核苷酸可对抗L-Arg对AngⅡ诱导的心肌肥大反应的抑制作用, 而且增强了AngⅡ的致心肌肥大作用。
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2.3 L-Arg对心肌细胞MKP-1的影响
用L-Arg (100 μmol/L)处理心肌细胞, 可明显增加MKP-1蛋白表达(较对照组增加225%), 而NOS抑制剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823亦皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达, 分别抑制88%、 83%, 提示L-Arg通过促进NO生成, 激活PKG而促进MKP-1的表达; AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达, 较对照组增加365%, 将L-Arg的作用又增强了162%, 提示L-Arg是通过与AngⅡ不同的信号途径诱导MKP-1蛋白表达的。
3讨论
在压力超负荷等病理因素所导致的心肌肥大反应中, 血管紧张素Ⅱ是重要的刺激因子, 抑制AngⅡ生成(如ACEI)及阻断AngⅡ1型受体(AT1受体)皆具有很好的对抗高血压心肌肥大的效果。但我们的前期研究发现, 补充L-Arg亦可明显减轻肾性高血压大鼠心肌肥大。L-Arg是合成NO的前体物质, 主要在NO合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化下合成NO, 正常心肌细胞即可表达eNOS, 具有合成NO的能力, 因此考虑L-Arg通过增加心肌组织NO合成发挥抑制心肌肥大的作用, 并得到了初步证实[14]。这也说明除经典的抑制致心肌肥大因子产生或作用外, 增加抑制心肌肥大因子(如NO)的产生亦不失为治疗心肌肥大的一条重要途径。但NO是如何发挥抑制心肌肥大的作用, 其作用途径与AngⅡ介导心肌肥大信号通路是否存在交叉点则是本文探讨的主要内容。
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在肾性高血压大鼠, AngⅡ主要通过激活AT1引起心肌肥大, 其中 MAPK信号途径的持续过度激活在AngⅡ介导的心肌肥大反应中发挥了重要作用。由于在心肌组织激活的MAPK主要被MAPK磷酸酶MKP-1去磷酸化而失活, 如果激活MKP-1则可能降低MAPK的磷酸化程度, 减轻了致心肌肥大因子的作用。NO作为强效的内源性血管扩张物质, 是鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase, GC)的重要激活物, 可通过激活GC增加cGMP产生。cGMP可通过激活依赖cGMP的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase, PKG), 也可通过不依赖于PKG途径介导细胞反应[15~17]。因此, NO抑制心肌肥大反应是否与MAPK信号途径有关？是否存在NO信号通路与MAPK信号途径相互作用？MKP-1在其中扮演了什么角色, NO作用是否激活PKG等则成为我们研究 L-Arg抑制心肌肥大的机制的重要环节及靶点。
我们观察到, L-Arg可增加心肌细胞的NO生成、 诱导eNOS表达, 但可被NOS抑制剂L-NAME抑制, 提示L-Arg不仅是NO合成的前体, 也是NO生成的酶促反应促进剂, 外源性L-Arg可通过这两方面增加心肌细胞NO生成。
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实验中, 我们以心肌细胞蛋白合成及ANP基因表达为指标, 用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 来研究L-Arg的作用是否与MKP-1有关。ANP为胚胎期表达的基因, 出生后在正常心肌组织中表达量很低, 而如果检测到心肌组织ANP表达量明显增加, 则属于胚胎期基因重演, 为病理性心肌肥大的可靠指标。选择心肌细胞ANP表达量与心肌细胞蛋白合成速率一起作为心肌肥大的指标, 可使结果更为可靠。实验观察到AngⅡ可明显增加心肌细胞ANP的表达, 而L-Arg则可抑制AngⅡ对心肌细胞ANP表达的诱导, 提示L-Arg可抑制AngⅡ介导的心肌细胞肥大反应。MKP-1反义寡核苷酸转染心肌细胞, 降低了MKP-1蛋白表达后, 不但对抗了L-Arg对AngⅡ介导心肌肥大反应的抑制作用, 而且其增加心肌细胞蛋白合成的程度显著超过了AngⅡ的作用。这既提示了NO可能通过促进 MKP-1蛋白表达而增加MAPK降解, 也说明抑制AngⅡ对MKP-1的激活, 将增强AngⅡ的致心肌肥大作用, 这与以前的实验结果(在AngⅡ诱导的心肌肥大反应中, 激活MAPK以后也会激活MKP-1的, 只是两者激活的时程变化、 程度不同, 从而出现MAPK的过度持续激活[7])是一致的。
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进一步研究发现, L-Arg明显增加心肌细胞MKP-1蛋白表达, L-NAME、 PKG抑制剂KT-5823能抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达, 提示L-Arg促进MKP-1的表达是通过促进NO生成、 激活PKG而实现的; 而AngⅡ能增强L-Arg的作用, L-Arg是通过与AngⅡ不同的信号途径诱导MKP-1蛋白表达的。PKG亦是细胞内的重要蛋白激酶[19, 20], 其如何诱导MKP-1的表达值得深入研究。本文重点揭示了AngⅡ信号途径与NO信号系统相互作用在心肌肥大反应过程中的重要作用, 这对揭示高血压心肌肥大的发病机制及寻求合理的防治措施具有重要的理论和实践意义。
参考文献
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关键词：丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1；蛋白激酶K；心肌细胞；肥大反应；血管紧张素Ⅱ；一氧化氮；精氨酸
摘要：本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮(NO)信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽(ANP)的表达作为心肌肥大反应的指标, 以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平, 以免疫印迹法测定MKP-1蛋白表达, 以RT-PCR测定eNOS mRNA水平。结果发现: (1) L-精氨酸 (L-Arg) 10、 100 μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16%及31%, L-Arg (100 μmol/L)还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 其作用可被NOS抑制剂L-NAME所抑制; (2) L-Arg (100 μmol/L)可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平和蛋白合成速率, 而在L-Arg处理之前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 蛋白合成速率明显增加, 可取消L-Arg的抑制作用, 甚至超过AngⅡ组; (3) L-Arg (100 μmol/L)明显增加MKP-1蛋白表达, 比对照组增加225%, NOS抑制剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达, 分别抑制88%、 83%, 而AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达, 较对照组增加365%, 增强了L-Arg的作用。以上结果表明, NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG, 促进MKP-1的表达, 从而增加MAPK去磷酸化实现的。
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心肌肥大是高血压最常见的并发症之一, 它既是高血压时心脏负荷过大引起心肌组织代偿性生长的结果, 也是心脏的病理性重构过程。临床流行病学资料表明, 高血压合并心肌肥厚时猝死、 心律失常、 心绞痛、 心力衰竭等心血管疾病的发病率和死亡率明显增高, 严重影响高血压患者的预后, 心肌肥大目前已被列为心血管疾病的独立危险因子[1, 2]。因此, 探讨心肌肥大的发生机制、 寻求合理的防治措施具有重要的理论及实践意义。
近年来的研究表明, 寻找信号传导通路的调控机制是揭示心肌肥大细胞分子机制的关键[3]。由于心肌细胞存在共同的分子效应信号, 胞外多种刺激都可导致最终的心肌细胞肥大反应。现已明确, 压力超负荷及某些生长因子如血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、 α1受体激动剂、 内皮素-1(endothelin 1, ET-1)及某些细胞因子是导致心肌肥大的重要因子[4]。 亦有资料提示， 某些扩张血管、 抑制蛋白合成的因子可能具有抑制心肌肥大的作用[5]。本研究室近几年的研究揭示一氧化氮(nitric oxide, NO)对心肌肥大具有明显抑制作用, 可抑制多种致心肌肥大因子如AngⅡ、 ET-1等介导的心肌肥大反应。我们最近的研究表明, NO前体L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)可抑制肾性高血压大鼠心肌肥厚, 同时心肌组织的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)表达发生了重要的改变[6~8]。 为了进一步揭示L-Arg及NO抑制心肌肥大反应的机制, 本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 以心肌细胞蛋白合成速率、 心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide, ANP) 表达为心肌肥大反应的指标, 从细胞学及分子生物学角度研究NO信号系统在AngⅡ诱导心肌肥大反应中的作用及机制。
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1材料和方法
1.1 试剂及仪器 TRIzol试剂盒购自Gibco公司; 兔抗鼠MKP-1单克隆抗体、 leupeptin、 apoprotinin、 PMSF、 蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为TTYADFIASGRRANA-IHD)均为Sigma公司产品; 化学发光增强剂(ECL)试剂盒(Phototope-HRP Western Blot Detection Kit)为New England Biolab公司产品, 其它试剂均为国产分析纯。Revco超低温冰箱(美国); Eppendorf 5417R型低温离心机(德国); Mini-ProteanⅡ电泳槽、电转印槽、 基因扩增(美国Bio-Rad公司); Mettler AE260型万分之一天平(瑞士); IBAS图像分析系统 (Kontron Elektronik公司, 德国); UVP-GDS8000 凝胶成像系统(英国); UV紫外分光光度计(英国CECIL2020)。
1.2 心肌细胞培养 按Simpson等[9]描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。以0.06%胰蛋白酶分离1~3 d龄的Sprague-Dawley大鼠心室肌细胞, 采用差速贴壁法纯化心肌细胞。在培养的前48 h, 在心肌细胞培养液中加入 0.1 mmol/L 5′-溴脱氧尿苷, 以抑制非心肌细胞增殖。然后换无血清培养液, 72 h开始用于药物实验。
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1.3 心肌细胞[3H]亮氨酸的掺入测定 调细胞浓度3×105个/ ml, 接种于24孔培养板上, 每孔1 ml。培养48 h后换为无血清培养基, 24 h后加入 37 kBq [3H]亮氨酸及各种处理因子, 继续培养48 h。收集细胞于玻璃纤维素膜上, 以三氯乙酸固定, 洗去游离的同位素标记物。滤膜烘干后置于含5 ml闪烁液的闪烁瓶中, 以LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射强度。
1.4 用免疫印迹法测定eNOS和MKP-1蛋白表达 用各种干预因素处理心肌细胞不同时间后, 弃去培养瓶中的液体, 加入0.15 ml蛋白提取液, 其组成为(mmol/L): β-磷酸甘油 20, 苯甲酰胺 (benzamidine) 10, 焦磷酸钠 50, NaF 50, NaCl 50, EDTA 5, EGTA 5, Na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH 7.4), 0.1% Triton X-100, PMSF 0.5, aprotinin 0.1, leupeptin 0.02, 0.03% β-巯基乙醇。收集细胞提取物, 4℃离心(13000 r/min×10 min), 取上清液, 按Bradford法测量蛋白浓度[10], 调蛋白质浓度至200 μg/μl, 然后进行SDS-PAGE电泳, 上样量为25 μl, 电印迹转移法将凝胶内的蛋白质转至硝酸纤维素膜上, 用含1%小牛血清白蛋白(BSA)的TBST溶液室温封闭1.5 h, 再分别与一抗: 兔抗大鼠MKP-1单克隆抗体(稀释度为1∶5000)和兔抗大鼠eNOS单克隆抗体(稀释度为1∶4000), 4 ℃孵育过夜, 用TBST溶液洗脱3次, 再与二抗: HRP标记的羊抗兔IgG抗体及羊抗小鼠IgG抗体(稀释度为1∶2000)室温孵育1 h, 以TBST溶液洗脱3次后与ECL试剂反应1 min, X光胶片压片曝光10 s～1 min, 以IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理。
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1.5 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测eNOS mRNA、 ANP mRNA表达 (1)细胞总RNA的提取: 弃去培养瓶中的液体, 加入TRIzol试剂, 按使用指南提取总RNA, 经紫外分光光度计检测纯度, OD260/OD280比值在1.8~2.0之间, 并根据OD260值计算样品总RNA浓度。(2)引物: 内标设计为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydroge-nase, GAPDH), 寡聚核苷酸引物序列根据Fort等[11]文献中所列: 上游 5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCC-3′, 下游5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′。可扩增出长度为443 bp的GAPDH cDNA片段; eNOS寡聚核苷酸引物序列根据Nadaud等[12]文献中所列: 上游 5′-TTC CGG CTG CCA CCT GAT CCT AA-3′, 下游 5′-AAC ATG TGT CCT TGC TCG AGG CA-3′。可扩增出长度为340 bp (+268~+568 bp)的eNOS cDNA片段; ANP引物序列根据Lee等[13]文献所列: 上游 5′-GGC TCC TTC TCC ATC ACC AA-3′, 下游 5′-TGT TAT CTT CGG TAC CG-3′。可扩增出长度为458 bp (+4~+461 bp)的片段。以上引物寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成。(3)RT-PCR: TitanTM一管法RT-PCR试剂盒进行内标(GAPDH)、 eNOS、 ANP等相应片段的扩增, 总反应体积为50 μl, RT-PCR条件为: 55℃ 30 min; 94℃ 2 min; 94℃ 30 s、 45℃ 30 s、 68℃ 1 min, 10次循环; 94℃ 30 s、 45℃ 30 s、 68℃ 45 s (每循环递增5 s), 25次循环; 68℃ 7 min。(4) RT-PCR产物的检测和分析: 取RT-PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用GDS凝胶成像系统拍摄打印实验结果, 电泳条带用IBAS 计算机图像分析系统扫描分析。
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1.6 NOx含量的测定 (1)样品制备: 弃去培养瓶中的液体, 加入冰预冷的0.3 mol/L高氯酸(冰浴), 收集细胞提取液于1.5 ml离心管中, 12000 r/min, 4℃离心10 min, 取上清于另一离心管中, 待测。(2)亚硝酸盐/硝酸盐含量的测定: 按照亚硝酸盐/硝酸盐比色法试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品), 以亚硝酸钠、 硝酸钾为标准品, 制作亚硝酸盐/硝酸盐标准曲线, 求出相应的直线回归方程; 然后测定样品的光密度值, 根据标准曲线方程求出相应的亚硝酸盐/硝酸盐含量; 最后根据各样品的蛋白定量, 求出每mg蛋白中亚硝酸盐/硝酸盐含量。
1.7 统计学处理 数据以mean±SD表示, 经SPSS软件进行统计检验, P<0.05表示差异有显著性意义。
2结果
2.1 L-Arg对心肌细胞NO信号系统的影响
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L-Arg处理心肌细胞, 可以增加NO代谢产物(硝酸盐及亚硝酸盐)水平, 且在10、 100 μmol/L浓度分别比对照组增加31%及16%, 提示L-Arg增加NO产量的作用与剂量有关, 而L-Arg增加NO代谢产物水平可被NOS抑制剂L-NAME所抑制(抑制率为33%), 提示L-Arg的上述作用是通过心肌细胞NOS实现的; L-Arg (100 μmol/L)可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 该作用亦可被L-NAME所抑制; 另外观察到AngⅡ可减弱eNOS mRNA表达, 且能抑制L-Arg的作用。2.2 L-Arg对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的影响L-Arg (100 μmol/L) 预处理心肌细胞, 可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平(图3)和蛋白合成速率, 从而抑制AngⅡ诱导的心肌肥大反应; 而在L-Arg处理前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 蛋白合成速率可明显增加, 甚至超过AngⅡ组, 故MKP-1的反义寡核苷酸可对抗L-Arg对AngⅡ诱导的心肌肥大反应的抑制作用, 而且增强了AngⅡ的致心肌肥大作用。
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2.3 L-Arg对心肌细胞MKP-1的影响
用L-Arg (100 μmol/L)处理心肌细胞, 可明显增加MKP-1蛋白表达(较对照组增加225%), 而NOS抑制剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823亦皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达, 分别抑制88%、 83%, 提示L-Arg通过促进NO生成, 激活PKG而促进MKP-1的表达; AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达, 较对照组增加365%, 将L-Arg的作用又增强了162%, 提示L-Arg是通过与AngⅡ不同的信号途径诱导MKP-1蛋白表达的。
3讨论
在压力超负荷等病理因素所导致的心肌肥大反应中, 血管紧张素Ⅱ是重要的刺激因子, 抑制AngⅡ生成(如ACEI)及阻断AngⅡ1型受体(AT1受体)皆具有很好的对抗高血压心肌肥大的效果。但我们的前期研究发现, 补充L-Arg亦可明显减轻肾性高血压大鼠心肌肥大。L-Arg是合成NO的前体物质, 主要在NO合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化下合成NO, 正常心肌细胞即可表达eNOS, 具有合成NO的能力, 因此考虑L-Arg通过增加心肌组织NO合成发挥抑制心肌肥大的作用, 并得到了初步证实[14]。这也说明除经典的抑制致心肌肥大因子产生或作用外, 增加抑制心肌肥大因子(如NO)的产生亦不失为治疗心肌肥大的一条重要途径。但NO是如何发挥抑制心肌肥大的作用, 其作用途径与AngⅡ介导心肌肥大信号通路是否存在交叉点则是本文探讨的主要内容。
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在肾性高血压大鼠, AngⅡ主要通过激活AT1引起心肌肥大, 其中 MAPK信号途径的持续过度激活在AngⅡ介导的心肌肥大反应中发挥了重要作用。由于在心肌组织激活的MAPK主要被MAPK磷酸酶MKP-1去磷酸化而失活, 如果激活MKP-1则可能降低MAPK的磷酸化程度, 减轻了致心肌肥大因子的作用。NO作为强效的内源性血管扩张物质, 是鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase, GC)的重要激活物, 可通过激活GC增加cGMP产生。cGMP可通过激活依赖cGMP的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase, PKG), 也可通过不依赖于PKG途径介导细胞反应[15~17]。因此, NO抑制心肌肥大反应是否与MAPK信号途径有关？是否存在NO信号通路与MAPK信号途径相互作用？MKP-1在其中扮演了什么角色, NO作用是否激活PKG等则成为我们研究 L-Arg抑制心肌肥大的机制的重要环节及靶点。
我们观察到, L-Arg可增加心肌细胞的NO生成、 诱导eNOS表达, 但可被NOS抑制剂L-NAME抑制, 提示L-Arg不仅是NO合成的前体, 也是NO生成的酶促反应促进剂, 外源性L-Arg可通过这两方面增加心肌细胞NO生成。
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实验中, 我们以心肌细胞蛋白合成及ANP基因表达为指标, 用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 来研究L-Arg的作用是否与MKP-1有关。ANP为胚胎期表达的基因, 出生后在正常心肌组织中表达量很低, 而如果检测到心肌组织ANP表达量明显增加, 则属于胚胎期基因重演, 为病理性心肌肥大的可靠指标。选择心肌细胞ANP表达量与心肌细胞蛋白合成速率一起作为心肌肥大的指标, 可使结果更为可靠。实验观察到AngⅡ可明显增加心肌细胞ANP的表达, 而L-Arg则可抑制AngⅡ对心肌细胞ANP表达的诱导, 提示L-Arg可抑制AngⅡ介导的心肌细胞肥大反应。MKP-1反义寡核苷酸转染心肌细胞, 降低了MKP-1蛋白表达后, 不但对抗了L-Arg对AngⅡ介导心肌肥大反应的抑制作用, 而且其增加心肌细胞蛋白合成的程度显著超过了AngⅡ的作用。这既提示了NO可能通过促进 MKP-1蛋白表达而增加MAPK降解, 也说明抑制AngⅡ对MKP-1的激活, 将增强AngⅡ的致心肌肥大作用, 这与以前的实验结果(在AngⅡ诱导的心肌肥大反应中, 激活MAPK以后也会激活MKP-1的, 只是两者激活的时程变化、 程度不同, 从而出现MAPK的过度持续激活[7])是一致的。
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进一步研究发现, L-Arg明显增加心肌细胞MKP-1蛋白表达, L-NAME、 PKG抑制剂KT-5823能抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达, 提示L-Arg促进MKP-1的表达是通过促进NO生成、 激活PKG而实现的; 而AngⅡ能增强L-Arg的作用, L-Arg是通过与AngⅡ不同的信号途径诱导MKP-1蛋白表达的。PKG亦是细胞内的重要蛋白激酶[19, 20], 其如何诱导MKP-1的表达值得深入研究。本文重点揭示了AngⅡ信号途径与NO信号系统相互作用在心肌肥大反应过程中的重要作用, 这对揭示高血压心肌肥大的发病机制及寻求合理的防治措施具有重要的理论和实践意义。
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