5-HT能纤维向猫脊髓膈神经核及延髓膈肌前运动神经元的投射
山东大学医学院生理教研室；济南 250012 宋刚；李勤；邵凤之
关键词：5-HT能神经元；中缝核；膈神经核；抗5-HT抗体；WGA-HRP
摘要：实验在6只成年猫上进行。将WGA-HRP微量注入C5膈神经核内, 通过逆行追踪及5-HT免疫组织化学FITC荧光双重标记方法, 研究了中缝核5-HT能神经元向脊髓膈神经核的投射, 同时观察了延髓膈肌前运动神经元接受5-HT能纤维投射的情况。结果在中缝苍白核观察到较多的HRP-5-HT双标记神经元, 在中缝大核、 中缝隐核观察到少数散在的双标记神经元。在延髓疑核、 孤束核腹外侧区域的HRP单标记神经元(即膈肌前运动神经元)周围观察到5-HT能轴突末梢。结果表明: 发自中缝苍白核5-HT能神经元的传出纤维可投射到脊髓膈神经核; 延髓膈肌前运动神经元接受5-HT能纤维的传入投射。
已有众多研究显示, 5-HT与呼吸节律调节有密切关系。 例如, 在长吸呼吸动物, 系统使用5-HT受体激动剂可逆转长吸呼吸[1], 脊髓膈神经核局部使用5-HT导致膈神经吸气放电幅度增高等[2, 3]。 5-HT能神经元集中存在于中缝核群。 Lalley[4]、 Aoki[5]、 及本研究室[6, 7]曾发现, 电刺激中缝大核导致强烈的吸气抑制, 电刺激中缝苍白核则导致吸气兴奋。组织学研究表明, 发自中缝核群的纤维投射到延髓呼吸神经元群及脊髓膈神经核[8,9]。 然而这些投射纤维是否为5-HT能纤维？ 中缝核群的5-HT能神经元轴突是否投射到脊髓膈神经核？至今尚未见系统研的究报道。
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1材料和方法
1.1 HRP注射实验在6只成年猫(体重1.8~2.5 kg)上进行。苯巴比妥钠(NembutalTM, 30 mg/kg, ip)麻醉, 固定于SN-3立体定向仪上。从背侧暴露颈段脊髓C4~6节段。首先用细胞外记录方法确定膈运动神经元群所在的区域(中线旁1.5~2.5 mm, 自表面深入3.5~4.5 mm。在这一区域记录到吸气神经元放电), 然后将一充灌有5% WGA-HRP的玻璃微管(尖端直径15 μm)插入该区域。玻璃微管与纳升泵相连, 用于微量注射。注射量为15~30 nl, 单侧。
1.2 HRP反应动物存活72 h后给予深麻醉(NembutalTM, 50 mg/kg, ip), 左心室插管灌流。部分动物(3例)在灌流前24 h侧脑室内注射秋水仙碱(colchicine) 300 μg。灌流液依次为: 1?000 ml肝素化的0.05 mol/L PBS (37℃), ?1000 ml含有3%多聚甲醛-0.125%戊二醛-15%苦味酸饱和液的0.1 mol/L PBS (4℃)。取脑, 置于20%蔗糖PBS中, 4℃保存。5 d后切成连续冰冻切片(40 μm)备用。HRP反应按改良TMB方法进行[10]。反应后的切片置于含有0.05% DAB-0.01% H2O2-0.02% CoAc的TBS中孵育30 min, 以稳定TMB反应产物。
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1.3 抗5-HT免疫荧光染色HRP反应后的切片进一步进行抗5-HT免疫荧光染色。一次抗体: 兔抗5-HT抗体(DiaSorin), 1∶1?000稀释, 20℃孵育72 h; 二次抗体: FITC共轭抗兔IgG抗体(Vector), 1∶100稀释, 20℃孵育24 h。PBS冲洗, VECTASHIELD封片介质封片, 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察结果。
2结果
2.1 HRP标记神经元的分布
延髓: 在延髓腹外侧, HRP标记神经元存在于疑核及其周围网状结构, 形成一嘴-尾走向的柱状结构。向尾端延伸到颈髓C1节段中间内侧区, 向嘴端延伸到面神经后核腹内侧区。在延髓背侧的孤束核腹外侧存在密集的标记神经元。标记神经元主要分布于HRP注射对侧, 为中型多角形细胞, 直径在30~40 μm。脑桥: HRP标记神经元分布于注射同侧的KF和蓝斑核,以小型圆形、 椭圆形细胞为主(15~30 μm)。中缝核:在延髓中缝核群观察到大量HRP标记神经元。中缝苍白核标记神经元密度最大,以小型圆形、 椭圆形细胞为主(15~30 μm)。中缝大核标记细胞以中型三角形、 多角形细胞为主(30~40 μm)。中缝隐核标记神经元密度较低, 以小型梭型细胞为主。另外在延髓外侧网状核、 旁巨细胞核、 斜方体后核观察到少数标记神经元, 主要分布于注射同侧。
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2.2 5-HT免疫阳性神经元的分布
5-HT免疫阳性神经元主要存在于中缝核群、 脑桥背侧被盖灰质、 延髓外侧网状核等结构, 为小型至中型(15~40 μm)的圆形、 椭圆形或梭形细胞。其中中缝苍白核5-HT免疫阳性神经元密度最大。
2.3 HRP标记的5-HT免疫阳性神经元(HRP-5-HT双标记神经元)的分布
HRP-5-HT双标记神经元主要存在于中缝苍白核(2~4/切片), 少数存在于中缝隐核、 中缝大核、 外侧网状核(0~1/切片)。
2.4 5-HT免疫阳性纤维末梢在脑干呼吸相关结构的分布
在疑核区域观察到大量阳性纤维末梢, 尤其是在嘴端靠近面神经后核的区域密度较高。该区域为前包钦格复合体(pre-Btzinger complex)所在部位。在KF核及孤束核腹外侧区域亦观察到阳性纤维末梢, 但密度较低。在上述区域观察到的部分HRP标记神经元的周围往往观察到呈串珠状的5-HT免疫阳性纤维末梢, 见图2。3讨论
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本研究观察到, 中枢5-HT能神经元集中存在于中缝核群及延髓外侧网状核、 脑桥被盖灰质等结构, 与以往的报道基本一致[11~13]。HRP注入脊髓膈神经核后, 部分中缝苍白核5-HT能神经元可被HRP逆行标记, 表明这些神经元的轴突投射到脊髓膈神经核。这一结果提示, 电刺激中缝苍白核导致的膈神经吸气放电兴奋可能是由5-HT所中介的。本实验在中缝大核、中缝隐核观察到一定数量的HRP标记神经元和5-HT能神经元, 但仅观察到个别散在的HRP-5-HT双标记神经元。这一研究结果进一步证实, 电刺激中缝大核所导致的膈神经吸气放电抑制不是由5-HT所中介的。
WGA-HRP注入脊髓膈神经核后在疑核、 孤束核腹外侧区、 KF核等结构, 观察到大量HRP逆行标记神经元, 与以往报道一致[14,15]。这些神经元为膈肌前运动神经元, 与膈肌运动神经元构成单突触联系, 参与膈肌运动的控制[16]。值得注意的是在蓝斑核、 斜方体后核观察到了HRP标记神经元。另外, 在疑核及孤束核腹外侧区的HRP标记神经元周围观察到大量5-HT能末梢纤维。它们可能来自延髓中缝核。Smith等[9]报道, WGA-HRP微量注入疑核及孤束核腹外侧呼吸神经元密集区域后在延髓中缝核观察到大量逆行标记神经元, 表明延髓中缝核神经元轴突投射到延髓膈肌前运动神经元。
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中缝核群不同亚核对呼吸节律具有不同的影响, 中缝大核和中缝隐核抑制吸气, 而中缝苍白核、 中缝背核兴奋吸气[4,6,7]。曾有报道, 在中缝大核中存在GABA能神经元, 其轴突投射到脊髓膈神经核[17], 证实中缝大核对吸气的抑制作用是由GABA中介的[18,19]。本研究结果显示中缝苍白核对吸气的兴奋作用可能是由5-HT所中介。中缝大核与中缝苍白核之间有无功能联系？GABA与5-HT在呼吸神经元水平上是否有交互影响？这些是值得深入研究的问题。
参考文献
[1]Lalley PM, Bischoff AM, Richter DW. Serotonin 1 α-receptor activation suppresses respiratory apneusis in the cat. Neurosci Lett, 1994, 172:59~62.
[2]Lally PM. The excitability and rhythm of medullary respiratory neurons in the cat are altered by the serotonin receptor agonist 5-methoxy-N,N,dimethyltryptamine. Brain Res, 1994, 648:87~98.
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[3]Morin D, Monteau R, Hilaire G. Compared effects of serotonin on cervical and hypoglossal inspiratory activities: an in vitro study in the newborn rat. J Physiol (London), 1992, 451:605~629.
[4]Lalley PM. Responses in phrenic motoneurons of the cat to stimulation of medullary raphe nuclei. J Physiol (London), 1986, 380:349~371.
[5]Aoki M, Fujito Y, Kurosawa H et al. Descending inputs to the upper cervical inspiratory neurons from the medullary respiratory neurons and the raphe nuclei in the cat. In: Sieck GC, et al eds. Respiratory Muscles and Their Neuromotor Control. New York: Liss, 1987, 75~82.
, 百拇医药
[6]Wang YT (王玉田), Wang N (王 楠), Liu L (刘 磊). Studies on respiratory phase-switching effects of nucleus raphe magnus. Science Bull (科学通报), 1987, 10:782~786 (Chinese).
[7]Song G (宋 刚), Liu L (刘 磊). Respiratory related neurons in the nucleus raphe magnus of rabbit. Acta Acad Med Shandong (山东医科大学学报), 1988, 26(4):32~35 (Chinese).
[8]Song G, Sato Y, Kohama I et al. Afferent projections to the Btzinger complex from the upper cervical cord and other respiratory related structures in the brainstem in cats: Retrograde WGA-HRP tracing. J Auton Nerve Syst, 1995, 56:1~7.
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[9]Smith JC, Morrison DE, Ellenberger HH et al. Brainstem projections to the major respiratory neuron population in the medulla of the cat. J Comp Neurol, 1989, 281:69~96.
[10]Gibson AR, Hansma DI, Houk JC et al. A sensitive low artifact TMB procedure for the demonstration of WGA-HRP in the CNS. Brain Res, 1984, 298:235~241.
[11]Jacobs BL, Gannon PJ, Azmitia EC. Atlas of serotonergic cell bodies in the cat brainstem: an immunocytochemical analysis. Brain Res Bull, 1984, 13:1~31.
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[12]Takeuchi Y, Kimura H, Sano Y. Immunohistochemical de~mon~stration of the distribution of serotonin neurons in the brainstem of the rat and cat. Cell Tissue Res, 1982, 224:247~267.
[13]Kobayashi Y, Matsuyama K, Mori S. Distribution of serotonin cells projecting to the pontomedullary reticular formation in the cat. Neurosci Res, 1994, 20:43~55.
[14]Rikard-Bell GC, Bystrzycka EK, Nail BS. The identification of brainstem neurones projecting to thoracic respiratory moto-neurones in the cat as demonstrated by retrograde transport of HRP. Brain Res Bull, 1985, 14:25~37.
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[15]Onai T, Saji M, Miura M. Projections of supraspinal structures to the phrenic motor nucleus in rats studied by a horseradish peroxidase microinjection method. J Auton Nerve Syst, 1987, 21:233~239.
[16]Dobbins EG, Feldman JL. Brainstem network controlling descending drive to phrenic motoneurons in rat. J Comp Neurol, 1994, 347:64~86.
[17]Song G (宋 刚), Li Q (李 勤), Shao FZ (邵凤之). GABAergic neurons in Klliker-Fuse nucleus and Btzinger complex with axons projecting to phrenic nucleus. Acta Physiol Sin (生理学报), 2000, 52(2):167~169.
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[18]Yuan ZY (袁中瑞), Song G (宋 刚), Zhang H (张 衡) et al. Picrotoxin blocks the inspiratory inhibiting effects of Btzinger complex. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1998, 14:315, 342 (Chinese, English abstract).
[19]Fedorko L, Connely CA, Remmers JE. Neurotransmitters mediating synaptic inhibition of phrenic motoneurons. In: Sieck GC et al eds. Respiratory Muscles and Their Neuromotor Control. New York: Liss, 1987, 167~173., 百拇医药
关键词：5-HT能神经元；中缝核；膈神经核；抗5-HT抗体；WGA-HRP
摘要：实验在6只成年猫上进行。将WGA-HRP微量注入C5膈神经核内, 通过逆行追踪及5-HT免疫组织化学FITC荧光双重标记方法, 研究了中缝核5-HT能神经元向脊髓膈神经核的投射, 同时观察了延髓膈肌前运动神经元接受5-HT能纤维投射的情况。结果在中缝苍白核观察到较多的HRP-5-HT双标记神经元, 在中缝大核、 中缝隐核观察到少数散在的双标记神经元。在延髓疑核、 孤束核腹外侧区域的HRP单标记神经元(即膈肌前运动神经元)周围观察到5-HT能轴突末梢。结果表明: 发自中缝苍白核5-HT能神经元的传出纤维可投射到脊髓膈神经核; 延髓膈肌前运动神经元接受5-HT能纤维的传入投射。
已有众多研究显示, 5-HT与呼吸节律调节有密切关系。 例如, 在长吸呼吸动物, 系统使用5-HT受体激动剂可逆转长吸呼吸[1], 脊髓膈神经核局部使用5-HT导致膈神经吸气放电幅度增高等[2, 3]。 5-HT能神经元集中存在于中缝核群。 Lalley[4]、 Aoki[5]、 及本研究室[6, 7]曾发现, 电刺激中缝大核导致强烈的吸气抑制, 电刺激中缝苍白核则导致吸气兴奋。组织学研究表明, 发自中缝核群的纤维投射到延髓呼吸神经元群及脊髓膈神经核[8,9]。 然而这些投射纤维是否为5-HT能纤维？ 中缝核群的5-HT能神经元轴突是否投射到脊髓膈神经核？至今尚未见系统研的究报道。
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1材料和方法
1.1 HRP注射实验在6只成年猫(体重1.8~2.5 kg)上进行。苯巴比妥钠(NembutalTM, 30 mg/kg, ip)麻醉, 固定于SN-3立体定向仪上。从背侧暴露颈段脊髓C4~6节段。首先用细胞外记录方法确定膈运动神经元群所在的区域(中线旁1.5~2.5 mm, 自表面深入3.5~4.5 mm。在这一区域记录到吸气神经元放电), 然后将一充灌有5% WGA-HRP的玻璃微管(尖端直径15 μm)插入该区域。玻璃微管与纳升泵相连, 用于微量注射。注射量为15~30 nl, 单侧。
1.2 HRP反应动物存活72 h后给予深麻醉(NembutalTM, 50 mg/kg, ip), 左心室插管灌流。部分动物(3例)在灌流前24 h侧脑室内注射秋水仙碱(colchicine) 300 μg。灌流液依次为: 1?000 ml肝素化的0.05 mol/L PBS (37℃), ?1000 ml含有3%多聚甲醛-0.125%戊二醛-15%苦味酸饱和液的0.1 mol/L PBS (4℃)。取脑, 置于20%蔗糖PBS中, 4℃保存。5 d后切成连续冰冻切片(40 μm)备用。HRP反应按改良TMB方法进行[10]。反应后的切片置于含有0.05% DAB-0.01% H2O2-0.02% CoAc的TBS中孵育30 min, 以稳定TMB反应产物。
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1.3 抗5-HT免疫荧光染色HRP反应后的切片进一步进行抗5-HT免疫荧光染色。一次抗体: 兔抗5-HT抗体(DiaSorin), 1∶1?000稀释, 20℃孵育72 h; 二次抗体: FITC共轭抗兔IgG抗体(Vector), 1∶100稀释, 20℃孵育24 h。PBS冲洗, VECTASHIELD封片介质封片, 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察结果。
2结果
2.1 HRP标记神经元的分布
延髓: 在延髓腹外侧, HRP标记神经元存在于疑核及其周围网状结构, 形成一嘴-尾走向的柱状结构。向尾端延伸到颈髓C1节段中间内侧区, 向嘴端延伸到面神经后核腹内侧区。在延髓背侧的孤束核腹外侧存在密集的标记神经元。标记神经元主要分布于HRP注射对侧, 为中型多角形细胞, 直径在30~40 μm。脑桥: HRP标记神经元分布于注射同侧的KF和蓝斑核,以小型圆形、 椭圆形细胞为主(15~30 μm)。中缝核:在延髓中缝核群观察到大量HRP标记神经元。中缝苍白核标记神经元密度最大,以小型圆形、 椭圆形细胞为主(15~30 μm)。中缝大核标记细胞以中型三角形、 多角形细胞为主(30~40 μm)。中缝隐核标记神经元密度较低, 以小型梭型细胞为主。另外在延髓外侧网状核、 旁巨细胞核、 斜方体后核观察到少数标记神经元, 主要分布于注射同侧。
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2.2 5-HT免疫阳性神经元的分布
5-HT免疫阳性神经元主要存在于中缝核群、 脑桥背侧被盖灰质、 延髓外侧网状核等结构, 为小型至中型(15~40 μm)的圆形、 椭圆形或梭形细胞。其中中缝苍白核5-HT免疫阳性神经元密度最大。
2.3 HRP标记的5-HT免疫阳性神经元(HRP-5-HT双标记神经元)的分布
HRP-5-HT双标记神经元主要存在于中缝苍白核(2~4/切片), 少数存在于中缝隐核、 中缝大核、 外侧网状核(0~1/切片)。
2.4 5-HT免疫阳性纤维末梢在脑干呼吸相关结构的分布
在疑核区域观察到大量阳性纤维末梢, 尤其是在嘴端靠近面神经后核的区域密度较高。该区域为前包钦格复合体(pre-Btzinger complex)所在部位。在KF核及孤束核腹外侧区域亦观察到阳性纤维末梢, 但密度较低。在上述区域观察到的部分HRP标记神经元的周围往往观察到呈串珠状的5-HT免疫阳性纤维末梢, 见图2。3讨论
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本研究观察到, 中枢5-HT能神经元集中存在于中缝核群及延髓外侧网状核、 脑桥被盖灰质等结构, 与以往的报道基本一致[11~13]。HRP注入脊髓膈神经核后, 部分中缝苍白核5-HT能神经元可被HRP逆行标记, 表明这些神经元的轴突投射到脊髓膈神经核。这一结果提示, 电刺激中缝苍白核导致的膈神经吸气放电兴奋可能是由5-HT所中介的。本实验在中缝大核、中缝隐核观察到一定数量的HRP标记神经元和5-HT能神经元, 但仅观察到个别散在的HRP-5-HT双标记神经元。这一研究结果进一步证实, 电刺激中缝大核所导致的膈神经吸气放电抑制不是由5-HT所中介的。
WGA-HRP注入脊髓膈神经核后在疑核、 孤束核腹外侧区、 KF核等结构, 观察到大量HRP逆行标记神经元, 与以往报道一致[14,15]。这些神经元为膈肌前运动神经元, 与膈肌运动神经元构成单突触联系, 参与膈肌运动的控制[16]。值得注意的是在蓝斑核、 斜方体后核观察到了HRP标记神经元。另外, 在疑核及孤束核腹外侧区的HRP标记神经元周围观察到大量5-HT能末梢纤维。它们可能来自延髓中缝核。Smith等[9]报道, WGA-HRP微量注入疑核及孤束核腹外侧呼吸神经元密集区域后在延髓中缝核观察到大量逆行标记神经元, 表明延髓中缝核神经元轴突投射到延髓膈肌前运动神经元。
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中缝核群不同亚核对呼吸节律具有不同的影响, 中缝大核和中缝隐核抑制吸气, 而中缝苍白核、 中缝背核兴奋吸气[4,6,7]。曾有报道, 在中缝大核中存在GABA能神经元, 其轴突投射到脊髓膈神经核[17], 证实中缝大核对吸气的抑制作用是由GABA中介的[18,19]。本研究结果显示中缝苍白核对吸气的兴奋作用可能是由5-HT所中介。中缝大核与中缝苍白核之间有无功能联系？GABA与5-HT在呼吸神经元水平上是否有交互影响？这些是值得深入研究的问题。
参考文献
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