心室成纤维细胞条件培养液促进成纤维细胞胶原合成和增殖
中山医科大学生理学教研室；广州 510089 龚素珍；刘培庆；鲁伟；王庭槐；符史干；潘敬运*
关键词：心室成纤维细胞；[3H]-脯氨酸；[3H]-胸腺嘧啶核苷；c-fos mRNA；心脏
摘要：采用心室成纤维细胞条件培养液培养心室成纤维细胞, 通过测定[3H]-脯氨酸([3H]-proline)的掺入率来了解心室成纤维细胞总胶原合成速率, 通过测定[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)的掺入率以及c-fos基因的表达丰度来了解心室成纤维细胞的增殖速率。结果显示: 心室成纤维细胞条件培养液(FCGM)能明显增加细胞自身的[3H]-proline的掺入率和[3H]-TdR的掺入率, 并具有剂量依赖性; FCGM也能促进细胞自身c-fos基因的表达, 刺激后1 h达高峰。ETA受体拮抗剂BQ123能部分阻断FCGM增加成纤维细胞胶原合成和增殖作用, 而AT1受体拮抗剂CV11974和α-肾上腺素受体拮抗剂regitin无此效果。结果提示: 心室成纤维细胞具有自分泌功能, 能分泌内皮素等生物活性物质, 促进成纤维细胞胶原的合成和增殖。
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在心脏重塑中, 除了心肌细胞肥大外, 心脏成纤维细胞的增殖以及细胞外基质的增多也起着关键作用。成纤维细胞占心脏细胞总数的70%, 是胶原和fibronectin的主要来源, 且胶原和fibronectin是心脏细胞外基质的主要成分。有文献报道, 心脏成纤维细胞具有旁分泌功能, 能分泌生长因子[1,2]和细胞因子[3], 影响其邻近心肌细胞的结构和功能, 但它们是否能影响成纤维细胞自身的胶原合成以及增殖作用, 目前尚无报道。我们也发现, 心脏成纤维细胞能分泌促进心肌肥大的因子, 可促进新生大鼠心室心肌细胞肥大和增加心肌细胞搏动频率的作用。 本实验主要探讨心脏成纤维细胞是否具有自分泌功能, 以及此功能是否影响自身胶原合成和增殖作用。
1材料和方法
1.1心室成纤维细胞的分离和培养取1~3 d龄的SD大鼠(雌雄不限, 中山医科大学实验动物中心提供), 在无菌条件下开胸剪取心室肌。用胰蛋白酶消化获取心肌细胞和成纤维细胞。采用差速贴壁1 h, 获得成纤维细胞。实验采用已传1~2代的成纤维细胞。
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1.2心室成纤维细胞条件培养液的获取将已传代的成纤维细胞接种于50 ml的玻璃培养瓶至融合状态, 在含1%血清的DMEM培养液中孵育24 h, 然后置入8 ml/瓶的无血清培养液(DMEM、胰岛素10 μg/ml、转铁蛋白10 μg/ml、 Vit C 100 μmol/L, Vit B12 1.5 μmol/L青霉素、 100 U/ml、 链霉素100 μg/ml)。培养成纤维细胞3 d后, 收集全部培养液, 即为成纤维细胞条件培养液(fibroblast conditioned growth medium, FCGM)。
1.3心室成纤维细胞[3H]-脯氨酸([3H]-proline)掺入测定将已传代1~2次的成纤维细胞接种于24孔培养板上, 每孔1 ml (1×105细胞/ml), 每4孔为一组。待细胞至亚融合状态, 将生长培养基(含10%血清)换为含1%血清DMEM培养液培养24 h; 再换为含有[3H]-proline 3.7×104 Bq/孔(北京原子能研究所)[4]以及各种处理因素的FCGM, 继续培养48 h。 然后用D-Hanks液充分冲洗, 以洗去游离的同位素, 在将细胞收集于玻璃纤维滤膜上, 用10%三氯乙酸和无水乙醇再冲洗。滤膜烘干后置于含4 ml闪烁液的液闪杯中, 用FJ-2107P液体闪烁仪(国营二六二厂制造)测定放射性强度。实验均重复3次。
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1.4心室成纤维细胞[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入测定将已传代1~2次的成纤维细胞接种于24孔培养板上, 每孔1 ml(1×105细胞/ml), 每4孔为一组。待细胞至亚融合状态, 将生长培养基(含10%血清)换为含1%血清DMEM培养液培养24 h, 然后加入含各种干扰因素的FCGM培养12 h, 再加入[3H]-TdR 3.7×104 Bq/孔(北京原子能研究所)[5]继续培养12 h, 其它步骤与1.3相同。
1.5心室成纤维细胞c-fos mRNA的表达收获4×105细胞/ml, 用TRIzol试剂盒(美国life Technologies 公司)提取细胞总RNA。总RNA提取后, 用紫外分光光度计测定其浓度和纯度, 计算样品总RNA浓度。c-fos mRNA寡聚核苷酸引物合成是根据李昭波等的论文[4]: 上游5′-GGG CTC TCC TGT CAA C-3′, 下游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′(上海生物工程公司), 用这对引物可扩增出长度为510 bp的c-fos cDNA片段; GAPDH mRNA寡聚核苷酸引物是根据Fort等[5]发表的大鼠组织的序列设计合成的: 上游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′, 下游5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′, 这对引物可扩增出长度为443 bp的GAPDH cDNA片段。取样品总RNA2 μg, 分别用0.4 μmol/L特异性的 c-fos mRNA引物和GAPDH mRNA引物, 采用TitanTM一步法RT-PCR试剂盒(BOEHRINGER MANNHEIM 公司)进行逆转录聚合酶链式反应, 总反应体积为50 μl。取RT-PCR产物8 μl, 加2 μl上样缓冲液, 在含0.5 μg/ml溴化乙淀的1.5%琼脂糖凝胶上电泳, 80 V, 45 min, 用GDS凝胶成像系统拍摄打印实验结果。
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1.6统计学处理所有实验均重复3次, 数据均以mean±SD表示, 组间数据处理根据处理方差齐性分析结果, 采用非配对t检验。
2结果
2.1FCGM对培养新生大鼠心室成纤维细胞[3H]-proline掺入的影响
用第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液混合, 配成含不同百分比(100%、80%、60%、40%和20%)的FCGM培养液培养成纤维细胞48 h, 然后测定[3H]-proline掺入。随着FCGM百分比含量增加, 成纤维细胞[3H]-proline的掺入也进一步增加, 呈量效反应关系。与无血清DMEM培养液(C)相比, 含40%以上的FCGM的培养液能增加成纤维细胞[3H]-proline掺入。成纤维细胞数为1×105个/ml。
2.2不同受体阻断剂对FCGM促进成纤维细胞[3H]-proline掺入的影响
, 百拇医药
第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液(C)比较, FCGM能明显增加成纤维细胞的[3H]-proline掺入。ETA受体拮抗剂BQ123 (1×10-6 mol/L)可以阻断FCGM的这种作用, 血管紧张素Ⅱ AT1受体拮抗剂CV11974 (1×10-6 mol/L)和α-肾上腺素受体阻断剂regitin (1×10-6 mol/L)无阻断作用。成纤维细胞数为1×105个/ml。
2.3FCGM对成纤维细胞[3H]-TdR掺入的影响
用第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液混合, 配成含不同百分比(100%、80%、60%、40%和20%)的FCGM培养液培养成纤维细胞24 h, 然后测定[3H]-TdR掺入。与无血清DMEM培养液(C)相比, 含40%以上的FCGM的培养液能增加成纤维细胞[3H]-TdR掺入, 且呈量效反应关系。成纤维细胞数为1×105个/ml。
, http://www.100md.com 2.4不同受体阻断剂对FCGM促进成纤维细胞[3H]- TdR掺入的影响
第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液(C)比较, FCGM能明显增加成纤维细胞的[3H]- TdR掺入。ETA受体拮抗剂BQ123 (1×10-6 mol/L)可以阻断FCGM的这种作用, AT1受体拮抗剂CV11974(1×10-6 mol/L)和α-肾上腺素受体阻断剂regitin (1×10-6 mol/L)无阻断作用。成纤维细胞数为1×105个/ml。
2.5FCGM对成纤维细胞c-fos 基因表达的影响
2.5.1FCGM作用的时间过程用第3天收集的FCGM分别作用于成纤维细胞0、15、30、60、120、240 min, 观察c-fos 基因表达的变化。结果显示, c-fos 基因于 FCGM 作用后15 min开始表达, 60 min达高峰, 240 min表达仍可见。
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2.5.2BQ123的作用用BQ123(1×10-6 mol/L)预处理培养心室成纤维细胞2 h后, 再加入FCGM作用1 h, c-fos 基因表达明显减弱, 但BQ123本身对c-fos 基因表达无明显的影响。
3讨论
本实验证明, FCGM能明显促进培养新生大鼠心室成纤维细胞[3H]-proline和[3H]-TdR掺入, 且具有剂量依赖性; FCGM也能诱导成纤维细胞的c-fos 基因表达, 表明心室成纤维细胞也具有自分泌作用, 能促进细胞自身胶原的合成和增殖。ETA受体阻断剂BQ123 能部分阻断FCGM促进成纤维细胞增殖和胶原合成的作用, 而血管紧张素Ⅱ的AT1受体阻断剂和α-肾上腺素受体阻断剂regitin却无明显的抑制作用, 进一步证实心室成纤维细胞分泌的活性物质有可能通过ETA受体起作用。
心脏重塑是一个复杂的过程, 包括心肌细胞的肥大、成纤维细胞增殖和细胞外基质的累积。心脏成纤维细胞在心脏重塑中起重要作用, 它参与三个重塑过程。一方面, 心脏成纤维细胞在未受到刺激时具有旁分泌功能, 能分泌肥大因子促进心肌细胞肥大[1，3]; 另一方面, 某些生长因子, 如血管紧张素Ⅱ和去甲肾上腺素, 对心肌细胞的肥大作用也是通过成纤维细胞介导的。心脏成纤维细胞除了具有旁分泌功能外, 也具有自分泌功能。Ashizawa 等报道, 大鼠心室成纤维细胞分泌成骨素(osteopontin), 介导血管紧张素Ⅱ促进成纤维细胞增殖和胶原收缩[6]。 而Ashizawa等则报道, 心脏成纤维细胞能分泌前列腺环素(prostacyclin)抑制其自身的胶原合成[7]; 缓激肽(bradykinin)对心脏成纤维细胞的胶原合成抑制作用也是通过成纤维细胞自身分泌prostacyclin介导的[8]。我们的实验结果显示, 新生大鼠心室成纤维细胞能分泌ET, 促进成纤维细胞的胶原合成和增殖。
, 百拇医药
内皮素类(ET-1, ET-2, ET-3)除了具有强烈的血管收缩、促心肌细胞肥大作用外, 对成纤维细胞也具有丝裂原作用。ET-1既能增加皮肤成纤维细胞的胶原合成和增殖[9], 也能引起皮肤成纤维细胞基因表型改变[10]。ET-1和ET-3均能以剂量依赖性方式, 增加心脏成纤维细胞胶原合成, 且这种作用通过ETA受体和ETB受体中介。本实验观察到, FCGM促进心脏成纤维细胞胶原合成和增殖的可能是ET-1, 而且是通过ETA受体介导的。
c-fos 和c-jun是早期基因中参与基因转录的典型代表, 蛋白FOS和JUN相互作用形成二聚体复合物AP-1转录因子, 该转录因子参与细胞的增殖、分化和转化的调控。c-Fos和c-Jun蛋白可被佛波脂、血清、生长因子、细胞因子等刺激迅速诱导, 被称为细胞内信号转导的第三信使, 基因转录调控的分子开关。因此, FCGM能诱导心室成纤维细胞c-fos 基因的表达, 表明c-fos 基因有可能参与FCGM促进成纤维细胞增殖作用。
, 百拇医药
参考文献
[1]Harada M, Itoh H, Nakagawa O et al. Significance of ventricular myocytes and nonmyocytes interaction during cardiocyte hypertrophy. Circulation, 1997, 96: 3737~3744.
[2]Guo WN, Kamiya K, Yasui K et al. Paracrine hypertrophic factors from cardiac non-myocyte cells downregulate the transient outward current density and kV 4.2 K+ channel expression in cultured rat cardiomyocytes. Cardiovasc Res, 1999, 41: 157~165.
, 百拇医药
[3]Kuwahara K, Saito Y, Harada M et al. Involvement of cardiotrophin-1 in cardiac myocyte-nonmyocyte interactions during hypertrophy of rat cardiac myocytes in vitro. Circulation, 1999, 100: 1116~1124.
[4]Wang HX (王洪新), Tao L (陶 亮), Rao MR (饶曼人). Inhibitory effects of nifedipine and DNA protein synthesis in cultured cardiac nonmyocytes of neonatal rats. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1997, 18 (2): 136~139.
[5]Li ZB (李昭波), Gao YQ (高云秋), Tang CS (唐朝枢). Effect of exercise of expression of c-fos and ANF gene in spontaneously hypertensive rats. Chin Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1999, 15 (3): 242~245 (Chinese, English abstract).
, http://www.100md.com
[6]Fort P, Marty L, Piechaczyk M et al. Various rat adult tissues express only one major mRNA species from the glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase multigenic family. Nucleic Acids Res, 1985, 13: 1431~1435.
[7]Ashizawa N, Grat K, Yung S. Osteopontin is produced by rat cardiac fibroblast and mediates ATⅡ-induced DNA synthesis and collagen gel contraction. J Clin Invest, 1996, 98: 2218~2227.
[8]Yu H, Gallagher AM, Garfin PM et al. Prostacyclin release by rat cardiac fibroblasts. Inhibition of collagen expression. Hypertension, 1997, 30: 1047~1053.
, http://www.100md.com
[9]Gallagher AM, Yu H, Printz MP. Bradykinin-induced reductions in collagen gene expression involve prostacyclin. Hypertension, 1998, 32: 84~88.
[10]Kahaleh MB. Endothelin, an endothelial-dependent vasoconstrictor in scleroderma: enhanced production and profibrotic action. Arthritis Rheum, 1991, 34: 978~983.
[11]Xu SW, Denton CP, Holmes A et al. Endothelins: effect on matrix biosynthesis and proliferation in normal and scleroderma fibroblasts. J Cardiovas Pharmacol, 1998, 31 (Suppl 1): S360~S363., 百拇医药
关键词：心室成纤维细胞；[3H]-脯氨酸；[3H]-胸腺嘧啶核苷；c-fos mRNA；心脏
摘要：采用心室成纤维细胞条件培养液培养心室成纤维细胞, 通过测定[3H]-脯氨酸([3H]-proline)的掺入率来了解心室成纤维细胞总胶原合成速率, 通过测定[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)的掺入率以及c-fos基因的表达丰度来了解心室成纤维细胞的增殖速率。结果显示: 心室成纤维细胞条件培养液(FCGM)能明显增加细胞自身的[3H]-proline的掺入率和[3H]-TdR的掺入率, 并具有剂量依赖性; FCGM也能促进细胞自身c-fos基因的表达, 刺激后1 h达高峰。ETA受体拮抗剂BQ123能部分阻断FCGM增加成纤维细胞胶原合成和增殖作用, 而AT1受体拮抗剂CV11974和α-肾上腺素受体拮抗剂regitin无此效果。结果提示: 心室成纤维细胞具有自分泌功能, 能分泌内皮素等生物活性物质, 促进成纤维细胞胶原的合成和增殖。
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在心脏重塑中, 除了心肌细胞肥大外, 心脏成纤维细胞的增殖以及细胞外基质的增多也起着关键作用。成纤维细胞占心脏细胞总数的70%, 是胶原和fibronectin的主要来源, 且胶原和fibronectin是心脏细胞外基质的主要成分。有文献报道, 心脏成纤维细胞具有旁分泌功能, 能分泌生长因子[1,2]和细胞因子[3], 影响其邻近心肌细胞的结构和功能, 但它们是否能影响成纤维细胞自身的胶原合成以及增殖作用, 目前尚无报道。我们也发现, 心脏成纤维细胞能分泌促进心肌肥大的因子, 可促进新生大鼠心室心肌细胞肥大和增加心肌细胞搏动频率的作用。 本实验主要探讨心脏成纤维细胞是否具有自分泌功能, 以及此功能是否影响自身胶原合成和增殖作用。
1材料和方法
1.1心室成纤维细胞的分离和培养取1~3 d龄的SD大鼠(雌雄不限, 中山医科大学实验动物中心提供), 在无菌条件下开胸剪取心室肌。用胰蛋白酶消化获取心肌细胞和成纤维细胞。采用差速贴壁1 h, 获得成纤维细胞。实验采用已传1~2代的成纤维细胞。
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1.2心室成纤维细胞条件培养液的获取将已传代的成纤维细胞接种于50 ml的玻璃培养瓶至融合状态, 在含1%血清的DMEM培养液中孵育24 h, 然后置入8 ml/瓶的无血清培养液(DMEM、胰岛素10 μg/ml、转铁蛋白10 μg/ml、 Vit C 100 μmol/L, Vit B12 1.5 μmol/L青霉素、 100 U/ml、 链霉素100 μg/ml)。培养成纤维细胞3 d后, 收集全部培养液, 即为成纤维细胞条件培养液(fibroblast conditioned growth medium, FCGM)。
1.3心室成纤维细胞[3H]-脯氨酸([3H]-proline)掺入测定将已传代1~2次的成纤维细胞接种于24孔培养板上, 每孔1 ml (1×105细胞/ml), 每4孔为一组。待细胞至亚融合状态, 将生长培养基(含10%血清)换为含1%血清DMEM培养液培养24 h; 再换为含有[3H]-proline 3.7×104 Bq/孔(北京原子能研究所)[4]以及各种处理因素的FCGM, 继续培养48 h。 然后用D-Hanks液充分冲洗, 以洗去游离的同位素, 在将细胞收集于玻璃纤维滤膜上, 用10%三氯乙酸和无水乙醇再冲洗。滤膜烘干后置于含4 ml闪烁液的液闪杯中, 用FJ-2107P液体闪烁仪(国营二六二厂制造)测定放射性强度。实验均重复3次。
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1.4心室成纤维细胞[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入测定将已传代1~2次的成纤维细胞接种于24孔培养板上, 每孔1 ml(1×105细胞/ml), 每4孔为一组。待细胞至亚融合状态, 将生长培养基(含10%血清)换为含1%血清DMEM培养液培养24 h, 然后加入含各种干扰因素的FCGM培养12 h, 再加入[3H]-TdR 3.7×104 Bq/孔(北京原子能研究所)[5]继续培养12 h, 其它步骤与1.3相同。
1.5心室成纤维细胞c-fos mRNA的表达收获4×105细胞/ml, 用TRIzol试剂盒(美国life Technologies 公司)提取细胞总RNA。总RNA提取后, 用紫外分光光度计测定其浓度和纯度, 计算样品总RNA浓度。c-fos mRNA寡聚核苷酸引物合成是根据李昭波等的论文[4]: 上游5′-GGG CTC TCC TGT CAA C-3′, 下游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′(上海生物工程公司), 用这对引物可扩增出长度为510 bp的c-fos cDNA片段; GAPDH mRNA寡聚核苷酸引物是根据Fort等[5]发表的大鼠组织的序列设计合成的: 上游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′, 下游5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′, 这对引物可扩增出长度为443 bp的GAPDH cDNA片段。取样品总RNA2 μg, 分别用0.4 μmol/L特异性的 c-fos mRNA引物和GAPDH mRNA引物, 采用TitanTM一步法RT-PCR试剂盒(BOEHRINGER MANNHEIM 公司)进行逆转录聚合酶链式反应, 总反应体积为50 μl。取RT-PCR产物8 μl, 加2 μl上样缓冲液, 在含0.5 μg/ml溴化乙淀的1.5%琼脂糖凝胶上电泳, 80 V, 45 min, 用GDS凝胶成像系统拍摄打印实验结果。
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1.6统计学处理所有实验均重复3次, 数据均以mean±SD表示, 组间数据处理根据处理方差齐性分析结果, 采用非配对t检验。
2结果
2.1FCGM对培养新生大鼠心室成纤维细胞[3H]-proline掺入的影响
用第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液混合, 配成含不同百分比(100%、80%、60%、40%和20%)的FCGM培养液培养成纤维细胞48 h, 然后测定[3H]-proline掺入。随着FCGM百分比含量增加, 成纤维细胞[3H]-proline的掺入也进一步增加, 呈量效反应关系。与无血清DMEM培养液(C)相比, 含40%以上的FCGM的培养液能增加成纤维细胞[3H]-proline掺入。成纤维细胞数为1×105个/ml。
2.2不同受体阻断剂对FCGM促进成纤维细胞[3H]-proline掺入的影响
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第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液(C)比较, FCGM能明显增加成纤维细胞的[3H]-proline掺入。ETA受体拮抗剂BQ123 (1×10-6 mol/L)可以阻断FCGM的这种作用, 血管紧张素Ⅱ AT1受体拮抗剂CV11974 (1×10-6 mol/L)和α-肾上腺素受体阻断剂regitin (1×10-6 mol/L)无阻断作用。成纤维细胞数为1×105个/ml。
2.3FCGM对成纤维细胞[3H]-TdR掺入的影响
用第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液混合, 配成含不同百分比(100%、80%、60%、40%和20%)的FCGM培养液培养成纤维细胞24 h, 然后测定[3H]-TdR掺入。与无血清DMEM培养液(C)相比, 含40%以上的FCGM的培养液能增加成纤维细胞[3H]-TdR掺入, 且呈量效反应关系。成纤维细胞数为1×105个/ml。
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第3天收集的FCGM与无血清DMEM培养液(C)比较, FCGM能明显增加成纤维细胞的[3H]- TdR掺入。ETA受体拮抗剂BQ123 (1×10-6 mol/L)可以阻断FCGM的这种作用, AT1受体拮抗剂CV11974(1×10-6 mol/L)和α-肾上腺素受体阻断剂regitin (1×10-6 mol/L)无阻断作用。成纤维细胞数为1×105个/ml。
2.5FCGM对成纤维细胞c-fos 基因表达的影响
2.5.1FCGM作用的时间过程用第3天收集的FCGM分别作用于成纤维细胞0、15、30、60、120、240 min, 观察c-fos 基因表达的变化。结果显示, c-fos 基因于 FCGM 作用后15 min开始表达, 60 min达高峰, 240 min表达仍可见。
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2.5.2BQ123的作用用BQ123(1×10-6 mol/L)预处理培养心室成纤维细胞2 h后, 再加入FCGM作用1 h, c-fos 基因表达明显减弱, 但BQ123本身对c-fos 基因表达无明显的影响。
3讨论
本实验证明, FCGM能明显促进培养新生大鼠心室成纤维细胞[3H]-proline和[3H]-TdR掺入, 且具有剂量依赖性; FCGM也能诱导成纤维细胞的c-fos 基因表达, 表明心室成纤维细胞也具有自分泌作用, 能促进细胞自身胶原的合成和增殖。ETA受体阻断剂BQ123 能部分阻断FCGM促进成纤维细胞增殖和胶原合成的作用, 而血管紧张素Ⅱ的AT1受体阻断剂和α-肾上腺素受体阻断剂regitin却无明显的抑制作用, 进一步证实心室成纤维细胞分泌的活性物质有可能通过ETA受体起作用。
心脏重塑是一个复杂的过程, 包括心肌细胞的肥大、成纤维细胞增殖和细胞外基质的累积。心脏成纤维细胞在心脏重塑中起重要作用, 它参与三个重塑过程。一方面, 心脏成纤维细胞在未受到刺激时具有旁分泌功能, 能分泌肥大因子促进心肌细胞肥大[1，3]; 另一方面, 某些生长因子, 如血管紧张素Ⅱ和去甲肾上腺素, 对心肌细胞的肥大作用也是通过成纤维细胞介导的。心脏成纤维细胞除了具有旁分泌功能外, 也具有自分泌功能。Ashizawa 等报道, 大鼠心室成纤维细胞分泌成骨素(osteopontin), 介导血管紧张素Ⅱ促进成纤维细胞增殖和胶原收缩[6]。 而Ashizawa等则报道, 心脏成纤维细胞能分泌前列腺环素(prostacyclin)抑制其自身的胶原合成[7]; 缓激肽(bradykinin)对心脏成纤维细胞的胶原合成抑制作用也是通过成纤维细胞自身分泌prostacyclin介导的[8]。我们的实验结果显示, 新生大鼠心室成纤维细胞能分泌ET, 促进成纤维细胞的胶原合成和增殖。
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内皮素类(ET-1, ET-2, ET-3)除了具有强烈的血管收缩、促心肌细胞肥大作用外, 对成纤维细胞也具有丝裂原作用。ET-1既能增加皮肤成纤维细胞的胶原合成和增殖[9], 也能引起皮肤成纤维细胞基因表型改变[10]。ET-1和ET-3均能以剂量依赖性方式, 增加心脏成纤维细胞胶原合成, 且这种作用通过ETA受体和ETB受体中介。本实验观察到, FCGM促进心脏成纤维细胞胶原合成和增殖的可能是ET-1, 而且是通过ETA受体介导的。
c-fos 和c-jun是早期基因中参与基因转录的典型代表, 蛋白FOS和JUN相互作用形成二聚体复合物AP-1转录因子, 该转录因子参与细胞的增殖、分化和转化的调控。c-Fos和c-Jun蛋白可被佛波脂、血清、生长因子、细胞因子等刺激迅速诱导, 被称为细胞内信号转导的第三信使, 基因转录调控的分子开关。因此, FCGM能诱导心室成纤维细胞c-fos 基因的表达, 表明c-fos 基因有可能参与FCGM促进成纤维细胞增殖作用。
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参考文献
[1]Harada M, Itoh H, Nakagawa O et al. Significance of ventricular myocytes and nonmyocytes interaction during cardiocyte hypertrophy. Circulation, 1997, 96: 3737~3744.
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[3]Kuwahara K, Saito Y, Harada M et al. Involvement of cardiotrophin-1 in cardiac myocyte-nonmyocyte interactions during hypertrophy of rat cardiac myocytes in vitro. Circulation, 1999, 100: 1116~1124.
[4]Wang HX (王洪新), Tao L (陶 亮), Rao MR (饶曼人). Inhibitory effects of nifedipine and DNA protein synthesis in cultured cardiac nonmyocytes of neonatal rats. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1997, 18 (2): 136~139.
[5]Li ZB (李昭波), Gao YQ (高云秋), Tang CS (唐朝枢). Effect of exercise of expression of c-fos and ANF gene in spontaneously hypertensive rats. Chin Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1999, 15 (3): 242~245 (Chinese, English abstract).
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[6]Fort P, Marty L, Piechaczyk M et al. Various rat adult tissues express only one major mRNA species from the glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase multigenic family. Nucleic Acids Res, 1985, 13: 1431~1435.
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[8]Yu H, Gallagher AM, Garfin PM et al. Prostacyclin release by rat cardiac fibroblasts. Inhibition of collagen expression. Hypertension, 1997, 30: 1047~1053.
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