脑缺血/再灌对蒙古沙土鼠海马突触体酪氨酸磷酸化的影响
徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心； 徐州 221002 李勇；裴林；张光毅
关键词：脑缺血；氯胺酮；硝苯吡啶；6,7-二硝基喹恶啉上卫四；N-甲基-D-天冬氨酸受体；L-型电压门控钙通道；酪氨酸磷酸化；N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基
摘要：
用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉结扎(BCAO)前脑缺血模型, 研究缺血/再灌对海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响及NMDA受体(NR)非竞争性拮抗剂氯胺酮(ketamine, KT)、 L-型电压门控钙离子通道(L-type voltage gated calcium channel, L-型VGCC)拮抗剂硝苯吡啶(nifedipine, ND)及非NR拮抗剂6,7-二硝基喹恶啉上卫四(6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, DNQX)对其变化的影响。结果如下: (1) 缺血15 min导致蛋白酪氨酸磷酸化水平明显下降, 再灌引起包括180 kD蛋白在内的多种蛋白酪氨酸磷酸化水平快速(再灌15 min)而持续(至少48 h)升高; (2) 脑缺血15 min, 再灌6 h, 蛋白酪氨酸磷酸化达最高水平, 180 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平为假手术对照组的1.8倍; (3) 缺血前腹腔注射KT或ND, 对缺血/再灌诱导180 kD等蛋白酪氨酸磷酸化水平升高均有拮抗作用, 但DNQX无此作用; (4) 免疫沉淀和免疫印渍证明, 180 kD 蛋白为NR2B, 且其蛋白表达在脑缺血/再灌时没有变化。 结果提示, (1) 脑缺血/再灌诱导NR2B等蛋白酪氨酸磷酸化增加, 激活NR通道, 加重神经元损伤; (2) NR通道不仅可被酪氨酸磷酸化调节, 而且NR通道和L-型VGCC都参与了脑缺血/再灌对NR2B等蛋白酪氨酸磷酸化水平的调节, 两种通道拮抗剂可能对防治缺血性脑损伤有一定作用。
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脑缺血是一种发病率高, 危害严重的疾病, 缺血神经元损伤的机制日益受到人们的关注。脑缺血和缺血后再灌能引起一系列病理和生化的变化, 主要表现为脑能量耗竭, 兴奋性氨基酸(EAA)释放增加, 胞内Ca2+超载, 细胞膜功能受损, 毒性自由基产生, 细胞肿胀, 凋亡和坏死等。脑缺血引起胞内Ca2+超载, 主要涉及EAA受体通道和L-型电压门控钙离子通道(VGCC)。其中缺血时EAA 释放增加, 在脑缺血神经元损伤中起极重要的作用。按药理学特征, 亲离子型EAA 受体有两种类型: NMDA受体(NR)和非NR[1], 由于NR是配体门控性Ca2+ 通道, 对Ca2+ 有较强的通透性, 因此, NR家族在脑缺血损伤中的作用日益受到重视。分子克隆表明, NR由NR1和NR2 (2A-2D)组成[1], 正常情况下, NR由NR1和至少一种类型NR2亚基组成。NR1是该受体通道的功能部分, 而NR2具有调节受体通道动力学作用。研究表明, 通过酪氨酸磷酸化可调节NR, 电生理实验发现, 酪氨酸蛋白激酶(PTK)可增强NMDA诱导的电流[2～5], 酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)作用正好相反[5], 这种调节作用可能和NR通道本身的酪氨酸磷酸化有关[5]。但这种变化是否与NR通道和L-型VGCC两类Ca2+ 通道的过度激活而导致的Ca2+ 超载有关, 尚不清楚。我们用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉结扎(BCAO)前脑缺血模型, 研究沙土鼠脑缺血和再灌突触体蛋白酪氨酸磷酸化水平变化, 以及NR非竞争性拮抗剂KT、 L-型VGCC拮抗剂ND和非NR拮抗剂DNQX对其变化的影响。
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1 材料和方法
1.1 动物 成年健康蒙古沙土鼠, 体重60～80 g, 由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA), DNQX, Tween-20, 氯胺酮, 硝苯砒啶, Leupeptin, Pestatin A, 均为Sigma公司产品, 丙稀酰胺、 亚甲基双丙烯酰胺(E.Merck公司产品), Triton X-100 (Rohm-Haas公司产品), 其余试剂均为国产分析纯。抗体: 磷酸酪氨酸单抗(PY20, Pharmigen), NR2B单抗, 羊抗鼠(兔)IgG-AP (Sigma)。
1.3 蒙古沙土鼠脑缺血模型 动物随机分为假手术对照组、 缺血/再灌组及给药组。缺血/再灌组腹腔注射水合氯醛(300～350 mg/kg 体重)麻醉后, 其余操作按我室的方法[6], 实验动物缺血成功与否以结扎后脑电波(EEG)是否消失作为主要指标。假手术对照组的麻醉及手术操作同上, 但不造成缺血; 给药组缺血前20 min腹腔注射80～100 μl体积药物, 假手术对照组及缺血组给予相同体积的溶剂。缺血前控制动物体温在37～37.5℃, 缺血15 min后, 按实验要求再灌不同时间。 断头, 液氮速冻固定10 s, 60 s内取出双侧海马置于液氮中冻存。
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1.4 样品的制备 参考Hu等人的方法[7], 略有改动。以下操作均在4℃下进行。液氮冻存的海马, 按1∶10 (mg/μl)加入匀浆液A (mmol/L: 50 MOPS, pH 7.4, 0.2 DTT, 100 KCI, 0.5 MgCl2, 1 Na3VO4, 0.1 EDTA, 1 EGTA, 0.5 ouabain, 以及50 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml pepstatin A和0.32 mol/L sucrose), Teflon 匀浆器高速匀浆30 s×3, 离心800 g 10 min, 上清再以9200 g 离心15 min, 沉淀加入含0.1% Triton X-100匀浆液, 超声破碎10 s×3次, 作为突触体样品液氮速冻后, 置于-80℃冰箱待用。
1.5 免疫印渍测定磷酸酪氨酸蛋白[8] 等量的样品蛋白(50 μg/lane)经7.5% SDS-PAGE分离后, 以湿转法电转至NC膜上(Amershan), 条件为1 A电流90 min。转移缓冲液: 25 mmol/L Tris, 190 mmol/L 甘氨酸, 20%甲醇, 0.05% SDS。转移完毕后, 加入封闭液: 1% BSA的buffer A (10 mmol/L Tris pH 7.5, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20), 室温封闭3 h, 加入用封闭液稀释的一抗(磷酸酪氨酸单抗或NR2B单抗)4℃过夜, buffer A洗膜, 加羊抗鼠IgG-AP (1∶1000 buffer A稀释, Sigma), 37℃保温2 h于室温30 min后, buffer A 洗膜加入显色剂(NBT/NCIP 显色试剂盒, 华美公司), 反应达到要求后, 流水洗涤终止反应。所得NC膜可直接用图像处理仪处理。
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1.6 免疫沉淀[9] 免疫沉淀条件: 样品蛋白200 μg, 加入SDS和二硫代苏糖醇(DTT)至终浓度分别为0.5% 和 1 mmol/L, 煮沸5 min后, 用buffer B (20 mmol/L Mops pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% Nonidet P-40, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 0.2 mmol/L sodium orthovanadate, 0.2 mmol/L PMSF) 稀释4倍。加入磷酸酪氨酸单抗2.5 μg基其他抗体, 4℃, 轻轻摇动4 h, 加入Protein A-Sepharose继续摇动4 h, 离心, 沉淀再用buffer B洗涤3次, 沉淀加2.5倍浓度的上样缓冲液(0.15 mol/L Tris-HCl pH6.8, 12.5% β-mercaptoethanol, 6% SDS, 12.5 mmol/L EDTA, 10% glycerol, 0.05% bromphenol blue)煮沸10 min, 离心取上清, 电泳7.5% SDS-PAGE, 其余操作方法同方法1.5。
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1.7 数据处理 数据以 ±s表示, 成组设计的两组间均数比较采用t检验, 多组均数与同一均数的比较采用方差分析, P<0.05和P<0.01分别表示两组数据间有显著性差异和有非常显著性差异。
2 结果
2.1 脑缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的变化
沙土鼠前脑缺血15 min后再灌不同时间, 以抗磷酸酪氨酸单抗做免疫印渍。缺血15 min后, 免疫印渍蛋白条带比假手术对照组明显减少、 减弱; 随着再灌时间的增加, 包括分子量为180, 120, 95, 60和42 kD等多种蛋白条带逐渐增加。再灌15 min, 上述各条带就已出现, 且也超过假手术对照组; 再灌6 h达到最大, 以后略有下降。特别是分子量为180 kD的蛋白条带变化更为明显, 再灌6 h, 约为假手术对照组的1.8倍。
2.2 KT对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响
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脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予KT 12.5、 25、 50 mg/kg体重3种剂量。缺血15 min, 再灌6 h, 提取海马突触体, 以抗磷酸酪氨酸单抗做免疫印迹。 缺血15 min, 再灌6 h后, 上述各种蛋白酪氨酸磷酸化均显著增加。条带用图像处理仪处理后, 180 kD蛋白为假手术对照的182%(P<0.01)。各给药组蛋白酪氨酸磷酸化均有降低, 其中磷酸化的180 kD分别下降为假手术对照组的120%, 117%和111%, 与假手术对照组相比, 皆有显著性差异(P<0.05); 与缺血/再灌6 h组相比, 也有显著性差异(P<0.05); 但各给药组之间无显著性差异(P>0.05)。
2.3 ND对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响
脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予ND 10, 15, 20 mg/kg体重3种剂量。缺血15 min, 再灌6 h, 各种蛋白酪氨酸磷酸化与上述结果相同, 其中180 kD为假手术对照组的183%(P<0.01)。给药各组各种蛋白酪氨酸磷酸化均有下降, 其中180 kD蛋白酪氨酸磷酸化分别下降为假手术对照组的126%, 121%, 115%, 3组与假手术对照相比, 皆有显著性差异(P<0.05); 与缺血/再灌6 h组相比, 也有显著性差异(P<0.05); 但各给药组之间无显著性差异(P>0.05)。
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2.4 DNQX对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响
脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予DNQX10, 20, 30 mg/kg体重3种剂量, 所得结果见图4, 由图4可见, 3组剂量的DNQX对蛋白酪氨酸磷酸化无显著性影响。其中酪氨酸磷酸化的180 kD蛋白分别为假手术对照组的182%, 181%和180%, 3组与假手术对照组相比, 皆有显著性差异(P<0.05); 与缺血/再灌组相比, 无显著性差异(P>0.05)。
2.5 免疫沉淀和免疫印渍鉴定NMDA受体亚基
本研究主要关注的是上述180 kD是否为NMDA受体亚基NR2B。因此, 我们采用抗磷酸酪氨酸单抗免疫沉淀缺血/再灌海马突触体蛋白, 电泳后转膜, 再用抗NR2B抗体检测, 发现一条180 kD的磷酸酪氨酸蛋白条带(图5)。图6表示缺血/再灌后NR2B蛋白表达水平与假手术对照组相比无显著性差异(P>0.05)。
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3 讨论
实验表明, 沙土鼠前脑缺血/再灌可诱导海马突触体包括180 kD等多种蛋白酪氨酸磷酸化的增加; 这种增加可被NR拮抗剂KT和L-型VGCC拮抗剂ND所拮抗, 而非NR拮抗剂DNQX则无此作用, 提示脑缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的增加与NR通道和L-型VGCC有关, 而与非NR通道无关; 经免疫沉淀和免疫印渍鉴定, 180 kD蛋白含NR2B, 而且, 脑缺血/再灌引起其酪氨酸磷酸化增加最为显著, 大约为假手术对照组的1.8倍。
配基门控离子通道可逆磷酸化调节乃是当今分子生物学研究热点之一。关于NR可逆磷酸化调节主要来自分子克隆的预测, 在电生理学和离体生化学等方面的研究均有报道。早在1990年, Kemp等[10]根据NR cDNA克隆, 就预测其亚基有潜在的酪氨酸磷酸化位点。Wang等[4]用背角神经元灌注PTK或PTP抑制剂能增强NR的功能, 引起NR通道开放概率增加, 而PTK抑制剂则减弱其功能。但是, 他们并不知道PTK是否直接通过NR磷酸化介导的。Moon等[11]人从大鼠前脑PSD中纯化分子量为180 kD的糖蛋白, 经测序和抗NR2B抗体免疫印渍证明它就是NR2B; 经抗酪氨酸磷酸化抗体免疫印渍鉴定, NR2B可被PTK磷酸化。1996年, 有两个实验室同时报道[12,13], 海马CA1和DG产生LTP时表现NR2B酪氨酸磷酸化升高, 证明NR2B酪氨酸磷酸化对于LTP的诱导有其重要作用。本研究进一步证明, 海马在缺血/再灌后, NR2B酪氨酸不仅可被磷酸化, 而且相对于其假手术对照组明显升高(当然这种增加不是NR2B蛋白量的增加引起的)。根据上述电生理实验结果表明, NR在脑缺血/再灌其酪氨酸磷酸化增加, 无疑将导致NR活性的上调, 引起胞外Ca2+大量持续内流, 其最终结果是加重神经元损伤。这就说明NR2B酪氨酸磷酸化不仅具有重要的生理意义, 而且在缺血性脑损伤中具有重要的病理意义。
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目前, 关于缺血性脑损伤的机制主要有三种假说, 即兴奋毒假说、 钙相关假说和自由基假说[14], 它们之间是相互联系的。脑缺血时, 首先是ATP耗竭, 膜去极化, L-型VGCC活化, Ca2+内流, 促使谷氨酸大量释放。 后者结合突触后膜受体引起NR过度激活, 导致胞内Ca2+超载, 激活包括磷脂酶在内的Ca2+靶酶, 膜磷脂水解, 经代谢产生自由基, 进一步使质膜和生物大分子破坏。在上述过程中, Ca2+内流是关键, 而引起Ca2+内流的关键又是L-型VGCC和NR通道。因此, 我们在发现脑缺血/再灌诱导NR2B酪氨酸磷酸化增加后, 继而进一步研究这种变化与两种Ca2+通道之间的关系。 如上所述, 不但NR拮抗剂KT能够拮抗脑缺血/再灌诱导NR2B酪氨酸磷酸化的增加, 而且L-型VGCC拮抗剂ND也能够拮抗这一增加。结果表明, 在这种病理条件下, NR2B酪氨酸磷酸化增加是与这两种通道激活有关, 即与脑缺血/再灌激活NR通道和L-型VGCC引起Ca2+内流有关。一方面, Ca2+通过NR通道内流激活PTK, 磷酸化NR2B, 增强NR通道活性, 进一步增强Ca2+内流, 这是一种自身正反馈调节(positive feedback autoregulation); 另一方面, 脑缺血神经元去极化导致Ca2+通过L-型VGCC内流, 激活PTK, 磷酸化NR2B, 同样进一步加强Ca2+通过NR通道内流, 这是L-型VGCC对NR的磷酸化调节, 是两种通道之间的相互作用(cross-talk)。KT和ND均可通过抑制NR2B酪氨酸磷酸化而抑制NR通道活性, 从而防止Ca2+内流增加, 因此, 这两种药物在防治缺血性脑损伤可能有一定作用。另外, 进一步研究脑缺血/再灌海马神经元内哪种PTK被激活及如何被激活是非常必要的。当然, PTK使NR2B酪氨酸磷酸化, 而PTP则催化其去磷酸化, 这两种酶共同调节NR2B的磷酸化状态, 称为共调(coregulation)。在脑缺血/再灌时, PTP活性又如何？ 有必要去进一步探索。
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Supported by National Natural Science Foundation of China (No.39770177)
Corresponding author. Tel: 0516-5748423, E-mail: gyzhang@xzmc.edu.cn
李勇(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心, 徐州 221002)
裴林(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心, 徐州 221002)
张光毅(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心, 徐州 221002)
参考文献
[1] Hollnann M, Heinemann S. Cloned glutamate receptor. Ann Rev Neurosci, 1994, 17: 31～108.
, http://www.100md.com
[2] Chen C, Leonard JP. Protein tyrosine kinase-mediated potentiation of currents from cloned NMDA receptors. J Neurochem, 1996, 67: 194～200.
[3] Kohr G, Seeburg PH. Subtype-specific regulation of recombinant NMDA receptor-channels by protein tyrosine kinases of the src family. J physiol, 1996, 492: 445～452.
[4] Wang YT, Salter MW. Regulation of NMDA receptors by protein-tyrosine kinases and phosphatases. Nature, 1994, 369: 233～235.
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[5] Wang YT, Yu XM, Salter MW. Ca2+-independent reduction of NMDA receptor-mediated currents by protein tyrosine phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 1721～1725.
[6] Liu J (刘 健), Zhang GY (张光毅). Studies on the difference in sensitivity to cerebral ischemia and reperfusion between cytosolic and particulate Ca2+/CaM PKⅡ activities. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1995, 11: 322～325 (in Chinese with English abstract).
, http://www.100md.com [7] Hu BR, Wieloch T. Tyrosine phosphorylation and activation of mitogen-activated protein kinase in the rat brain following transient cerebral ischemia. J Neurochem, 1994, 62: 1357～1367.
[8] 范培昌. 生物大分子印渍技术和应用. 上海: 上海科学技术文献出版社, 1989, 191～201.
[9] Yu XM, Rand AK, Salter MW. NMDA channel regulation by channel-associated protein tyrosine kinase src. Science, 1997, 275: 674～678.
[10] Kemp BE, Pearson RB. Protein kinase recognition sequence motifs. Trends Biochem Sci, 1990, 15: 342～346.
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[11] Moon IS, Apperson ML, Kennedy MB. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 3954～3958.
[12] Rostas JAP, Brent VA, Voss K et al. Enhanced tyrosine phosphorylation of the 2B subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor Proc. Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 10452～10456.
[13] Rosenblum K, Dudai Y, Levin GR. Long-term potentiation increases tyrosine phosphorylation of the N-methyl-O-aspartate receptor subunit 2B in rat dentate gyrus in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 96: 10457～10460.
[14] Yamasaki Y, Kogure K, The involvement of free radical formation and lipid peroxidation on the post-ischemic neuronal damage. In: Krieglatein J, oberpichler H, eds. Pharmacolagy of Cerebral Schemic, issenschaftliche Verlagsgenellschaft mbh stuttgart, 1990, 325～333.
Received 1999-07-25 Revised 1999-09-20, 百拇医药
关键词：脑缺血；氯胺酮；硝苯吡啶；6,7-二硝基喹恶啉上卫四；N-甲基-D-天冬氨酸受体；L-型电压门控钙通道；酪氨酸磷酸化；N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基
摘要：
用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉结扎(BCAO)前脑缺血模型, 研究缺血/再灌对海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响及NMDA受体(NR)非竞争性拮抗剂氯胺酮(ketamine, KT)、 L-型电压门控钙离子通道(L-type voltage gated calcium channel, L-型VGCC)拮抗剂硝苯吡啶(nifedipine, ND)及非NR拮抗剂6,7-二硝基喹恶啉上卫四(6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, DNQX)对其变化的影响。结果如下: (1) 缺血15 min导致蛋白酪氨酸磷酸化水平明显下降, 再灌引起包括180 kD蛋白在内的多种蛋白酪氨酸磷酸化水平快速(再灌15 min)而持续(至少48 h)升高; (2) 脑缺血15 min, 再灌6 h, 蛋白酪氨酸磷酸化达最高水平, 180 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平为假手术对照组的1.8倍; (3) 缺血前腹腔注射KT或ND, 对缺血/再灌诱导180 kD等蛋白酪氨酸磷酸化水平升高均有拮抗作用, 但DNQX无此作用; (4) 免疫沉淀和免疫印渍证明, 180 kD 蛋白为NR2B, 且其蛋白表达在脑缺血/再灌时没有变化。 结果提示, (1) 脑缺血/再灌诱导NR2B等蛋白酪氨酸磷酸化增加, 激活NR通道, 加重神经元损伤; (2) NR通道不仅可被酪氨酸磷酸化调节, 而且NR通道和L-型VGCC都参与了脑缺血/再灌对NR2B等蛋白酪氨酸磷酸化水平的调节, 两种通道拮抗剂可能对防治缺血性脑损伤有一定作用。
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脑缺血是一种发病率高, 危害严重的疾病, 缺血神经元损伤的机制日益受到人们的关注。脑缺血和缺血后再灌能引起一系列病理和生化的变化, 主要表现为脑能量耗竭, 兴奋性氨基酸(EAA)释放增加, 胞内Ca2+超载, 细胞膜功能受损, 毒性自由基产生, 细胞肿胀, 凋亡和坏死等。脑缺血引起胞内Ca2+超载, 主要涉及EAA受体通道和L-型电压门控钙离子通道(VGCC)。其中缺血时EAA 释放增加, 在脑缺血神经元损伤中起极重要的作用。按药理学特征, 亲离子型EAA 受体有两种类型: NMDA受体(NR)和非NR[1], 由于NR是配体门控性Ca2+ 通道, 对Ca2+ 有较强的通透性, 因此, NR家族在脑缺血损伤中的作用日益受到重视。分子克隆表明, NR由NR1和NR2 (2A-2D)组成[1], 正常情况下, NR由NR1和至少一种类型NR2亚基组成。NR1是该受体通道的功能部分, 而NR2具有调节受体通道动力学作用。研究表明, 通过酪氨酸磷酸化可调节NR, 电生理实验发现, 酪氨酸蛋白激酶(PTK)可增强NMDA诱导的电流[2～5], 酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)作用正好相反[5], 这种调节作用可能和NR通道本身的酪氨酸磷酸化有关[5]。但这种变化是否与NR通道和L-型VGCC两类Ca2+ 通道的过度激活而导致的Ca2+ 超载有关, 尚不清楚。我们用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉结扎(BCAO)前脑缺血模型, 研究沙土鼠脑缺血和再灌突触体蛋白酪氨酸磷酸化水平变化, 以及NR非竞争性拮抗剂KT、 L-型VGCC拮抗剂ND和非NR拮抗剂DNQX对其变化的影响。
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1 材料和方法
1.1 动物 成年健康蒙古沙土鼠, 体重60～80 g, 由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA), DNQX, Tween-20, 氯胺酮, 硝苯砒啶, Leupeptin, Pestatin A, 均为Sigma公司产品, 丙稀酰胺、 亚甲基双丙烯酰胺(E.Merck公司产品), Triton X-100 (Rohm-Haas公司产品), 其余试剂均为国产分析纯。抗体: 磷酸酪氨酸单抗(PY20, Pharmigen), NR2B单抗, 羊抗鼠(兔)IgG-AP (Sigma)。
1.3 蒙古沙土鼠脑缺血模型 动物随机分为假手术对照组、 缺血/再灌组及给药组。缺血/再灌组腹腔注射水合氯醛(300～350 mg/kg 体重)麻醉后, 其余操作按我室的方法[6], 实验动物缺血成功与否以结扎后脑电波(EEG)是否消失作为主要指标。假手术对照组的麻醉及手术操作同上, 但不造成缺血; 给药组缺血前20 min腹腔注射80～100 μl体积药物, 假手术对照组及缺血组给予相同体积的溶剂。缺血前控制动物体温在37～37.5℃, 缺血15 min后, 按实验要求再灌不同时间。 断头, 液氮速冻固定10 s, 60 s内取出双侧海马置于液氮中冻存。
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1.4 样品的制备 参考Hu等人的方法[7], 略有改动。以下操作均在4℃下进行。液氮冻存的海马, 按1∶10 (mg/μl)加入匀浆液A (mmol/L: 50 MOPS, pH 7.4, 0.2 DTT, 100 KCI, 0.5 MgCl2, 1 Na3VO4, 0.1 EDTA, 1 EGTA, 0.5 ouabain, 以及50 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml pepstatin A和0.32 mol/L sucrose), Teflon 匀浆器高速匀浆30 s×3, 离心800 g 10 min, 上清再以9200 g 离心15 min, 沉淀加入含0.1% Triton X-100匀浆液, 超声破碎10 s×3次, 作为突触体样品液氮速冻后, 置于-80℃冰箱待用。
1.5 免疫印渍测定磷酸酪氨酸蛋白[8] 等量的样品蛋白(50 μg/lane)经7.5% SDS-PAGE分离后, 以湿转法电转至NC膜上(Amershan), 条件为1 A电流90 min。转移缓冲液: 25 mmol/L Tris, 190 mmol/L 甘氨酸, 20%甲醇, 0.05% SDS。转移完毕后, 加入封闭液: 1% BSA的buffer A (10 mmol/L Tris pH 7.5, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20), 室温封闭3 h, 加入用封闭液稀释的一抗(磷酸酪氨酸单抗或NR2B单抗)4℃过夜, buffer A洗膜, 加羊抗鼠IgG-AP (1∶1000 buffer A稀释, Sigma), 37℃保温2 h于室温30 min后, buffer A 洗膜加入显色剂(NBT/NCIP 显色试剂盒, 华美公司), 反应达到要求后, 流水洗涤终止反应。所得NC膜可直接用图像处理仪处理。
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1.6 免疫沉淀[9] 免疫沉淀条件: 样品蛋白200 μg, 加入SDS和二硫代苏糖醇(DTT)至终浓度分别为0.5% 和 1 mmol/L, 煮沸5 min后, 用buffer B (20 mmol/L Mops pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% Nonidet P-40, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 0.2 mmol/L sodium orthovanadate, 0.2 mmol/L PMSF) 稀释4倍。加入磷酸酪氨酸单抗2.5 μg基其他抗体, 4℃, 轻轻摇动4 h, 加入Protein A-Sepharose继续摇动4 h, 离心, 沉淀再用buffer B洗涤3次, 沉淀加2.5倍浓度的上样缓冲液(0.15 mol/L Tris-HCl pH6.8, 12.5% β-mercaptoethanol, 6% SDS, 12.5 mmol/L EDTA, 10% glycerol, 0.05% bromphenol blue)煮沸10 min, 离心取上清, 电泳7.5% SDS-PAGE, 其余操作方法同方法1.5。
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1.7 数据处理 数据以 ±s表示, 成组设计的两组间均数比较采用t检验, 多组均数与同一均数的比较采用方差分析, P<0.05和P<0.01分别表示两组数据间有显著性差异和有非常显著性差异。
2 结果
2.1 脑缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的变化
沙土鼠前脑缺血15 min后再灌不同时间, 以抗磷酸酪氨酸单抗做免疫印渍。缺血15 min后, 免疫印渍蛋白条带比假手术对照组明显减少、 减弱; 随着再灌时间的增加, 包括分子量为180, 120, 95, 60和42 kD等多种蛋白条带逐渐增加。再灌15 min, 上述各条带就已出现, 且也超过假手术对照组; 再灌6 h达到最大, 以后略有下降。特别是分子量为180 kD的蛋白条带变化更为明显, 再灌6 h, 约为假手术对照组的1.8倍。
2.2 KT对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响
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脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予KT 12.5、 25、 50 mg/kg体重3种剂量。缺血15 min, 再灌6 h, 提取海马突触体, 以抗磷酸酪氨酸单抗做免疫印迹。 缺血15 min, 再灌6 h后, 上述各种蛋白酪氨酸磷酸化均显著增加。条带用图像处理仪处理后, 180 kD蛋白为假手术对照的182%(P<0.01)。各给药组蛋白酪氨酸磷酸化均有降低, 其中磷酸化的180 kD分别下降为假手术对照组的120%, 117%和111%, 与假手术对照组相比, 皆有显著性差异(P<0.05); 与缺血/再灌6 h组相比, 也有显著性差异(P<0.05); 但各给药组之间无显著性差异(P>0.05)。
2.3 ND对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响
脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予ND 10, 15, 20 mg/kg体重3种剂量。缺血15 min, 再灌6 h, 各种蛋白酪氨酸磷酸化与上述结果相同, 其中180 kD为假手术对照组的183%(P<0.01)。给药各组各种蛋白酪氨酸磷酸化均有下降, 其中180 kD蛋白酪氨酸磷酸化分别下降为假手术对照组的126%, 121%, 115%, 3组与假手术对照相比, 皆有显著性差异(P<0.05); 与缺血/再灌6 h组相比, 也有显著性差异(P<0.05); 但各给药组之间无显著性差异(P>0.05)。
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2.4 DNQX对缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的影响
脑缺血前20 min, 腹腔注射分别给予DNQX10, 20, 30 mg/kg体重3种剂量, 所得结果见图4, 由图4可见, 3组剂量的DNQX对蛋白酪氨酸磷酸化无显著性影响。其中酪氨酸磷酸化的180 kD蛋白分别为假手术对照组的182%, 181%和180%, 3组与假手术对照组相比, 皆有显著性差异(P<0.05); 与缺血/再灌组相比, 无显著性差异(P>0.05)。
2.5 免疫沉淀和免疫印渍鉴定NMDA受体亚基
本研究主要关注的是上述180 kD是否为NMDA受体亚基NR2B。因此, 我们采用抗磷酸酪氨酸单抗免疫沉淀缺血/再灌海马突触体蛋白, 电泳后转膜, 再用抗NR2B抗体检测, 发现一条180 kD的磷酸酪氨酸蛋白条带(图5)。图6表示缺血/再灌后NR2B蛋白表达水平与假手术对照组相比无显著性差异(P>0.05)。
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3 讨论
实验表明, 沙土鼠前脑缺血/再灌可诱导海马突触体包括180 kD等多种蛋白酪氨酸磷酸化的增加; 这种增加可被NR拮抗剂KT和L-型VGCC拮抗剂ND所拮抗, 而非NR拮抗剂DNQX则无此作用, 提示脑缺血/再灌海马突触体蛋白酪氨酸磷酸化的增加与NR通道和L-型VGCC有关, 而与非NR通道无关; 经免疫沉淀和免疫印渍鉴定, 180 kD蛋白含NR2B, 而且, 脑缺血/再灌引起其酪氨酸磷酸化增加最为显著, 大约为假手术对照组的1.8倍。
配基门控离子通道可逆磷酸化调节乃是当今分子生物学研究热点之一。关于NR可逆磷酸化调节主要来自分子克隆的预测, 在电生理学和离体生化学等方面的研究均有报道。早在1990年, Kemp等[10]根据NR cDNA克隆, 就预测其亚基有潜在的酪氨酸磷酸化位点。Wang等[4]用背角神经元灌注PTK或PTP抑制剂能增强NR的功能, 引起NR通道开放概率增加, 而PTK抑制剂则减弱其功能。但是, 他们并不知道PTK是否直接通过NR磷酸化介导的。Moon等[11]人从大鼠前脑PSD中纯化分子量为180 kD的糖蛋白, 经测序和抗NR2B抗体免疫印渍证明它就是NR2B; 经抗酪氨酸磷酸化抗体免疫印渍鉴定, NR2B可被PTK磷酸化。1996年, 有两个实验室同时报道[12,13], 海马CA1和DG产生LTP时表现NR2B酪氨酸磷酸化升高, 证明NR2B酪氨酸磷酸化对于LTP的诱导有其重要作用。本研究进一步证明, 海马在缺血/再灌后, NR2B酪氨酸不仅可被磷酸化, 而且相对于其假手术对照组明显升高(当然这种增加不是NR2B蛋白量的增加引起的)。根据上述电生理实验结果表明, NR在脑缺血/再灌其酪氨酸磷酸化增加, 无疑将导致NR活性的上调, 引起胞外Ca2+大量持续内流, 其最终结果是加重神经元损伤。这就说明NR2B酪氨酸磷酸化不仅具有重要的生理意义, 而且在缺血性脑损伤中具有重要的病理意义。
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目前, 关于缺血性脑损伤的机制主要有三种假说, 即兴奋毒假说、 钙相关假说和自由基假说[14], 它们之间是相互联系的。脑缺血时, 首先是ATP耗竭, 膜去极化, L-型VGCC活化, Ca2+内流, 促使谷氨酸大量释放。 后者结合突触后膜受体引起NR过度激活, 导致胞内Ca2+超载, 激活包括磷脂酶在内的Ca2+靶酶, 膜磷脂水解, 经代谢产生自由基, 进一步使质膜和生物大分子破坏。在上述过程中, Ca2+内流是关键, 而引起Ca2+内流的关键又是L-型VGCC和NR通道。因此, 我们在发现脑缺血/再灌诱导NR2B酪氨酸磷酸化增加后, 继而进一步研究这种变化与两种Ca2+通道之间的关系。 如上所述, 不但NR拮抗剂KT能够拮抗脑缺血/再灌诱导NR2B酪氨酸磷酸化的增加, 而且L-型VGCC拮抗剂ND也能够拮抗这一增加。结果表明, 在这种病理条件下, NR2B酪氨酸磷酸化增加是与这两种通道激活有关, 即与脑缺血/再灌激活NR通道和L-型VGCC引起Ca2+内流有关。一方面, Ca2+通过NR通道内流激活PTK, 磷酸化NR2B, 增强NR通道活性, 进一步增强Ca2+内流, 这是一种自身正反馈调节(positive feedback autoregulation); 另一方面, 脑缺血神经元去极化导致Ca2+通过L-型VGCC内流, 激活PTK, 磷酸化NR2B, 同样进一步加强Ca2+通过NR通道内流, 这是L-型VGCC对NR的磷酸化调节, 是两种通道之间的相互作用(cross-talk)。KT和ND均可通过抑制NR2B酪氨酸磷酸化而抑制NR通道活性, 从而防止Ca2+内流增加, 因此, 这两种药物在防治缺血性脑损伤可能有一定作用。另外, 进一步研究脑缺血/再灌海马神经元内哪种PTK被激活及如何被激活是非常必要的。当然, PTK使NR2B酪氨酸磷酸化, 而PTP则催化其去磷酸化, 这两种酶共同调节NR2B的磷酸化状态, 称为共调(coregulation)。在脑缺血/再灌时, PTP活性又如何？ 有必要去进一步探索。
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Corresponding author. Tel: 0516-5748423, E-mail: gyzhang@xzmc.edu.cn
李勇(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心, 徐州 221002)
裴林(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心, 徐州 221002)
张光毅(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心, 徐州 221002)
参考文献
[1] Hollnann M, Heinemann S. Cloned glutamate receptor. Ann Rev Neurosci, 1994, 17: 31～108.
, http://www.100md.com
[2] Chen C, Leonard JP. Protein tyrosine kinase-mediated potentiation of currents from cloned NMDA receptors. J Neurochem, 1996, 67: 194～200.
[3] Kohr G, Seeburg PH. Subtype-specific regulation of recombinant NMDA receptor-channels by protein tyrosine kinases of the src family. J physiol, 1996, 492: 445～452.
[4] Wang YT, Salter MW. Regulation of NMDA receptors by protein-tyrosine kinases and phosphatases. Nature, 1994, 369: 233～235.
, 百拇医药
[5] Wang YT, Yu XM, Salter MW. Ca2+-independent reduction of NMDA receptor-mediated currents by protein tyrosine phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 1721～1725.
[6] Liu J (刘 健), Zhang GY (张光毅). Studies on the difference in sensitivity to cerebral ischemia and reperfusion between cytosolic and particulate Ca2+/CaM PKⅡ activities. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1995, 11: 322～325 (in Chinese with English abstract).
, http://www.100md.com [7] Hu BR, Wieloch T. Tyrosine phosphorylation and activation of mitogen-activated protein kinase in the rat brain following transient cerebral ischemia. J Neurochem, 1994, 62: 1357～1367.
[8] 范培昌. 生物大分子印渍技术和应用. 上海: 上海科学技术文献出版社, 1989, 191～201.
[9] Yu XM, Rand AK, Salter MW. NMDA channel regulation by channel-associated protein tyrosine kinase src. Science, 1997, 275: 674～678.
[10] Kemp BE, Pearson RB. Protein kinase recognition sequence motifs. Trends Biochem Sci, 1990, 15: 342～346.
, 百拇医药
[11] Moon IS, Apperson ML, Kennedy MB. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 3954～3958.
[12] Rostas JAP, Brent VA, Voss K et al. Enhanced tyrosine phosphorylation of the 2B subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor Proc. Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 10452～10456.
[13] Rosenblum K, Dudai Y, Levin GR. Long-term potentiation increases tyrosine phosphorylation of the N-methyl-O-aspartate receptor subunit 2B in rat dentate gyrus in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 96: 10457～10460.
[14] Yamasaki Y, Kogure K, The involvement of free radical formation and lipid peroxidation on the post-ischemic neuronal damage. In: Krieglatein J, oberpichler H, eds. Pharmacolagy of Cerebral Schemic, issenschaftliche Verlagsgenellschaft mbh stuttgart, 1990, 325～333.
Received 1999-07-25 Revised 1999-09-20, 百拇医药