GABA影响大鼠卵巢黄体细胞孕酮的生成
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哈尔滨医科大学生殖内分泌研究室； 哈尔滨 150086 张辉；倪江；张玮；田淑君
关键词：γ-氨基丁酸；黄体细胞；孕酮；羟自由基
摘要：实验用离体培养方法观察GABA对大鼠黄体细胞孕酮及羟自由基(OH)生成的影响。结果表明: GABA抑制黄体细胞孕酮的生成, 同时也促进黄体细胞OH的生成。GABA对孕酮的抑制作用可能与腺苷酸环化酶系统及GABAA型受体有关, 而与蛋白质合成无关。
γ-氨基丁酸(GABA)是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(GAD)作用下脱羧而成。近年来, 人们对中枢抑制性神经递质GABA进行了广泛深入的研究, 发现30多种外周组织中有GABA存在, 特别以卵巢和输卵管中含量最高, 可达脑内含量的2倍以上[1], 提示GABA可能对性腺系统有某种生理作用。进一步的研究发现, 卵巢中有GABA能神经元支配, 但对其生理作用的研究较少。自由基在生物体系中的作用已成为一个非常活跃的研究领域, 它的产生与许多生理、 病理过程有关[2]。自由基有许多种, 在氧自由基中, 氧化活性最强、 危害最大的是羟自由基(OH)。它一旦形成, 就在它所在的微环境中与邻近的有机物反应, 从而损害细胞的结构和功能, 曾观察到OH与衰老、 肿瘤、 辐射损伤和细胞吞噬有关[3]。因而氧自由基特别是OH与黄体细胞孕酮分泌有无关系, GABA对其有否影响均值得研究。本工作采用离体培养大鼠黄体细胞方法, 研究了GABA对孕酮及OH生成的影响。
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1 材料和方法
1.1 实验仪器 Beckman 9800液体闪烁计数仪; CO2培养箱(美国Shel-Lab公司); 日本岛津LC-6A型高效液相色谱仪; SPD-6AV紫外检测器。色谱条件: 色谱柱, Licrosorb C18 (Φ: 7 μm, 2.2×250 mm)。流速: 0.5 ml/min, AVFs: 0.02, 检测波长: 315 nm。流动相: 80% 0.03 mol/L柠檬酸, 0.03 mol/L醋酸; 20%甲醇, pH 3.5。 试剂均为美国Sigma产品。
1.2 黄体细胞培养 按Wang XN[4]报道的方法进行黄体细胞体外培养。将体重60～70 g的未成年雌性Wistar大鼠, 于PMSG-hCG顺序处理的第7天断头, 迅速取出双侧卵巢, 置于冰冷的无Ca2+、 Mg2+的KRBG液[(mmol/L): NaCl 119, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, NaHCO3 24.9, 葡萄糖11]中冲洗。去除卵巢脂肪及被膜组织, 用剪刀将其剪碎, 然后置于0.2%胶原酶Ⅱ-0.1%DNA酶Ⅰ混合液中。消化1 h后, 经尼龙网(孔径200 μm)过滤。加入3倍体积KRBG稀释滤液, 离心(1?200 r/min) 10 min。弃上清液后, 加氯化铵去除红细胞, 加入EDTA溶液, 于37℃下振荡孵育10 min。接着加入3倍体积无Ca2+、 Mg2+ KRBG液, 混匀后离心(1?200 r/min) 5 min。弃上清, 加入适量新鲜KRBGAL溶液, 用白细胞计数法直接计数黄体细胞, 分装于培养管中, 每管1 ml, 移入CO2孵箱中培养。1 h后, GABA用培养液溶解, 配制母液, 加到各培养管中, 使其终浓度达到设计浓度。继续培养 2 h, 将培养管取出用RIA法测P含量, 再用HPLC测DHBA含量。
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1.3 统计学处理 实验结果以平均值±标准差 (x±s)表示, 实验重复3次, n=7。以t检验法判断两组数值间差别的显著性。
2 结果
2.1 GABA对卵巢黄体细胞孕酮生成的影响
观察不同剂量的GABA对黄体细胞孕酮生成的影响, 可见GABA抑制黄体细胞孕酮的生成(图1)。
图 1. GABA对卵巢黄体细胞孕酮生成的影响
Fig.1. Effect of GABA on basal P production by cultured rat luteal cells. **P<0.001, *P<0.01 vs control; n=7.
2.2 GABA对大鼠卵巢黄体细胞OH生成的影响
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水杨酸捕捉黄体细胞培养液中OH后生成羟化产物2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)和2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHBA), 提示GABA明显刺激黄体细胞DHBA生成, OH生成增多(图2)。结果表明, GABA抑制孕酮的生成, 促进OH增多, 说明两者之间有一定的关系。
2.3 GABA对放线菌酮(Cyx)影响下黄体细胞孕酮生成的影响
Cyx为蛋白质合成抑制剂, GABA和Cyx组均可明显抑制黄体细胞孕酮的生成。但GABA+Cyx与GABA单独作用组差异不显著。 P>0.05, 说明GABA对黄体细胞P生成的影响与蛋白质合成无关(图3)。
图 2. GABA对大鼠卵巢黄体细胞OH生成的影响
Fig.2. Effect of GABA on DHBA amount by cultured rat luteal cells under basal condition. *P<0.01 vs control; n=7.
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图 3. GABA对Cyx影响下黄体细胞孕酮生成的影响
Fig.3. Effect of GABA on P production under the influence of cycloheximide by cultured rat luteal cells. *P>0.05 vs GABA, **P<0.001 vs control; n=7.
2.4 GABA对荷包牡丹碱(bicuculline)作用下的黄体细胞孕酮生成的影响
根据不同剂量bicuculline对黄体细胞孕酮生成的影响, 选择最佳剂量观察GABA在有受体阻断剂存在的情况下对孕酮生成的影响。结果表明, 加入不同剂量的bicuculline可明显拮抗GABA对黄体细胞孕酮生成的抑制作用, 使孕酮生成量明显增加(图4)。
2.5 GABA对forskolin作用下的黄体细胞孕酮生成的影响
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Forskolin为腺苷酸环化酶激动剂, 能使细胞内cAMP增加。Forskolin单独作用时可促进黄体细胞孕酮的生成, GABA加入forskolin后, 可明显抑制黄体细胞孕酮的生成(图5)。说明GABA抑制孕酮生成的作用可能与forskolin有关。
图 4. GABA对bicuculline作用下的黄体细胞孕酮生成的影响
Fig.4. Effect of GABA on P production under the influence of bicuculline by cultured rat luteal cells. *P<0.01, **P<0.001 vs control; n=7.
图 5. GABA对forskolin作用下黄体细胞孕酮生成的影响
Fig.5. Effect of GABA on P production under the influence of forskolin by cultured rat luteal cells. *P<0.01, **P<0.001 vs control; n=7.
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3 讨论
GABA作为中枢递质, 既可以在下丘脑水平, 也可在垂体水平参与垂体前叶激素分泌的调节, 间接地影响卵巢的功能。近年又发现卵巢有GABA能神经元, 但作用环节不清楚。孕酮的合成与分泌涉及基因调控新蛋白质合成等一系列环节。本实验发现, GABA明显抑制离体培养的黄体细胞孕酮的分泌, 但是通过何种机制发挥作用的尚不清楚。本实验中GABA和蛋白合成抑制剂Cyx的应用结果表明, GABA抑制孕酮的分泌, 与蛋白质合成无关。有文献报道[5], 在中枢神经系统, GABAA受体不经第二信使, 直接引发跨膜的离子通道传递信息。我们观察到, GABA受体阻断剂可阻断GABA对黄体细胞的孕酮生成的抑制作用, 使孕酮生成增多, 提示在黄体细胞GABA可能通过与中枢相类似的受体发挥作用。
众所周知, 肽类、 蛋白质激素通过cAMP-PKA信息传递系统发挥作用, 该类激素与膜受体结合后, 通过G蛋白激活细胞膜上的腺苷酸环化酶, 继而引起一系列反应。GABA作为氨基酸类神经递质对黄体细胞孕酮生成的影响是否通过cAMP系统, 实验中我们选用了腺苷酸环化酶激动剂forskolin, 以增加内源性cAMP的浓度。实验中观察到, forskolin可促进黄体细胞孕酮的生成, GABA抑制forskolin作用下的孕酮生成, 提示GABA对黄体细胞孕酮生成的影响可能与腺苷酸环化酶系统有关。文献报道GABAA受体β亚单位的膜内面有一个依赖cAMP的蛋白激酶作用产生磷酸化的位置[5]。我们推测, GABA可能与GABA受体β亚单位结合, 通过腺苷酸环化酶-cAMP系统, 影响黄体细胞甾体激素的分泌。
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Miyazaki[6]等报道, 氧自由基与排卵有关。 细胞在代谢过程中不断产生自由基, 如若机体防御机能不足和/或自由基产生过度, 活性较强的自由基将与所接触的非自由基分子反应, 形成另一自由基分子。这会引起自由基不断积累, 侵袭细胞内蛋白质、 脂类和其它有机分子, 导致蛋白质氧化和膜脂质过氧化。本实验观察到, GABA引起黄体细胞自由基增多, 导致DNA断裂, 进而孕酮生成量下降。实验结果也提示, 自由基与孕酮生成可能存在一定关系, 羟自由基增加可使孕酮分泌减少, 可能与凋亡有关[7]。我们发现, GABA除对中枢有作用外, 对外周卵巢黄体细胞也有调节孕酮分泌的作用, 且可影响黄体细胞自由基生成, 从而影响孕酮的分泌。
Corresponding author. Tel: 0451-6669576; E-mail: nijiang@hotmail.com
张辉(哈尔滨医科大学生殖内分泌研究室, 哈尔滨 150086)
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倪江(哈尔滨医科大学生殖内分泌研究室, 哈尔滨 150086)
张玮(哈尔滨医科大学生殖内分泌研究室, 哈尔滨 150086)
田淑君(哈尔滨医科大学生殖内分泌研究室, 哈尔滨 150086)
参 考 文 献
[1] Erdo SL. Higher GABA concentrations in fallopian tube than in brain of the rat. J Neurochem, 1982; 38: 1174～1176.
[2] 荣永海. 自由基与疾病. 《国外医学分子生物学分册》, 1980; 2 (2): 72～75.
[3] 陈季武. 测定OH产生与清除的化学发光体系. 《生物化学与生物物理进展》, 1992, 19 (2): 136～140.
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[4] Wang XN. Effect of tyrosine and its analogues on hCG-in～duced progesterone production by rat corpus luteum in vitro. Chin Med J, 1987; 100 (11): 859.
[5] 韩济生等. 神经科学纲要. 北京, 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1993, 407～415.
[6] Miyazaki T.Effect of inhibition of oxygen free radical on ovu～lation and progesterone production by the in vitro perfused rabbit ovary. J Reprod Fert, 1991; 91: 207～212.
[7] Zhang JH. Effects of inhibin α fragments, tyrosine, ox～y～tocin, PGF2α and estrogen on the occurrence of apoptosis in rat corpus luteal cells. Reprod Contracep, 1998; 18 (5): 274～281.
Received 1999-07-21 Revised 2000-01-02, 百拇医药