经脂多糖(LPS)处理免疫应答大鼠离体脑片视上核神经元对细胞因子敏感性的变化
第四军医大学神经科学研究所； 西安 710032 王晓斌*；胡三觉；鞠躬
关键词：视上核；脑薄片；全细胞记录；细胞因子；白细胞介素-1；白细胞介素-2
摘要：实验采用离体脑片全细胞膜片箝记录方法, 观察了细胞因子白介素-1β(IL-1β)和IL-2对大鼠离体脑片视上核神经元膜电位及自发放电的影响, 以期探明免疫应答大鼠视上核神经元对细胞因子敏感性的变化。结果显示, 用100 U/ml IL-1β灌流脑片, 正常对照的(n=15)和脂多糖(lipopolysaccharide LPS)腹腔注射9 d的大鼠视上核神经元(n=20)超极化, 同时伴有自发放电频率的下降; 应用100 U/ml IL-2, 大部分正常对照视上核神经元(n=14)表现为超极化, 自发放电减少, 剩余部分(n=3)变化不明显; 在LPS免疫9 d大鼠离体脑片上的45个视上核神经元中, 100 U/ml的IL-2使其中19个表现为去极化并伴有自发放电频率增加, 16个变化不明显, 其余10个表现为超极化伴放电频率下降。以上结果表明, 在免疫应答中, 视上核神经元对细胞因子IL-2的敏感性, 在一定的程度上发生了改变, 细胞因子IL-2可能参与了视上核神经元的功能调节, 进而在免疫应答过程中发挥了调节作用。
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神经和内分泌系统在维持系统稳定方面的作用已得到确认, 但细胞因子在维持各组织协调方面似乎起更大的作用。有证据显示白介素-1 (IL-l)和IL-2受体在下丘脑有大量表达, 作用于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalmo-hypophyseal-adrenocortical, HHA)[1~3]对神经内分泌活动起调节作用, 但其中的机制及其在免疫应答中的变化尚不清楚。本实验采用离体脑薄片全细胞膜片箝记录方法, 分别观察了IL-1β及IL-2对正常对照和免疫应答大鼠视上核视神经元膜电活动的影响。
实验用25只出生30~40 d的SD雄性大鼠(50~60 g)。对其中的13只腹腔内注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(250 μg/kg bw)[4]。脑薄片制备方法如前[5]。大鼠腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg bw)麻醉, 断头并迅速取脑, 快速置于0~4℃经95% O2和5% CO2饱和的人工脑脊液中(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)。待脑完全冷却后, 对视上核所在脑区进行修块, 然后在震动切片机(Campden Instruments, USA)上制备厚度约为300 μm的下丘脑脑薄片。脑薄片在26℃持续通以95% O2和5% CO2 的ASCF中孵育至少2 h后移至记录槽, 用尼龙网及U形铂丝框对脑片加以固定, 并以1~2 ml/min的速度灌流26℃持续通以95% O2和5% CO2 的ACSF。在解剖镜(×25)下根据大鼠脑定位图谱分辨视上核, 采用“盲插”方法进行全细胞记录。用PP-83电极拉制器(Narishige, Japan)拉制玻璃微电极, 尖端开口约2 μm。封接前微电极阻抗为3~7 MΩ, 封接电阻2~6 GΩ, 串联电阻小于20 MΩ。在形成全细胞记录方式后, 单细胞的生物电信号经膜片箝放大器Axopatch 200 A放大后, 经DigiData 1200板进行A/D转换后输入计算机, 由软件Pclamp 6.0 (以上均为Axon Instruments Inc产品)进行数据采集和分析。采样频率为10 kHz, 电信号均低通贝塞尔滤波(Lowpass Bessel Filter), -3d频率为2 kHz。
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ACSF的成分为(mmol/L): NaCl 125, KCl 3, CaCl2 2, MgSO4 2, NaH2PO4 1.25, NaHCO3 25, 葡萄糖 10。电极内液的成分(mmol/L): K-gluconate 140, MgCl2 2, HEPES 10, ATP 2, KOH调至pH为7.2。IL-1β, IL-2和LPS均为Sigma公司产品。IL-1β和IL-2通过灌流给予。
实验数据以x±sx表示。
在全细胞电流箝(I=0)情况下观察了97个视上核神经元, 其中对照大鼠的32个, LPS免疫9 d后的65个。它们的静息膜电位没有明显的差异, 分别为-58±9.1和-57±8.6 mV。大多数神经元都有自发的动作电位发放。放电主要有两种形式: 位相型放电和非位相型放电。本实验仅采用非位相型放电的神经元。
15个正常对照大鼠视上核神经元在给予100 U/ml的IL-1β灌流约1 min后, 都表现出不同程度的超极化, 平均为3.3±1.1 mV, 且伴有自发放电频率的下降, 具有冲洗效应。给予正常对照大鼠视上核神经元(n=17)100 U/ml的IL-2后, 14个表现为不同程度的超极化(2.9±1.2 mV), 伴有自发放电减少, 在冲洗后基本恢复到原来的膜电位和自发放电水平, 另外3个变化不明显。
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用LPS腹腔注射免疫9 d后大鼠视上核神经元(n=20)在给予100 U/ml的IL-1β后, 都表现为不同程度的超极化(3.5±1.0 mV), 自发放电频率下降。 在观察的45个用LPS腹腔注射免疫9 d后的视上核神经元中, 100 U/ml的IL-2使其中的19个去极化(2.8±1.1 mV), 同时伴有自发放电频率增加, 16个变化不明显, 其余10个超极化(2.6±0.9 mV)且放电频率下降), 不同的反应与原来的放电类型和频率无明显关系。
细胞因子通过复杂的神经网络调节神经内分泌系统的活动, 但似乎主要还是通过对HHA轴, 特别是下丘脑的调节。近年来已证实下丘脑具有细胞因子IL-1β和IL-2受体[1,2,6,7], 尽管对细胞因子如何通过血脑屏障进入脑内仍存在很大争议, 但实验已证实中枢神经系统可以表达细胞因子[6], 细胞因子可以调节神经激素的分泌[1,8], 但其作用机制仍不清楚。本实验表明, IL-1β和IL-2可以抑制正常大鼠视上核神经元的电活动, 其可能的机制是直接作用于视上核神经元。要航等[9]证实rh IL-1β和rh IL-2可直接影响大鼠海马培养神经元的膜电特性。另一种可能的机制是IL-1β和IL-2兴奋视上核神经元的突触前GABA能中间神经元, 从而间接抑制视上核神经元的活动[10]。
, http://www.100md.com
本实验观察到, 在用LPS免疫后大鼠的视上核神经元对IL-1β的敏感性未发生变化, 而对IL-2的敏感性发生了改变, 这种改变与神经元自身放电的频率和类型没有明显的相关性。视上核神经元对细胞因子的反应性是由其本身和突触前因素(包括兴奋性和抑制性神经元)等几个因素综合作用的结果, 至于哪个因素在其中起主导作用目前尚无定论。对IL-2的敏感性发生改变可能和下丘脑在免疫应答过程中神经元、胶质细胞以及突触前神经元上的细胞因子受体表达水平的变化有关。有关资料显示, 细胞因子受体具有多样性[3], 也正是这种多样性决定了细胞因子生理作用的多样性。在受到伤害、发生感染等刺激时, 中枢的细胞因子浓度发生上调(来自外周, 中枢的胶质细胞或神经元合成分泌), 同时中枢神经系统的细胞因子受体的表达就会发生改变[7], 这也就造成了细胞因子在中枢神经系统作用的改变。和其它许多神经调质一样, 细胞因子在中枢神经系统的作用十分复杂。这就不难理解在不同条件下(在体、离体培养细胞或脑片)不同的部位和神经元类型的作用差异, 甚至同一类型神经元的作用也存在差异或完全相反, 也只有这种复杂性、多样性才能实现对神经系统的精细调节。
, 百拇医药
以往的研究往往集中于行为学和神经内分泌学的研究。本实验则首次运用离体脑片全细胞记录技术, 对LPS免疫后大鼠视上核神经元膜电特性对IL-1β和IL-2敏感性的变化进行了研究。结果显示, 在LPS免疫后视上核神经元对IL-2的敏感发生了改变, 而对IL-1β的敏感性无明显变化。
参考文献
[1]Saphier D, Ovadia H. Selective facilitation of putative corticotropin-releasing factor-secreting neurones by interleukin-1. Neurosci Lett, 1990, 114: 283~288.
[2]Raber J, Bloom FE. IL-2 induces vasopressin release from the hypothalamus and the amygdala: role of nitric oxide-mediated signaling. J Neurosci, 1994, 14 (10): 6187~6195.
, 百拇医药
[3]Hanisch UK, Quirion R. Interleukin-2 as a neuroregulatory cytokine. Brain Res Rev, 1996, 21: 246~284.
[4]Takemura T, Makino S, Takao T et al. Hypothalamic-pituitary-adrenocortical responses to single vs repeated endotoxin lipopolysaccharide administration in the rat. Brain Res, 1997, 767 (2): 181~191.
[5]Liu QS(刘青松), Jia YS(贾铀生), Xie ZP(谢佐平)et al. Whole-cell recordings of the supraoptic nucleus neurons from rat hypothalamic slices in vitro. Acta Physiol Sin (生理学报), 1997, 49 (4): 467~470 (in Chinese with English abstract).
, 百拇医药
[6]Hopkins SJ, Rothwell NJ. Cytokines and the nervous system I: expression and recognition. Trends Neurosci, 1995, 18 (2): 83~88.
[7]Araujo DM, Lapchak PA, Collier B et al. Localization of interleukin-2 immunoreactivity and interleukin-2 receptors in the rat: interaction with the cholinergic system. Brain Res, 1989, 498: 257~266.
[8]Kimura T, Yamamoto T, Ota K et al. Central effects of interleukin-1 on blood pressure, thermogenesis, and the release of vasopressin, ACTH, and atrial natriuretic peptide. Ann N Y Acad Sci, 1993, 689: 330~345.
, 百拇医药
[9]Yao H (要 航), Wang FZ (王福庄), Ding AS (丁爱石) et al. Effects of interleukin-1 and interleukin-2 on electrophysiological characteristics of rat hippocampal neurons in culture. Acta Physiol Sin (生理学报), 1994, 46 (6): 539~545 (in Chinese with English abstract).
[10]Li ZH, Inenaga K, Yamashita H. GABAergic inputs modulate effects of interleukin-1β on supraoptic neurones in vitro. NeuroReport, 1993, 5: 181~183., 百拇医药
关键词：视上核；脑薄片；全细胞记录；细胞因子；白细胞介素-1；白细胞介素-2
摘要：实验采用离体脑片全细胞膜片箝记录方法, 观察了细胞因子白介素-1β(IL-1β)和IL-2对大鼠离体脑片视上核神经元膜电位及自发放电的影响, 以期探明免疫应答大鼠视上核神经元对细胞因子敏感性的变化。结果显示, 用100 U/ml IL-1β灌流脑片, 正常对照的(n=15)和脂多糖(lipopolysaccharide LPS)腹腔注射9 d的大鼠视上核神经元(n=20)超极化, 同时伴有自发放电频率的下降; 应用100 U/ml IL-2, 大部分正常对照视上核神经元(n=14)表现为超极化, 自发放电减少, 剩余部分(n=3)变化不明显; 在LPS免疫9 d大鼠离体脑片上的45个视上核神经元中, 100 U/ml的IL-2使其中19个表现为去极化并伴有自发放电频率增加, 16个变化不明显, 其余10个表现为超极化伴放电频率下降。以上结果表明, 在免疫应答中, 视上核神经元对细胞因子IL-2的敏感性, 在一定的程度上发生了改变, 细胞因子IL-2可能参与了视上核神经元的功能调节, 进而在免疫应答过程中发挥了调节作用。
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神经和内分泌系统在维持系统稳定方面的作用已得到确认, 但细胞因子在维持各组织协调方面似乎起更大的作用。有证据显示白介素-1 (IL-l)和IL-2受体在下丘脑有大量表达, 作用于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalmo-hypophyseal-adrenocortical, HHA)[1~3]对神经内分泌活动起调节作用, 但其中的机制及其在免疫应答中的变化尚不清楚。本实验采用离体脑薄片全细胞膜片箝记录方法, 分别观察了IL-1β及IL-2对正常对照和免疫应答大鼠视上核视神经元膜电活动的影响。
实验用25只出生30~40 d的SD雄性大鼠(50~60 g)。对其中的13只腹腔内注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(250 μg/kg bw)[4]。脑薄片制备方法如前[5]。大鼠腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg bw)麻醉, 断头并迅速取脑, 快速置于0~4℃经95% O2和5% CO2饱和的人工脑脊液中(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)。待脑完全冷却后, 对视上核所在脑区进行修块, 然后在震动切片机(Campden Instruments, USA)上制备厚度约为300 μm的下丘脑脑薄片。脑薄片在26℃持续通以95% O2和5% CO2 的ASCF中孵育至少2 h后移至记录槽, 用尼龙网及U形铂丝框对脑片加以固定, 并以1~2 ml/min的速度灌流26℃持续通以95% O2和5% CO2 的ACSF。在解剖镜(×25)下根据大鼠脑定位图谱分辨视上核, 采用“盲插”方法进行全细胞记录。用PP-83电极拉制器(Narishige, Japan)拉制玻璃微电极, 尖端开口约2 μm。封接前微电极阻抗为3~7 MΩ, 封接电阻2~6 GΩ, 串联电阻小于20 MΩ。在形成全细胞记录方式后, 单细胞的生物电信号经膜片箝放大器Axopatch 200 A放大后, 经DigiData 1200板进行A/D转换后输入计算机, 由软件Pclamp 6.0 (以上均为Axon Instruments Inc产品)进行数据采集和分析。采样频率为10 kHz, 电信号均低通贝塞尔滤波(Lowpass Bessel Filter), -3d频率为2 kHz。
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ACSF的成分为(mmol/L): NaCl 125, KCl 3, CaCl2 2, MgSO4 2, NaH2PO4 1.25, NaHCO3 25, 葡萄糖 10。电极内液的成分(mmol/L): K-gluconate 140, MgCl2 2, HEPES 10, ATP 2, KOH调至pH为7.2。IL-1β, IL-2和LPS均为Sigma公司产品。IL-1β和IL-2通过灌流给予。
实验数据以x±sx表示。
在全细胞电流箝(I=0)情况下观察了97个视上核神经元, 其中对照大鼠的32个, LPS免疫9 d后的65个。它们的静息膜电位没有明显的差异, 分别为-58±9.1和-57±8.6 mV。大多数神经元都有自发的动作电位发放。放电主要有两种形式: 位相型放电和非位相型放电。本实验仅采用非位相型放电的神经元。
15个正常对照大鼠视上核神经元在给予100 U/ml的IL-1β灌流约1 min后, 都表现出不同程度的超极化, 平均为3.3±1.1 mV, 且伴有自发放电频率的下降, 具有冲洗效应。给予正常对照大鼠视上核神经元(n=17)100 U/ml的IL-2后, 14个表现为不同程度的超极化(2.9±1.2 mV), 伴有自发放电减少, 在冲洗后基本恢复到原来的膜电位和自发放电水平, 另外3个变化不明显。
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用LPS腹腔注射免疫9 d后大鼠视上核神经元(n=20)在给予100 U/ml的IL-1β后, 都表现为不同程度的超极化(3.5±1.0 mV), 自发放电频率下降。 在观察的45个用LPS腹腔注射免疫9 d后的视上核神经元中, 100 U/ml的IL-2使其中的19个去极化(2.8±1.1 mV), 同时伴有自发放电频率增加, 16个变化不明显, 其余10个超极化(2.6±0.9 mV)且放电频率下降), 不同的反应与原来的放电类型和频率无明显关系。
细胞因子通过复杂的神经网络调节神经内分泌系统的活动, 但似乎主要还是通过对HHA轴, 特别是下丘脑的调节。近年来已证实下丘脑具有细胞因子IL-1β和IL-2受体[1,2,6,7], 尽管对细胞因子如何通过血脑屏障进入脑内仍存在很大争议, 但实验已证实中枢神经系统可以表达细胞因子[6], 细胞因子可以调节神经激素的分泌[1,8], 但其作用机制仍不清楚。本实验表明, IL-1β和IL-2可以抑制正常大鼠视上核神经元的电活动, 其可能的机制是直接作用于视上核神经元。要航等[9]证实rh IL-1β和rh IL-2可直接影响大鼠海马培养神经元的膜电特性。另一种可能的机制是IL-1β和IL-2兴奋视上核神经元的突触前GABA能中间神经元, 从而间接抑制视上核神经元的活动[10]。
, http://www.100md.com
本实验观察到, 在用LPS免疫后大鼠的视上核神经元对IL-1β的敏感性未发生变化, 而对IL-2的敏感性发生了改变, 这种改变与神经元自身放电的频率和类型没有明显的相关性。视上核神经元对细胞因子的反应性是由其本身和突触前因素(包括兴奋性和抑制性神经元)等几个因素综合作用的结果, 至于哪个因素在其中起主导作用目前尚无定论。对IL-2的敏感性发生改变可能和下丘脑在免疫应答过程中神经元、胶质细胞以及突触前神经元上的细胞因子受体表达水平的变化有关。有关资料显示, 细胞因子受体具有多样性[3], 也正是这种多样性决定了细胞因子生理作用的多样性。在受到伤害、发生感染等刺激时, 中枢的细胞因子浓度发生上调(来自外周, 中枢的胶质细胞或神经元合成分泌), 同时中枢神经系统的细胞因子受体的表达就会发生改变[7], 这也就造成了细胞因子在中枢神经系统作用的改变。和其它许多神经调质一样, 细胞因子在中枢神经系统的作用十分复杂。这就不难理解在不同条件下(在体、离体培养细胞或脑片)不同的部位和神经元类型的作用差异, 甚至同一类型神经元的作用也存在差异或完全相反, 也只有这种复杂性、多样性才能实现对神经系统的精细调节。
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以往的研究往往集中于行为学和神经内分泌学的研究。本实验则首次运用离体脑片全细胞记录技术, 对LPS免疫后大鼠视上核神经元膜电特性对IL-1β和IL-2敏感性的变化进行了研究。结果显示, 在LPS免疫后视上核神经元对IL-2的敏感发生了改变, 而对IL-1β的敏感性无明显变化。
参考文献
[1]Saphier D, Ovadia H. Selective facilitation of putative corticotropin-releasing factor-secreting neurones by interleukin-1. Neurosci Lett, 1990, 114: 283~288.
[2]Raber J, Bloom FE. IL-2 induces vasopressin release from the hypothalamus and the amygdala: role of nitric oxide-mediated signaling. J Neurosci, 1994, 14 (10): 6187~6195.
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[4]Takemura T, Makino S, Takao T et al. Hypothalamic-pituitary-adrenocortical responses to single vs repeated endotoxin lipopolysaccharide administration in the rat. Brain Res, 1997, 767 (2): 181~191.
[5]Liu QS(刘青松), Jia YS(贾铀生), Xie ZP(谢佐平)et al. Whole-cell recordings of the supraoptic nucleus neurons from rat hypothalamic slices in vitro. Acta Physiol Sin (生理学报), 1997, 49 (4): 467~470 (in Chinese with English abstract).
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[6]Hopkins SJ, Rothwell NJ. Cytokines and the nervous system I: expression and recognition. Trends Neurosci, 1995, 18 (2): 83~88.
[7]Araujo DM, Lapchak PA, Collier B et al. Localization of interleukin-2 immunoreactivity and interleukin-2 receptors in the rat: interaction with the cholinergic system. Brain Res, 1989, 498: 257~266.
[8]Kimura T, Yamamoto T, Ota K et al. Central effects of interleukin-1 on blood pressure, thermogenesis, and the release of vasopressin, ACTH, and atrial natriuretic peptide. Ann N Y Acad Sci, 1993, 689: 330~345.
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[9]Yao H (要 航), Wang FZ (王福庄), Ding AS (丁爱石) et al. Effects of interleukin-1 and interleukin-2 on electrophysiological characteristics of rat hippocampal neurons in culture. Acta Physiol Sin (生理学报), 1994, 46 (6): 539~545 (in Chinese with English abstract).
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