钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的心脏成纤维细胞增殖中的作用
北京医科大学第一医院心血管研究所、 1中心实验室； 北京 100034 许松1；符民桂；许玉凤1；庞永政；唐朝枢**
关键词：钙调神经磷酸酶； 血管紧张素Ⅱ； 信号通路； 环孢素A； 成纤维细胞增殖
摘要：本研究观察了钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)刺激的大鼠心脏成纤维细胞增殖中的作用。在培养的大鼠心脏成纤维细胞上, 应用双波长荧光光度计检测Fura-2标记的细胞游离Ca2+浓度; 应用对硝基苯磷酸(PNPP)作底物测定钙调神经磷酸酶(CaN)活性; 根据 3H-胸腺嘧啶掺入法评估CaN特异性抑制剂环胞素A(CsA)对AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞DNA合成的影响。结果表明, AngⅡ(10-7 mol/L)刺激培养的大鼠心脏成纤维细胞 3H-胸腺嘧啶掺入较对照组增高72%(P<0.01), CsA可以抑制AngⅡ刺激的细胞 3H-胸腺嘧啶掺入。AngⅡ刺激的大鼠心脏成纤维细胞胞内Ca2+浓度及CaN活性较对照组分别增高112%(P<0.01)和17%(P<0.05)。结果提示, CaN在一定程度上参与AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖的信号传递。
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近年的研究表明[1], 血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ, AngⅡ)具有生长因子样作用, 是刺激心肌肥大的重要体液因素之一, 它可诱导心肌细胞肥大, 并可刺激心脏成纤维细胞增殖。钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)是一种受Ca2+及钙调素(calmodulin, CaM)活化的蛋白磷酸酶, 可通过使活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell, NF-AT)去磷酸化, 使后者转位入核, 从而调节核内一系列基因的表达。新近的研究表明[2,3], CaN在心肌肥大的发生中起着重要作用, 可能是胞内Ca2+浓度升高致肥大基因活化的耦联环节。我们以前的工作证实, CaN依赖的信号通路参与AngⅡ刺激的心肌细胞肥大[4]; 但CaN在AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞增殖中是否起作用, 目前尚未见报道。本工作在培养的新生大鼠心脏成纤维细胞上, 观察AngⅡ对胞内Ca2+浓度及CaN活性的影响, 以及CaN特异性抑制剂环孢素A (cyclosporin A, CsA)[5,6]对AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞DNA合成的影响。
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1材料和方法
1.1 动物与试剂 1 d龄的Wistar大鼠幼鼠由北京医科大学实验动物中心提供; RPMI 1640培养基购自GIBCO.BRL公司; AngⅡ、CaM、H7、PD098059、PNPP、Fura-2/AM均为Sigma公司产品; 环胞素A为Sandoz公司产品; 3H-胸腺嘧啶 (3870 kBq/mmol)购自中国原子能研究所; 其余试剂均为分析纯级。
1.2 细胞培养 按Simpson等[7]描述的方法分离培养大鼠心室肌的成纤维细胞。α-actin鉴别成纤维细胞呈阴性。实验用第4~6代细胞。
1.3 胞浆钙离子水平([Ca2+]i)测定 用常规方法进行心脏成纤维细胞的[Ca2+]i测定[8]。
1.4 钙调神经磷酸酶活性测定[9] 以2×105 cells/ml密度的心脏成纤维细胞用低血清(2%)培养液培养及不同浓度药物处理。在液氮中反复冻融破碎细胞, 离心取上清, 用考马斯亮蓝法蛋白定量后进行CaN活性测定。410 nm读取吸光度, 以空白底物液调零,每样本用底物Ⅰ液测出的值为磷酸酶的总活力; 底物Ⅱ液测出的值是非CaN的其它磷酸酶活力, 两者之差即CaN酶活力, 结果以比活力(ΔA410nm/mg Pr)表示。
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1.5 3H-胸腺嘧啶掺入按常规方法进行[10]。
1.6 细胞存活率测定 取培养上清作乳酸脱氢酶(LDH)测定; 细胞悬液用0.2%台盼蓝染色以确定细胞存活率。
1.7 统计学分析 所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用多组间方差分析及组间q检验作统计学处理, P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1 AngⅡ对心脏成纤维细胞[Ca2+]i及CaN活性的影响
AngⅡ刺激心脏成纤维细胞24 h后, 胞内游离Ca2+浓度较对照组增高112% (477±69 vs 226±34 nmol/L,P<0.01)); 同时, AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞CaN活性较对照组增高17% (10.3±2.1 vs 8.8±2.9 A410 nmol/mg Pr, P<0.05)。
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2.2 CsA对AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞 3H-TdR掺入的影响
AngⅡ(10-7 mol/L)刺激的大鼠心脏成纤维细胞DNA合成速率明显增加, 3H-胸腺嘧啶掺入较对照组增高72%(P<0.01); CsA (0.1~10 μmol/L)以浓度依赖的方式抑制AngⅡ刺激的细胞 3H-胸腺嘧啶掺入。应用0.1、1和10 μmol/L的CsA与心脏成纤维细胞孵育, 其 3H-TdR掺入与对照组无明显差异(10?675±1?596、10?544±1?184、9?981±896 vs 10?900±1?234 cpm/2×105 cells, P>0.05)。
2.3 CsA对心脏成纤维细胞活力的影响
CsA (0.1~10 μmol/L)与心脏成纤维细胞孵育24 h后培养上清液中的LDH活性及细胞台盼蓝着色数与对照组间差异均无显著性(P>0.05)。
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3讨论
心肌肥大及纤维化是心肌对机械负荷及神经体液因子改变的基本应答; 其病理变化主要包括心肌细胞肥大和非心肌细胞(特别是成纤维细胞)增埴。AngⅡ是刺激心肌肥大的重要体液因素之一, 不但可诱导心肌细胞肥大, 还可刺激心脏成纤维细胞增殖。AngⅡ在引起这些反应的细胞信号转导机制非常复杂, 目前认为是通过AT1受体介导的[11]。 AT1受体是一种G蛋白耦联受体, 受体活化后可激活丝裂素活化激酶(MAPK)途径和激活细胞膜的磷脂酶系统, 生成三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG), 后两者使胞内Ca2+浓度升高及PKC活化。活化的MAPK及PKC可转位入核, 调节核内的基因表达。但胞内Ca2+信号活化基因转录的途径一直不甚清楚。我们以前的工作证实, 由Ca2+活化的CaN在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的信号传递中起重要作用。本工作在培养的大鼠心脏成纤维细胞上观察到, AngⅡ可使心脏成纤维细胞胞浆Ca2+浓度及CaN活性明显增高; AngⅡ 可显著刺激心脏成纤维细胞DNA合成速率增加。应用CaN抑制剂CsA(0.1~10 μmol/L), 该浓度不引起细胞明显毒性作用(LDH释放和降解排斥染料数的变化均无统计学意义), CsA以浓度依赖的方式抑制AngⅡ刺激的DNA合成速率增加, 这些结果提示CaN可能参与AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞增殖的信号传递。
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Tomono等曾报道[12], 应用CsA和FK506可明显抑制多种生长因子(PDGF、FGF、LA和thrombin)刺激的Swiss 3T3成纤维细胞的DNA合成; 其后的研究发现, CaN依赖的信号途径参与对Swiss 3T3成纤维细胞细胞周期蛋白基因的表达调控。综合这些资料提示, CaN作为钙信号下游的一个多功能信号酶, 可能参与多种细胞生长的信号传递。
参考文献
[1]Lee MA, Bohm M, Paul M et al. Tissue renin-Angiotensin system: their role in cardiovascular disease. Circ Res, 1993, 87: 7~15.
[2]Molkentin JD, Lu JR, Antos CL et al. A calcineurin dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy. Cell, 1998, 93: 215~228.
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[3]Sussman MA, Lim HW, Gude N et al. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science, 1998, 281: 1690~1693.
[4]Fu MG (符民桂), Wang XH (王晓红), Jiang ZS (姜志胜) et al. Involement of calcineurin-dependent signal pathway in the angiotensinⅡ-induced cardiac myocyte hypertrophy. Acta Phaysiol Sin(生理学报), 1999, 51 (5): 597~601 (in chinese with English abstract).
[5]Ho S, Clipstone N, Timmermann L et al. Thr mechanism of actin of cyclosporin A and FK506. Clin Immuno Immunopathol, 1996， 80 (3): S40~S45.
, 百拇医药
[6]Morioka M, Hamada J, Ushio Y et al. Potential role of calcineurin for brain ischemia and traumatic injury. Prog Neurobiol， 1999， 58 (1)： 1~30.
[7]Simpson P, McGrath A, Savion S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat culture and its regulation by serum and by catecholamines. Circ Res, 1982, 51: 787~801.
[8]Xu JL (徐济良), Yang ML (杨敏麟), Guan YY (关永源) et al. The effect of naphthymethyl isoquinoling on Ca2+entry at rat myocardial cells. Chin Pharmacol Bull (中国药理学通报)， 1997, 13 (5): 444~445 (in Chinese with Engilish abstract).
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[9]Pallen CJ, Wang JH. Calmodulin-stimulated dephosphorylation of p-Nireophenyl phosphate and free phosphotyrosine by calcineurin. J Biol Chem, 1983, 258: 8550~8553.
[10]Daeman M, Sohwartz SM. AngiotensinⅡ induces smooth muscle cell proliferation in the normal and injured rat arterial wall. Circ Res, 1991, 68: 450~457.
[11]Sadoshima J, Izumo S. Signal transduction pathway of angiotensinⅡ-induced c-fos gene expression in cardiac myocytes in vitro. Circ Res, 1993, 73: 424~438.
[12]Tomono M, Toyoshima K, Ito M et al. Calcineurin is essential for DNA synthesis in Swiss 3T3 fibroblasts. Bri Chem J, 1996, 317: 675~680., 百拇医药
关键词：钙调神经磷酸酶； 血管紧张素Ⅱ； 信号通路； 环孢素A； 成纤维细胞增殖
摘要：本研究观察了钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)刺激的大鼠心脏成纤维细胞增殖中的作用。在培养的大鼠心脏成纤维细胞上, 应用双波长荧光光度计检测Fura-2标记的细胞游离Ca2+浓度; 应用对硝基苯磷酸(PNPP)作底物测定钙调神经磷酸酶(CaN)活性; 根据 3H-胸腺嘧啶掺入法评估CaN特异性抑制剂环胞素A(CsA)对AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞DNA合成的影响。结果表明, AngⅡ(10-7 mol/L)刺激培养的大鼠心脏成纤维细胞 3H-胸腺嘧啶掺入较对照组增高72%(P<0.01), CsA可以抑制AngⅡ刺激的细胞 3H-胸腺嘧啶掺入。AngⅡ刺激的大鼠心脏成纤维细胞胞内Ca2+浓度及CaN活性较对照组分别增高112%(P<0.01)和17%(P<0.05)。结果提示, CaN在一定程度上参与AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖的信号传递。
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近年的研究表明[1], 血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ, AngⅡ)具有生长因子样作用, 是刺激心肌肥大的重要体液因素之一, 它可诱导心肌细胞肥大, 并可刺激心脏成纤维细胞增殖。钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)是一种受Ca2+及钙调素(calmodulin, CaM)活化的蛋白磷酸酶, 可通过使活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell, NF-AT)去磷酸化, 使后者转位入核, 从而调节核内一系列基因的表达。新近的研究表明[2,3], CaN在心肌肥大的发生中起着重要作用, 可能是胞内Ca2+浓度升高致肥大基因活化的耦联环节。我们以前的工作证实, CaN依赖的信号通路参与AngⅡ刺激的心肌细胞肥大[4]; 但CaN在AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞增殖中是否起作用, 目前尚未见报道。本工作在培养的新生大鼠心脏成纤维细胞上, 观察AngⅡ对胞内Ca2+浓度及CaN活性的影响, 以及CaN特异性抑制剂环孢素A (cyclosporin A, CsA)[5,6]对AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞DNA合成的影响。
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1材料和方法
1.1 动物与试剂 1 d龄的Wistar大鼠幼鼠由北京医科大学实验动物中心提供; RPMI 1640培养基购自GIBCO.BRL公司; AngⅡ、CaM、H7、PD098059、PNPP、Fura-2/AM均为Sigma公司产品; 环胞素A为Sandoz公司产品; 3H-胸腺嘧啶 (3870 kBq/mmol)购自中国原子能研究所; 其余试剂均为分析纯级。
1.2 细胞培养 按Simpson等[7]描述的方法分离培养大鼠心室肌的成纤维细胞。α-actin鉴别成纤维细胞呈阴性。实验用第4~6代细胞。
1.3 胞浆钙离子水平([Ca2+]i)测定 用常规方法进行心脏成纤维细胞的[Ca2+]i测定[8]。
1.4 钙调神经磷酸酶活性测定[9] 以2×105 cells/ml密度的心脏成纤维细胞用低血清(2%)培养液培养及不同浓度药物处理。在液氮中反复冻融破碎细胞, 离心取上清, 用考马斯亮蓝法蛋白定量后进行CaN活性测定。410 nm读取吸光度, 以空白底物液调零,每样本用底物Ⅰ液测出的值为磷酸酶的总活力; 底物Ⅱ液测出的值是非CaN的其它磷酸酶活力, 两者之差即CaN酶活力, 结果以比活力(ΔA410nm/mg Pr)表示。
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1.5 3H-胸腺嘧啶掺入按常规方法进行[10]。
1.6 细胞存活率测定 取培养上清作乳酸脱氢酶(LDH)测定; 细胞悬液用0.2%台盼蓝染色以确定细胞存活率。
1.7 统计学分析 所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用多组间方差分析及组间q检验作统计学处理, P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1 AngⅡ对心脏成纤维细胞[Ca2+]i及CaN活性的影响
AngⅡ刺激心脏成纤维细胞24 h后, 胞内游离Ca2+浓度较对照组增高112% (477±69 vs 226±34 nmol/L,P<0.01)); 同时, AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞CaN活性较对照组增高17% (10.3±2.1 vs 8.8±2.9 A410 nmol/mg Pr, P<0.05)。
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2.2 CsA对AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞 3H-TdR掺入的影响
AngⅡ(10-7 mol/L)刺激的大鼠心脏成纤维细胞DNA合成速率明显增加, 3H-胸腺嘧啶掺入较对照组增高72%(P<0.01); CsA (0.1~10 μmol/L)以浓度依赖的方式抑制AngⅡ刺激的细胞 3H-胸腺嘧啶掺入。应用0.1、1和10 μmol/L的CsA与心脏成纤维细胞孵育, 其 3H-TdR掺入与对照组无明显差异(10?675±1?596、10?544±1?184、9?981±896 vs 10?900±1?234 cpm/2×105 cells, P>0.05)。
2.3 CsA对心脏成纤维细胞活力的影响
CsA (0.1~10 μmol/L)与心脏成纤维细胞孵育24 h后培养上清液中的LDH活性及细胞台盼蓝着色数与对照组间差异均无显著性(P>0.05)。
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心肌肥大及纤维化是心肌对机械负荷及神经体液因子改变的基本应答; 其病理变化主要包括心肌细胞肥大和非心肌细胞(特别是成纤维细胞)增埴。AngⅡ是刺激心肌肥大的重要体液因素之一, 不但可诱导心肌细胞肥大, 还可刺激心脏成纤维细胞增殖。AngⅡ在引起这些反应的细胞信号转导机制非常复杂, 目前认为是通过AT1受体介导的[11]。 AT1受体是一种G蛋白耦联受体, 受体活化后可激活丝裂素活化激酶(MAPK)途径和激活细胞膜的磷脂酶系统, 生成三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG), 后两者使胞内Ca2+浓度升高及PKC活化。活化的MAPK及PKC可转位入核, 调节核内的基因表达。但胞内Ca2+信号活化基因转录的途径一直不甚清楚。我们以前的工作证实, 由Ca2+活化的CaN在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的信号传递中起重要作用。本工作在培养的大鼠心脏成纤维细胞上观察到, AngⅡ可使心脏成纤维细胞胞浆Ca2+浓度及CaN活性明显增高; AngⅡ 可显著刺激心脏成纤维细胞DNA合成速率增加。应用CaN抑制剂CsA(0.1~10 μmol/L), 该浓度不引起细胞明显毒性作用(LDH释放和降解排斥染料数的变化均无统计学意义), CsA以浓度依赖的方式抑制AngⅡ刺激的DNA合成速率增加, 这些结果提示CaN可能参与AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞增殖的信号传递。
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Tomono等曾报道[12], 应用CsA和FK506可明显抑制多种生长因子(PDGF、FGF、LA和thrombin)刺激的Swiss 3T3成纤维细胞的DNA合成; 其后的研究发现, CaN依赖的信号途径参与对Swiss 3T3成纤维细胞细胞周期蛋白基因的表达调控。综合这些资料提示, CaN作为钙信号下游的一个多功能信号酶, 可能参与多种细胞生长的信号传递。
参考文献
[1]Lee MA, Bohm M, Paul M et al. Tissue renin-Angiotensin system: their role in cardiovascular disease. Circ Res, 1993, 87: 7~15.
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[3]Sussman MA, Lim HW, Gude N et al. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science, 1998, 281: 1690~1693.
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[5]Ho S, Clipstone N, Timmermann L et al. Thr mechanism of actin of cyclosporin A and FK506. Clin Immuno Immunopathol, 1996， 80 (3): S40~S45.
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[6]Morioka M, Hamada J, Ushio Y et al. Potential role of calcineurin for brain ischemia and traumatic injury. Prog Neurobiol， 1999， 58 (1)： 1~30.
[7]Simpson P, McGrath A, Savion S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat culture and its regulation by serum and by catecholamines. Circ Res, 1982, 51: 787~801.
[8]Xu JL (徐济良), Yang ML (杨敏麟), Guan YY (关永源) et al. The effect of naphthymethyl isoquinoling on Ca2+entry at rat myocardial cells. Chin Pharmacol Bull (中国药理学通报)， 1997, 13 (5): 444~445 (in Chinese with Engilish abstract).
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[10]Daeman M, Sohwartz SM. AngiotensinⅡ induces smooth muscle cell proliferation in the normal and injured rat arterial wall. Circ Res, 1991, 68: 450~457.
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[12]Tomono M, Toyoshima K, Ito M et al. Calcineurin is essential for DNA synthesis in Swiss 3T3 fibroblasts. Bri Chem J, 1996, 317: 675~680., 百拇医药