周围神经损伤后外源性GDNF对神经元的保护作用
第二军医大学神经生物学教研室； 上海 200433；1中国科学院上海脑研究所； 上海 200031 陈哲宇；曹莉；路长林**；何成；鲍睿1
关键词：胶质细胞源性神经营养因子；周围神经损伤；神经元
摘要：采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型, 局部给予胶质细胞源性神经营养因子(GDNF), 应用尼氏染色、酶组织化学染色方法, 观察到外源性GDNF能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目, 降低脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元中胆碱酯酶(CHE)及酸性磷酸酶(ACP)变化的幅度。这表明外源性GDNF能保护周围神经切断后引起的神经元损伤。
周围神经损伤在平时和战时都较为常见。目前, 应用显微外科技术修复损伤的周围神经, 并结合一定治疗措施, 使周围神经损伤后的疗效得到较大程度提高, 但其功能恢复仍不尽如人意[1]。神经营养因子是机体产生的调控神经细胞存活、生长、分化的一类可溶性蛋白质, 在神经再生、突触形成与突触可塑性以及神经损伤修复过程中起着重要的作用[2]。应用外源性神经营养因子治疗周围神经损伤是目前引人注目的方法和研究的热点之一。胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)于1993年由Lin LF等发现[3], 属于转化生长因子-β超家族成员, 它的成熟蛋白质由134个氨基酸残基组成, 有3对二硫键。 我们已成功克隆了GDNF基因并实现其在大肠杆菌及昆虫细胞中的高效表达[4,5]。GDNF能与GDNF受体α结合, 使得受体酪氨酸激酶RET磷酸化后传导细胞内信号, 对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元及交感神经元都有神经营养作用[6,7]。是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子[8]。
, 百拇医药
一些在体实验表明, 外源性GDNF能促进成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞的存活, 能减少新生大鼠面神经损伤后神经元死亡的数量[9,10]。但目前尚未见 GDNF 对成年大鼠坐骨神经切断后脊髓及脊神经节神经元退行性变的影响。我们应用尼氏染色、酶组织化学染色方法, 研究外源性GDNF对成年大鼠坐骨神经切断硅管套接后神经元数目、神经元中酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)及胆碱酯酶(cholinesterase, CHE)的影响, 为临床应用外源性神经营养因子治疗周围神经损伤提供了一定的实验依据。
1材料和方法
1.1 重组人GDNF 根据我们先前报道的制备[4], 纯度大于90%, 浓度为1 μg/μl。
1.2 动物与动物模型 体重150~200 g的雄性SD大鼠30只, 随机分为2组: 生理盐水组及GDNF组。动物的一侧坐骨神经不做手术作为正常对照侧, 另一侧作为手术侧。暴露游离手术侧股后部坐骨神经, 切除股方肌下缘3 mm以下长约2 mm的一段神经, 用9-0无创线套接神经断端入8 mm长的硅管(外径2 mm, 内径1 mm)中, 神经断端间距约5 mm。术中依不同组别动物, 用微量进样器分别将生理盐水(0.9% saline, SAL) 25 μl、GDNF 25 μl原液注入硅管神经断端间和损伤神经周围。
, 百拇医药
1.3 动物固定、切片和染色 术后2周及4周, 以2%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉。4%多聚甲醛经心灌注固定, 取出脊髓L3~L5节段和两侧L4、L5脊神经节, 存于20%蔗糖生理盐水(4℃)过夜。冰冻连续切片, 片厚15 μm, 6片一组。取一片进行尼氏染色[11], 用0.1%甲苯胺蓝常温染色2~4 h, 95%酒精分色; 一片按Karnovsky法[12]进行CHE染色, 切片在孵育液(0.05%碘化乙酰硫代胆碱, 0.065 mol/L醋酸缓冲液 pH 5.5, 2.94%枸橼酸钠, 0.75%硫酸铜, 0.164%铁氰化钾)中37℃漂染2 h, 蒸馏水洗后酒精脱水; 另一片按Gomori法[11]进行ACP染色, 切片在孵育液(2% β-甘油磷酸钠, 2%醋酸铅, 0.05 mol/L醋酸缓冲液 pH 5.0)中37℃片染3 h, 蒸馏水洗后入1%硫化铵溶液1 min, 蒸馏水洗后酒精脱水。二甲苯透明, 中性树脂封片。
1.4 图像分析及统计处理 在CA-P-530图像采取卡(中国自动化技术研究所生产)、IBMAT286和Olympus BX60组成的图像处理系统上进行显微图像分析。对同一批染色的切片, 根据染色的灰度定下同一标准, 然后由计算机自动计数, 统计神经元数目及阳性颗粒的面积。用t检验进行组间比较。
, http://www.100md.com
2结果
2.1 脊髓前角运动神经元的存活率
尼氏体系神经细胞体内含有的特异性嗜色质, 各种类型神经元内尼氏体的形状、大小与分布均不相同。我们一般习惯于借尼氏体来辨认或鉴定神经细胞的存在和它们的分布及是否发生病理性改变。坐骨神经切断2周及4周后, 取L4节段脊髓, 计数尼氏小体着色呈虎斑状的脊髓前角外侧核大、中型神经元的数目, 以损伤侧(右侧)与正常侧(左侧)同类神经元的比率作为脊髓前角运动神经元的存活率。通过t检验进行组间比较。从中可以看到术后2周及4周, SAL组脊髓前角运动神经元的存活率分别为(85.3±6.3)%和(79.6±5.8)%; GDNF组脊髓前角运动神经元的存活率分别为(95.8±7.2)%和(84.2±6.1)%, 两组之间存在显著性差异。这一结果表明, GDNF能够促进坐骨神经切断后脊髓前角运动神经元的存活。
2.2 CHE活性
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脊髓正常侧前角外侧核大、中型神经元CHE酶阳性颗粒呈深黄色, L4、L5脊神经节小型神经元呈红褐色, 细胞轮廓清楚、核不着色。与正常侧相比, SAL组脊髓修复侧前角外侧核及脊神经节CHE染色明显变淡, GDNF组相应神经元染色略淡于正常侧。坐骨神经切断后2周及4周, SAL组及GDNF组的正常侧和损伤侧(左右两侧)脊髓前角外侧核及脊神经节CHE染色阳性颗粒面积的百分率, 及各组百分率的t检验。从中我们可以看到术后2周及4周GDNF组与SAL组的百分率有显著性差异, 说明GDNF能够缓解外周神经损伤造成的神经元CHE活性降低, 并且这种作用早期更为明显。
2.3ACP活性
脊髓正常侧前角外侧核大、中型神经元ACP酶阳性反应颗粒呈浅黄色, SAL组脊髓修复侧前角外侧核大、中型神经元酶阳性颗粒呈深棕色, 而GDNF组相应部位神经元酶阳性颗粒近浅棕色, 与正常侧相近。正常侧L4、L5脊神经节小型神经元胞体酶阳性反应颗粒呈浅棕色, SAL组修复侧L4、L5脊神经节小型神经元酶阳性反应颗粒深染以致呈黑色, 而GDNF组修复侧与正常侧相近坐骨神经切断后2周及4周, SAL组及GDNF组的正常侧和损伤侧(左右两侧)脊髓前角外侧核及脊神经节ACP染色阳性颗粒面积的百分率, 及各组百分率的t检验。我们看到术后2周及4周GDNF组与SAL组的百分率有显著性差异, 说明GDNF能够缓解外周神经损伤造成的神经元ACP活性升高, 并且这种作用也以早期更为明显。
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3讨论
周围神经损伤后, 部分神经元死亡而消失, 部分存活神经元出现不同程度的退行性变, 如胞核偏位、粗面内质网解聚、溶酶体增多及一些酶的活性发生变化, 其中CHE、ACP活性变化最为明显[2]。CHE位于粗面内质网中, 与粗面内质网的结构完整和功能活动密切相关。损伤神经元CHE活性减弱是粗面内质网解聚、数量减少、功能消退的结果。ACP是溶酶体的标志酶。损伤神经元ACP活性增强表示其溶酶体数量增加、功能活跃, 而溶酶体水解酶释放增加可使细胞受损甚至死亡。因此, 胞体中CHE、ACP的活性能反应神经元逆行变性的程度。脊髓L4节段前角外侧核和L4脊神经节的CHE、ACP酶阳性反应颗粒以神经元中最为明显, 其它组织不明显, 且上述核团和脊神经节的大部分神经元的轴突进入到坐骨神经中。因此, 我们观察到的上述核团和脊神经节胞体密集区的神经元数目, CHE、ACP酶阳性颗粒基本能反映坐骨神经损伤后神经元的退变情况。
外周神经损伤的早期, 再生轴突未能到达远端神经, 以致经逆行轴浆运输至胞体的神经营养因子明显减少, 这是神经元胞体逆行性变化的原因之一[13], 因此, 外周神经损伤后给予外源性神经营养因子有可能减轻胞体逆行性变, 使神经再生的物质供给得到保证。近年来研究表明, 适当长度的管状物套接周围神经能提高神经再生的准确性或趋向性, 同时也为施加外源性因子作用于损伤神经提供了有益的空间。故我们采用硅管套接神经并允许神经选择性再生的实验模型, 比较符合临床情况。在此实验模型上, 给予外源性GDNF能减少脊髓修复侧运动神经元死亡的数目, 降低脊髓运动神经元及脊神经节感觉神经元CHE、ACP活性变化的幅度。上述结果表明, 外源性GDNF能保护成年大鼠外周神经损伤后运动神经元及感觉神经元的退行性变, 并且这种保护作用在损伤的早期(2周)较晚期(4周)更为明显, 这向我们提示了外周神经损伤后早期给予GDNF治疗的有效性和必要性。已有实验证实, 外周神经损伤后受损神经及肌肉中GDNF受体α亚基的表达升高[14], 外源性给予的GDNF有可能通过由受体介导的内吞后逆轴突运输到神经元胞体, 发挥神经营养作用。
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本实验还显示, 局部一次性于硅管中损伤神经周围给予超生理剂量GDNF能减少脊髓修复侧运动神经元死亡的数目, 降低运动神经元及感觉神经元CHE及ACP变化的幅度。由此可见, 应用重组GDNF治疗周围神经损伤时, 局部给药的有效性和重要性。避免全身大剂量给予重组GDNF还将有助于简化治疗方案, 避免大剂量给予GDNF所带来的副作用。
参考文献
[1]Fu SY, Gordon M. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol, 1997, 14: 67~94.
[2]Lewin GR, Bard YA. Physiology of neurotrophins. Annu Rev Neurosci, 1996, 19: 289~317.
, 百拇医药
[3]Lin LF, Doherty DH, Lile JD et al. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science, 1993, 260 (5111): 1130~1132.
[4]Chen ZY (陈哲宇), LU CL (路长林), WU XF (吴祥甫) et al. The human recombinant GDNF and study of its biological activity. Acta Biochim Biophys Sin (生物化学与生物物理学报), 1999, 31 (2): 207~210 (in Chinese with English abstract).
[5]Chen ZY (陈哲宇), LU CL (路长林), WU XF (吴祥甫) et al. High expression of human GDNF in insect cells. Acta Biochim Biophys Sin (生物化学与生物物理学报), 1999, 31 (3): 245~248 (in Chinese with English abstract).
, 百拇医药
[6]Trupp M, Ryden M, Jornvall H et al. Peripheral expression and biological activities of GDNF: A new neurotrophic factor from avian and mammalian peripheral neurons. J Cell Biol, 1995, 130 (1): 137~148.
[7]Sanicola M, Hession C, Worley D et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-dependent RET activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 6238~6243.
[8]Henderson CE, Philips HS, Pollock RA et al. GDNF: A potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science, 1994, 266: 1062~1064.
, http://www.100md.com
[9]Yan Q, Wang J, Matheson CR et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) promotes the survival of axotomized retinal ganglion cells in adult rats: comparison to and combination with brain-derived neurotrophic factor (BDNF). J Neurobiol, 1999, 38 (3): 382~390.
[10]Walton KM. GDNF: a novel factor with therapeutic potential for neurodegenerative disorders. Mol Neurobiol, 1999, 19 (1): 43~59.
[11]杜卓民。实用组织学技术。北京: 人民卫生出版社, 1998, 144~324.
, http://www.100md.com
[12]Karnovsky MJ, Roots LA. “Direct-coloring” thiocholin method for cholinesterases. J Histochem Cytochem, 1964, 12: 219~223.
[13]Ebadi M, Bashir RM, Heidrick ML, et al. Neurotrophins and their receptors in nerve injury and repair. Neurochem Int, 1997, 30 (4-5): 347~374.
[14]Burazin TC, Gundlach AL. Up-regulation of GDNFR-alpha and c-ret mRNA in facial motor neurons following facial nerve injury in the rat. Brain Res Mol Brain Res, 1998, 55 (2): 331~336., 百拇医药
关键词：胶质细胞源性神经营养因子；周围神经损伤；神经元
摘要：采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型, 局部给予胶质细胞源性神经营养因子(GDNF), 应用尼氏染色、酶组织化学染色方法, 观察到外源性GDNF能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目, 降低脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元中胆碱酯酶(CHE)及酸性磷酸酶(ACP)变化的幅度。这表明外源性GDNF能保护周围神经切断后引起的神经元损伤。
周围神经损伤在平时和战时都较为常见。目前, 应用显微外科技术修复损伤的周围神经, 并结合一定治疗措施, 使周围神经损伤后的疗效得到较大程度提高, 但其功能恢复仍不尽如人意[1]。神经营养因子是机体产生的调控神经细胞存活、生长、分化的一类可溶性蛋白质, 在神经再生、突触形成与突触可塑性以及神经损伤修复过程中起着重要的作用[2]。应用外源性神经营养因子治疗周围神经损伤是目前引人注目的方法和研究的热点之一。胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)于1993年由Lin LF等发现[3], 属于转化生长因子-β超家族成员, 它的成熟蛋白质由134个氨基酸残基组成, 有3对二硫键。 我们已成功克隆了GDNF基因并实现其在大肠杆菌及昆虫细胞中的高效表达[4,5]。GDNF能与GDNF受体α结合, 使得受体酪氨酸激酶RET磷酸化后传导细胞内信号, 对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元及交感神经元都有神经营养作用[6,7]。是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子[8]。
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一些在体实验表明, 外源性GDNF能促进成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞的存活, 能减少新生大鼠面神经损伤后神经元死亡的数量[9,10]。但目前尚未见 GDNF 对成年大鼠坐骨神经切断后脊髓及脊神经节神经元退行性变的影响。我们应用尼氏染色、酶组织化学染色方法, 研究外源性GDNF对成年大鼠坐骨神经切断硅管套接后神经元数目、神经元中酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)及胆碱酯酶(cholinesterase, CHE)的影响, 为临床应用外源性神经营养因子治疗周围神经损伤提供了一定的实验依据。
1材料和方法
1.1 重组人GDNF 根据我们先前报道的制备[4], 纯度大于90%, 浓度为1 μg/μl。
1.2 动物与动物模型 体重150~200 g的雄性SD大鼠30只, 随机分为2组: 生理盐水组及GDNF组。动物的一侧坐骨神经不做手术作为正常对照侧, 另一侧作为手术侧。暴露游离手术侧股后部坐骨神经, 切除股方肌下缘3 mm以下长约2 mm的一段神经, 用9-0无创线套接神经断端入8 mm长的硅管(外径2 mm, 内径1 mm)中, 神经断端间距约5 mm。术中依不同组别动物, 用微量进样器分别将生理盐水(0.9% saline, SAL) 25 μl、GDNF 25 μl原液注入硅管神经断端间和损伤神经周围。
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1.3 动物固定、切片和染色 术后2周及4周, 以2%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉。4%多聚甲醛经心灌注固定, 取出脊髓L3~L5节段和两侧L4、L5脊神经节, 存于20%蔗糖生理盐水(4℃)过夜。冰冻连续切片, 片厚15 μm, 6片一组。取一片进行尼氏染色[11], 用0.1%甲苯胺蓝常温染色2~4 h, 95%酒精分色; 一片按Karnovsky法[12]进行CHE染色, 切片在孵育液(0.05%碘化乙酰硫代胆碱, 0.065 mol/L醋酸缓冲液 pH 5.5, 2.94%枸橼酸钠, 0.75%硫酸铜, 0.164%铁氰化钾)中37℃漂染2 h, 蒸馏水洗后酒精脱水; 另一片按Gomori法[11]进行ACP染色, 切片在孵育液(2% β-甘油磷酸钠, 2%醋酸铅, 0.05 mol/L醋酸缓冲液 pH 5.0)中37℃片染3 h, 蒸馏水洗后入1%硫化铵溶液1 min, 蒸馏水洗后酒精脱水。二甲苯透明, 中性树脂封片。
1.4 图像分析及统计处理 在CA-P-530图像采取卡(中国自动化技术研究所生产)、IBMAT286和Olympus BX60组成的图像处理系统上进行显微图像分析。对同一批染色的切片, 根据染色的灰度定下同一标准, 然后由计算机自动计数, 统计神经元数目及阳性颗粒的面积。用t检验进行组间比较。
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2结果
2.1 脊髓前角运动神经元的存活率
尼氏体系神经细胞体内含有的特异性嗜色质, 各种类型神经元内尼氏体的形状、大小与分布均不相同。我们一般习惯于借尼氏体来辨认或鉴定神经细胞的存在和它们的分布及是否发生病理性改变。坐骨神经切断2周及4周后, 取L4节段脊髓, 计数尼氏小体着色呈虎斑状的脊髓前角外侧核大、中型神经元的数目, 以损伤侧(右侧)与正常侧(左侧)同类神经元的比率作为脊髓前角运动神经元的存活率。通过t检验进行组间比较。从中可以看到术后2周及4周, SAL组脊髓前角运动神经元的存活率分别为(85.3±6.3)%和(79.6±5.8)%; GDNF组脊髓前角运动神经元的存活率分别为(95.8±7.2)%和(84.2±6.1)%, 两组之间存在显著性差异。这一结果表明, GDNF能够促进坐骨神经切断后脊髓前角运动神经元的存活。
2.2 CHE活性
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脊髓正常侧前角外侧核大、中型神经元CHE酶阳性颗粒呈深黄色, L4、L5脊神经节小型神经元呈红褐色, 细胞轮廓清楚、核不着色。与正常侧相比, SAL组脊髓修复侧前角外侧核及脊神经节CHE染色明显变淡, GDNF组相应神经元染色略淡于正常侧。坐骨神经切断后2周及4周, SAL组及GDNF组的正常侧和损伤侧(左右两侧)脊髓前角外侧核及脊神经节CHE染色阳性颗粒面积的百分率, 及各组百分率的t检验。从中我们可以看到术后2周及4周GDNF组与SAL组的百分率有显著性差异, 说明GDNF能够缓解外周神经损伤造成的神经元CHE活性降低, 并且这种作用早期更为明显。
2.3ACP活性
脊髓正常侧前角外侧核大、中型神经元ACP酶阳性反应颗粒呈浅黄色, SAL组脊髓修复侧前角外侧核大、中型神经元酶阳性颗粒呈深棕色, 而GDNF组相应部位神经元酶阳性颗粒近浅棕色, 与正常侧相近。正常侧L4、L5脊神经节小型神经元胞体酶阳性反应颗粒呈浅棕色, SAL组修复侧L4、L5脊神经节小型神经元酶阳性反应颗粒深染以致呈黑色, 而GDNF组修复侧与正常侧相近坐骨神经切断后2周及4周, SAL组及GDNF组的正常侧和损伤侧(左右两侧)脊髓前角外侧核及脊神经节ACP染色阳性颗粒面积的百分率, 及各组百分率的t检验。我们看到术后2周及4周GDNF组与SAL组的百分率有显著性差异, 说明GDNF能够缓解外周神经损伤造成的神经元ACP活性升高, 并且这种作用也以早期更为明显。
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3讨论
周围神经损伤后, 部分神经元死亡而消失, 部分存活神经元出现不同程度的退行性变, 如胞核偏位、粗面内质网解聚、溶酶体增多及一些酶的活性发生变化, 其中CHE、ACP活性变化最为明显[2]。CHE位于粗面内质网中, 与粗面内质网的结构完整和功能活动密切相关。损伤神经元CHE活性减弱是粗面内质网解聚、数量减少、功能消退的结果。ACP是溶酶体的标志酶。损伤神经元ACP活性增强表示其溶酶体数量增加、功能活跃, 而溶酶体水解酶释放增加可使细胞受损甚至死亡。因此, 胞体中CHE、ACP的活性能反应神经元逆行变性的程度。脊髓L4节段前角外侧核和L4脊神经节的CHE、ACP酶阳性反应颗粒以神经元中最为明显, 其它组织不明显, 且上述核团和脊神经节的大部分神经元的轴突进入到坐骨神经中。因此, 我们观察到的上述核团和脊神经节胞体密集区的神经元数目, CHE、ACP酶阳性颗粒基本能反映坐骨神经损伤后神经元的退变情况。
外周神经损伤的早期, 再生轴突未能到达远端神经, 以致经逆行轴浆运输至胞体的神经营养因子明显减少, 这是神经元胞体逆行性变化的原因之一[13], 因此, 外周神经损伤后给予外源性神经营养因子有可能减轻胞体逆行性变, 使神经再生的物质供给得到保证。近年来研究表明, 适当长度的管状物套接周围神经能提高神经再生的准确性或趋向性, 同时也为施加外源性因子作用于损伤神经提供了有益的空间。故我们采用硅管套接神经并允许神经选择性再生的实验模型, 比较符合临床情况。在此实验模型上, 给予外源性GDNF能减少脊髓修复侧运动神经元死亡的数目, 降低脊髓运动神经元及脊神经节感觉神经元CHE、ACP活性变化的幅度。上述结果表明, 外源性GDNF能保护成年大鼠外周神经损伤后运动神经元及感觉神经元的退行性变, 并且这种保护作用在损伤的早期(2周)较晚期(4周)更为明显, 这向我们提示了外周神经损伤后早期给予GDNF治疗的有效性和必要性。已有实验证实, 外周神经损伤后受损神经及肌肉中GDNF受体α亚基的表达升高[14], 外源性给予的GDNF有可能通过由受体介导的内吞后逆轴突运输到神经元胞体, 发挥神经营养作用。
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本实验还显示, 局部一次性于硅管中损伤神经周围给予超生理剂量GDNF能减少脊髓修复侧运动神经元死亡的数目, 降低运动神经元及感觉神经元CHE及ACP变化的幅度。由此可见, 应用重组GDNF治疗周围神经损伤时, 局部给药的有效性和重要性。避免全身大剂量给予重组GDNF还将有助于简化治疗方案, 避免大剂量给予GDNF所带来的副作用。
参考文献
[1]Fu SY, Gordon M. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol, 1997, 14: 67~94.
[2]Lewin GR, Bard YA. Physiology of neurotrophins. Annu Rev Neurosci, 1996, 19: 289~317.
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[3]Lin LF, Doherty DH, Lile JD et al. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science, 1993, 260 (5111): 1130~1132.
[4]Chen ZY (陈哲宇), LU CL (路长林), WU XF (吴祥甫) et al. The human recombinant GDNF and study of its biological activity. Acta Biochim Biophys Sin (生物化学与生物物理学报), 1999, 31 (2): 207~210 (in Chinese with English abstract).
[5]Chen ZY (陈哲宇), LU CL (路长林), WU XF (吴祥甫) et al. High expression of human GDNF in insect cells. Acta Biochim Biophys Sin (生物化学与生物物理学报), 1999, 31 (3): 245~248 (in Chinese with English abstract).
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[6]Trupp M, Ryden M, Jornvall H et al. Peripheral expression and biological activities of GDNF: A new neurotrophic factor from avian and mammalian peripheral neurons. J Cell Biol, 1995, 130 (1): 137~148.
[7]Sanicola M, Hession C, Worley D et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-dependent RET activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 6238~6243.
[8]Henderson CE, Philips HS, Pollock RA et al. GDNF: A potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science, 1994, 266: 1062~1064.
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[9]Yan Q, Wang J, Matheson CR et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) promotes the survival of axotomized retinal ganglion cells in adult rats: comparison to and combination with brain-derived neurotrophic factor (BDNF). J Neurobiol, 1999, 38 (3): 382~390.
[10]Walton KM. GDNF: a novel factor with therapeutic potential for neurodegenerative disorders. Mol Neurobiol, 1999, 19 (1): 43~59.
[11]杜卓民。实用组织学技术。北京: 人民卫生出版社, 1998, 144~324.
, http://www.100md.com
[12]Karnovsky MJ, Roots LA. “Direct-coloring” thiocholin method for cholinesterases. J Histochem Cytochem, 1964, 12: 219~223.
[13]Ebadi M, Bashir RM, Heidrick ML, et al. Neurotrophins and their receptors in nerve injury and repair. Neurochem Int, 1997, 30 (4-5): 347~374.
[14]Burazin TC, Gundlach AL. Up-regulation of GDNFR-alpha and c-ret mRNA in facial motor neurons following facial nerve injury in the rat. Brain Res Mol Brain Res, 1998, 55 (2): 331~336., 百拇医药