重症急性胰腺炎肠微循环的改变与细菌移位关系的实验研究
作者：陈建中 戴植本
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院普外科[陈建中(现在汕头大学医学院附属第一医院普外科，515031)、戴植本]
关键词：胰腺炎；微循环；微球体；细菌移位
中华外科杂志98z119 【摘要】 目的 运用放射性生物微球技术测定肠血流量,了解重症急性胰腺炎肠血流量的改变与细菌移位的关系。 方法 30只大鼠随机分成三组,每组10只。Ⅰ组：血流实验组。Ⅱ组：细菌移位实验组。Ⅲ组：正常血流对照组。第Ⅰ组在诱导胰腺炎2.5小时后运用放射性生物微球技术测定肠血流量。第Ⅱ组在诱导胰腺炎2.5小时后同时期收集肠系膜淋巴结、胰腺、腹水、肝脏作培养，并通过抗菌谱和质粒DNA分析对携质粒大肠杆菌作鉴定。 结果 重症急性胰腺炎发病后2.5小时，包括近端小肠、远端小肠和结肠在内的肠血流量都显著降低(P<0.01)，但此时肠道基本无细菌移位发生。 结论 由肠血流改变所致的肠粘膜损伤可能是细菌移位发生的基础。
The relationship between microcirculation and bacterial translocation in severe acut pancreatitis Chen Jianzhong, Dai Zhiben.Department of General Surgery,Tongji Hosptal, Tongji Medical University, Wuhan 430030.
【Abstract】 Objective To measure the blood flow of intestine and explore the relationship between the changes of blood flow in intestine of rats with severe acute pancreatitis and bacterial translocation. Method Thirty rats were randomly divided into three groups (each group 10 rats):experimental group of blood flow (Ⅰ); experimental group of bacterial translocation (Ⅱ);normal control group of blood flow (Ⅲ).Radioactive biomicrosphere technique, was used to measure the blood flow of intestinal segments for 2.5 hours after induction of severe acute pancreatitis in group Ⅰ. The mesenteric lymph node, pancreas, peritoneal fluid and liver were harvested for culture at the same period after induction in group Ⅱ,and E.Coli which bears plasmids was identified by antibiography and plasmid DNA analysis. Result The blood flow of intestinal segments, proximal small bowl,distal small bowl and colon was decreased significantly 2.5 hours after induction of severe acute pancreatitis(P<0.01),and no bacterial translocation occurred at the same time. Conclusion Macosal injury which led by the change of blood flow may be the primary cause why bacterial translocation happens.
【Key words】 Pancreatitis Microcirculation Microspheres Bacterial translocation
肠道细菌移位不仅能引起感染,而且还能导致休克、多脏器功能衰竭。重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是外科常见的急重病之一,腹腔内继发感染是其死亡的最常见原因[1，2]，继发感染的原因可能是细菌移位。目前,人们对胰腺炎时肠道粘膜屏障功能如何受损从而导致细菌移位这一过程所知甚少。为此，我们用放射性生物微球技术测定大鼠重症急性胰腺炎模行的肠血流量,以探索重症急性胰腺炎时肠血流量变化与细菌移位的关系。
材料和方法
1.99m Tc放射性生物微球的制备[3]：直接从蛙心脏取血2 ml,用机械抗凝法去除纤维及大部分白细胞和血小板。取抗凝的蛙血0.05 ml,用0.65%盐水洗涤3次后加入氯化乙酰-焦磷酸钠溶液500 ml,在38℃保温振动5分钟。再用0.65%盐水洗涤3次,加0.1 mCi 99m Tc，在38℃保温并振动45分钟,而后再加入等量的甲醛生理盐水溶液固定3小时。用生理盐水稀释,离心去上清液,重复4次,直至放射性离解率低于2%为止,测定放射性标记率。99m Tc半衰期仅6.02小时,因此应用时需新鲜制备。
2.动物分组及实验过程：30只实验大鼠，雌雄不限,每只重200～300克,分三组，每组10只。Ⅰ组：血流实验组；Ⅱ组：细菌移位实验组；Ⅲ组：正常血流对照组。Ⅰ组大鼠首先完成SAP模型，2.5小时后按器官血流量测量方法操作，测定各肠段血流量。Ⅱ组完成SAP模型后,以等量生理盐水代替生物微球注入,2.5小时后处死动物,取肠系膜淋巴结匀浆培养,观察该时相细菌生长情况并计数，剖取肠段作病理切片。Ⅲ组一开始即按器官血流量测量方法测定血流量，作为正常对照，以了解正常肠道血流状况。
3.器官血流量的检测[4]：Ⅰ组和Ⅲ组实验大鼠,用盐酸氯胺酮(100 mg/kg)麻醉。右颈动脉和右股动脉各插入一根导管(PE-50),分别插至左心室和腹主动脉。左颈外静脉插入另一导管,接微量输液泵(IVAC-560),实验全程输注生理盐水(0.1 ml/min)。直肠温度控制在37℃左右。
上述操作结束后,制备重症急性胰腺炎大鼠模型，2.5小时后,从左心室导管注入0.4 ml 99m Tc生物微球,注射前12秒开始从腹主动脉用电子微量泵抽取血液1.2 ml(1 ml/min)。然后迅速用10% KCl静脉注射处死动物,解剖所需肠段,冲洗肠腔后吸干称重,用γ能谱仪(FJ-2011)测1分钟脉冲数(cpm)。血流量按下式计算:
4.胰腺炎模型制备与动物准备：Ⅰ、Ⅱ组大鼠,用乙醚浅麻醉,严格无菌下正中线入腹,提起脾及胰尾,沿胰被膜下均匀注射4%脱氧牛磺胆酸钠1 ml,胰腺在短时间内出现肉眼可见的出血水肿、局部坏死,数小时后腹腔内出现浑浊腹水,肠管不同程度膨胀,网膜、肠系膜上均可见皂化斑,模型稳定[5]。经病理切片证实。
选择一健康大鼠活杀,自肠道分离培养鼠粪中一株大肠杆菌,将所构建重组质粒转化入大肠杆菌[6],扩增于LB培养基。由于携质粒大肠杆菌具有抗氨苄青霉素和卡那霉素的特性，因此能在含上述两种抗生素的培养基上生长。实验组和对照组动物均饮用按300 μg/ml氨苄青霉素和300 μg/ml卡那霉素及上述携质粒菌的LB培养基配成的饮用水,自由连续饮用4天,然后饮用水氨苄青霉素的浓度改为100 μg/ml，卡那霉素改为50 μg/ml再连续饮用2天,确保目的菌株成为优势菌群定植于鼠肠道。用含氨苄青霉素100 μg/ml，卡那霉素50 μg/ml的培养基培养鼠粪,证实含质粒的大肠杆菌已定植于肠道，于制模后2.5小时活杀Ⅱ组大鼠，取肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)、胰腺、腹水、肝脏,定量后匀浆,每克组织分成4个培养皿，培养24小时，培养条件同鼠粪 ,阳性者计数菌落形成单位(colony-forming units，cfu)。挑菌落快速提取鉴定。
5.统计方法：实验数据用
±1.96 s表示,t检验法比较组间差异有无显著性意义。结果
1. Ⅰ组与Ⅲ组各组织血流量及心输出量测定结果(见附表)。
附表 Ⅰ组与Ⅲ组各组织血流量、心输出量测定结果 组 别
心输出量(ml/min)
组织血流量(ml/g)
十二指肠
结肠
近端小肠
远端小肠
Ⅲ组(n=10)
79.7±6.96
2.65±0.186
0.62±0.097
1.52±0.056
1.59±0.084
Ⅰ组(n=10)
59.8±4.41*
2.59±0.168
0.43±0.094*
0.78±0.067*
0.77±0.059*
注：与对照组相比，P<0.01 Ⅰ组与Ⅲ组相比近端小肠、远端小肠、十二指肠、结肠的组织血流量下降率分别为48.7%、51.6%、2.26%、30.6%，心输出量的下降率为24.95%。近端小肠、远端小肠、结肠的组织血流量下降率与心输出量的下降率相比差异有显著意义(P<0.01)。
2.Ⅱ组各器官组织匀浆培养，在肠系膜淋巴结匀浆40板培养皿中仅有一板疑似菌落且没有提取出质粒，其余各板及其它脏器均为阴性培养结果，因此基本可认为是杂菌污染。
3.SAP模型建立2.5小时后肠粘膜开始出现病理改变，绒毛明显水肿，伴少量炎性细胞浸润，可见绒毛顶部剥脱。
讨论
已有实验证明,急性胰腺炎时细菌能够移位至内脏器官[7，8]，活菌移位后,不仅能导致败血症,还可引起致命的胰腺继发感染。移位的细菌体崩解产生的内毒素和其它一些所谓“超抗原”类毒素,还可直接作用于免疫系统产生免疫抑制等恶性影响,严重扰乱内环境,促进细菌移位恶性循环,并直接导致感染、休克、多脏器功能衰竭等严重后果[9～11]。
近年来,人们一直在寻求重症急性胰腺炎时细菌移位发生的原因及其影响因素,以进一步加深对细菌移位过程的了解,达到抑制和防治细菌移位的目的。有学者认为肠道粘膜屏障缺血或缺血/再灌注损伤是介导细菌移位的主要机制[12],认为缺血和缺氧是肠粘膜损伤和细菌移位发生的主要原因。
放射性微球技术是现代微循环研究应用最广泛的技术之一,它能够在组织水平(毛细血管水平)上测定血流量,优于测量和观察动脉血流的其它方法。这主要是因为它能避免分流和动静脉短路等改变对组织血流测定的影响,从而保证测定的准确性[5]。放射性生物微球具有同样的优点,还具有制作简单,生物源性等特点。因此可以用放射性生物微球代替放射性微球准确测定器官组织的血流量变化[4]。
在我们的系列实验中，相同实验条件下，重症急性胰腺炎发病4小时、12小时已发现细菌移位，移位细胞数量与发病时间成正相关，而发病后2小时于相应组织及器官中没有发现细菌移位[7]。
本实验结果显示：重症急性胰腺炎发病后2.5小时也未发现细菌移位。因此，则可以明确此时基本无细菌移位。但用放射性生物微球技术测定肠血流已发现明显改变，心输出量显著减少(P<0.01)。除十二指肠外,肠组织血流量也有显著下降(P<0.01)。近端小肠与远端小肠的血流量下降到对照组的50%左右(48.7%和51.6%),与心输出量的下降率比较,都有显著性差异(P<0.01)。这些结果表明不仅肠绝对血流量大幅度下降,其相对血流量也显著下降,而且具有选择性,以远端小肠、近端小肠为主,结肠次之。事实上这些肠段内含有大量细菌,正是细菌移位可能发生的区域。
我们发现肠粘膜在细菌移位发生前的最早时相里已经发生可以检查到的病理改变，随后的病理改变还包括粘膜的完整性受到破坏。有文献报道：缺血和缺血/再灌注损伤能够导致粘膜类似的损伤[12]。我们在急性胰腺炎模型上也发现肠血流量不足先于细菌移位,制模后2.5小时细菌移位基本还未发生，而SAP肠道血流量已经明显下降，尤以各段小肠、结肠为甚。推测血流因素可能确实是SAP时细菌移位的基本因素之一,也就是说组织灌流量的减少是导致细菌移位发生的主要原因之一。这种单纯缺血和缺血/再灌注损伤肠粘膜，可为氧源性自由基所介导,导致肠粘膜通透性增高,这种损伤过程可被抗自由基损伤类药物异黄嘌呤等所拮抗[13]。我们认为：在重症急性胰腺炎,一定程度的缺血缺氧可能和其它有害因素,如炎症介质、细胞因子等一起,复合作用于肠粘膜细胞而产生损害,最终导致细菌移位。
参考文献
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(收稿：1998-04-08 修回：1998-09-27)