心肌梗塞与细胞凋亡关系的初步探索
作者：刘琦 常志文
单位：首都医科大学附属北京同仁医院干部医疗科 100730
关键词：心肌梗塞；细胞凋亡；Bcl-2；Bax
心肺血管病杂志000212
摘要 探索人类心肌梗塞时心肌细胞凋亡的证据。选用TUNEL的方法对22例急慢性心肌梗塞的心肌标本及14例无心血管疾病的心肌标本进行检测。应用免疫组化的方法对细胞凋亡的相关基因Bcl-2和Bax进行检测。急性梗塞区及梗塞周边区凋亡细胞明显增多，以周边区域最为明显(P<0.001);陈旧梗塞区仍能见到凋亡细胞，较急性区域明显减少(P<0.001)；在梗塞组正常区域及对照组偶见有凋亡细胞，2组间无显著差异。在人类心肌梗塞的细胞学检测中发现有大量的凋亡细胞，为认识心血管疾病展示了新的视野。
细胞凋亡(Apoptosis)是一种与坏死截然不同的死亡方式，这是一种经基因精密调控的程序化细胞死亡(Programmed cell death)[1]。以往的研究认为细胞凋亡不发生在终末分化的心肌细胞和神经元细胞中。直到90年代初，由于凋亡的分子生物学方面的进展及实验手段的提高，人们在多种心血管疾病及正常老年心脏中发现了细胞凋亡的证据[2，3]，并开展了心肌细胞凋亡及相关基因的研究，但目前国内在此方面的报道较少。为此，我们将我院1986年至1997年36例尸检标本进行回顾性研究，以探索人类心肌梗塞与心肌细胞凋亡的关系，对人类最终控制心血管疾病提供理论依据和防治措施。
, 百拇医药
材料和方法
1.资料来源 36例心肌标本取自同仁医院1986年至1997年尸检标本。急性心肌梗塞病人22例，其中10例伴有陈旧心梗。临床上均有急慢性心肌梗塞病史，组织学有急慢性心肌梗塞的病理改变。对照组14例是临床无心血管疾病依据，(死于消化道出血，车祸，中毒性肺炎等)，病理无心肌缺血表现的心肌标本。
2.方法 凋亡细胞检测选用末端标记TUNEL法，TUNEL试剂盒购自美国Boehringer Mannheim公司，具体按照试剂盒内说明书操作，以Tris-HCL缓冲液替代生物素标记末端转移酶的切片同时染色作为阴性对照。Bcl-2和Bax检测应用生物素-链酶亲和标记蛋白显色法，Bax兔IgG多抗，Bcl-2鼠抗人单克隆抗体，生物素化山羊抗兔(IgF-Bio)二抗及辣根酶标记链霉卵白素(S-A/HRP)等试剂购自美国Zymed公司。具体操作如下：切片脱蜡至水，3% H2O2浸泡15min，滴加5%的正常大鼠血清封闭10min，吸干血清，滴加一抗，4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素孵育60min，DAB显色，苏木素复染。以Tris-HCL缓冲液替代一抗的切片同时染色作为阴性对照。所有标本同时切片行常规HE染色。
, 百拇医药
3.评定方法 TUNEL染色，阳性细胞核为棕黄色；Bcl-2和Bax染色，阳性细胞浆为棕黄色。选取相应部位，细胞计数在200倍高倍视野下，用标准的10×10目镜栏珊计数，共计数10个视野；结果以阳性细胞数占细胞总数的平均百分比表示。
4.统计分析 本研究所有数据均用SPSS软件进行统计学处理。数据以均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验。
结 果
1. HE染色 (1)急性梗塞区域 早期损伤的心肌仍保存细胞轮廓，细胞核固缩，肌浆凝聚；胞浆嗜酸性增强，横纹不清或消失收缩带形成；进一步发生凝固性坏死。凝固性坏死的心肌细胞位于梗塞中心区，梗塞间质有出血和炎性细胞浸润(图1)。(2)陈旧梗塞区 心肌纤维消失代之以瘢痕组织形成(图2)。(3)对照组 观察左心室，均为正常的组织学形态，无出血坏死和炎症表现。所有标本未见有典型凋亡小体。
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图1 急性心梗组织胞浆嗜酸性增强，可见凝固性坏死及炎性细胞浸润HE×100
图2 陈旧心梗组织可见局部瘢痕形成HE×100
2.TUNEL染色 (1)与HE相对应的急性梗塞区梗塞周边区均有较多细胞核呈棕色凋亡细胞，较对照组明显增多(P<0.001)，以周边部增多最为显著，与梗塞中心区相比P<0.001。(2)陈旧梗塞区可见有散在的凋亡细胞，较急性区域明显减少(P<0.001)。(3)远离梗塞区及对照组的心肌组织中极偶见凋亡细胞。对照组的凋亡细胞数量与远离梗塞灶的正常区域的心肌组织无差异(P=0.698)见图3～图7，表1。
表1 凋亡细胞在心梗各区域及对照组中的分布
急性
, 百拇医药
梗塞区
A
急性
周边区
B
陈旧
梗塞区
C
梗塞组
正常区
D
对照组
E
均 数
, 百拇医药
标准差
标准误
19.37
7.94
1.69
36.27
14.44
3.08
4.72
1.82
0.67
3.52
1.99
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0.42
3.22
2.15
0.83
图3 急性心梗组织可见较多凋亡
细胞 TUNEL染色×200
图4 陈旧心梗组织凋亡细胞散在
分布 TUNEL染色×200
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图5 Bcl-2阳性细胞呈散在
分布 Bcl-2染色×100
图6 Bax阳性细胞呈散在分布 Bax染色×100
图7 凋亡细胞在各组分布
3.Bcl-2和Bax染色 (1)急性梗塞区及周边区域Bcl-2表达增加(20/22)；Bax的表达亦增加(21/22)(图5)。(2)陈旧梗塞区域Bcl-2偶见(1/10)，而瘢痕区未见Bcl-2的表达；陈旧梗塞区域仍可见Bax有较多表达(图6)。(3)正常对照组及梗塞组正常区域极偶见Bcl-2的表达；Bax的表达较前2组减少。
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表2 Bcl-2和Bax在心梗各组及对照组中的分布
急性梗塞区
陈旧梗塞区
梗塞组正常区
对照组
Bcl-2表达
Bax表达
91.1%(20/22)
95.4%(21/22)
20.0%(2/10)
33.3%(3/10)
9.1%(2/22)
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13.6%(3/22)
7.0%(1/14)
21.1%(3/14)
讨 论
程序化细胞死亡-细胞凋亡存在于各组织细胞中，对细胞的正常分化，成熟和发育具有重要的平衡意义。然而，细胞凋亡异常又会带来严重危害。在终末期分化的心肌细胞中，细胞凋亡的研究起步较晚。1993年，人们在ARVD(先天右室发育不良)的病人心肌上发现了细胞凋亡的证据[4]，它提示在人类心脏上亦存在有细胞凋亡。
Saraste等[5]用TUNEL和琼脂糖免疫凝胶电泳的方法对8例死于急性心肌梗塞的病人心肌标本进行研究，其中6例是生前接受了成功溶栓的组织标本，结果显示各标本均可见到典型的凋亡生化特征。心肌细胞凋亡在心肌梗塞的周边部(border zones)最为明显。本实验与Saraste等结果相一致，在急性心梗时，在急性梗塞中心部及其周边部可检测到较多凋亡细胞，以梗塞周边部最为显著，在陈旧梗塞区域仍能见到凋亡细胞。推测在心肌细胞发生缺血损伤时首先启动了凋亡机制，随着损伤加重和时间的延长，缺血中心区域便出现坏死，而梗塞周边的心肌细胞处于可逆的损伤状态，在这一区域的细胞死亡仍以凋亡为主。一些实验显示心室壁重构现象，存活的心肌细胞肥大及毛细血管增生减少在邻近梗塞区域更为明显[6]，提示心肌细胞凋亡使心梗后结构和功能的恢复受到限制。周边部心肌细胞凋亡使梗塞周围的心肌细胞继续死亡。可见心肌细胞凋亡在心梗预后中起着重要的作用。另外，在陈旧梗塞区域见到细胞凋亡，证实细胞凋亡可长期存在于梗塞周边部，在较长时间内可因细胞凋亡使心肌细胞丢失。
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本实验中未发现有凋亡小体，可能存在下列原因：1.细胞凋亡后凋亡小体迅速被巨噬细胞吞噬，这种过程较短暂，不易被观察到。2.由于邻近坏死细胞激活了炎性细胞而改变了细胞凋亡的进程。炎性细胞的浸润和激活可能使凋亡转化为坏死，即凋亡和坏死可能有共同途径。3.可能在心肌细胞中只要部分凋亡途径被激活。染色质固缩和DNA片段化可在心肌组织中观察到[7]，而形成凋亡小体的必要因素在心肌组织中缺失。但要发现凋亡小体缺失的确切原因，需进行系统细致的研究。
原癌基因Bcl-2是目前公认的促进细胞生存抑制细胞凋亡的长寿基因[8]。正常情况下，Bcl-2在心肌中不表达，Bax仅有弱表达。在本实验中在急性梗塞区域可见有Bcl-2表达增加，而陈旧梗塞区仅有弱表达。推测Bcl-2的表达挽救了心梗早期阶段的存活细胞。在心肌细胞受到缺血损伤时，Bcl-2立即启动，其基因产物的表达可抑制或逆转细胞凋亡的发生，与此同时Bax与Bcl-2平行增高，Bcl-2和Bax的相互作用决定了细胞是否继续存活[9]。Bcl-2抑制细胞凋亡的机制尚不十分清楚，可能与抗氧化途径，阻止细胞内钙重新分布，直接或间接影响其他死亡信号对细胞的作用，以及加速DNA的修复来起作用。Bax是与Bcl-2同处一家族的成员之一，可通过与Bcl-2形成异源二聚体，从而抑制了Bcl-2的作用。
, 百拇医药
目前心血管疾病已成为威胁人类生命的重要病因，心肌梗塞的发病率亦呈上升趋势。在人类急性心肌梗塞中细胞凋亡及其标志物的发现拓展了心肌梗塞的发病机理。细胞凋亡是一个复杂的过程，是有动态发展的特点，如能寻求控制心肌细胞凋亡的机制，对心脏病患者的诊断及治疗有重要意义。
参考文献
1，Kerr,JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239～257.
2，Richardo HB,Hailey LS,Xie SS,et al.In situ apoptosis assay for the detection of early acute myocardial infarction.American J of Pathol,1996,149:821～829.
, 百拇医药
3，Narula J,Haider N,Virmani R,et al.Apoptosis in cardiomcytes in end-stage heart failure.N Engl J Med,1996,335:1181～1189.
4，Mallat Z,Tedgui A,Fontaliran F,et al.Evidence of apoptosis in arrhythmogenic right ventricular dysplasia.The New England Journal of Medicine,1996,335(16):1190～1201.
5，Saraste A,Pulkki K,Kallagoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction.Circulation,1997,95:320～323.
, http://www.100md.com
6，Anversa P,Oliveiti G,Meggs LG,et al.Cardiac anatomy and ventricular loading after myocardial infaract.Circulation,1993,87:22～27.
7，Gottlieb EA,Burleson KA,Kloner RA,et al.Reperfusion injury induces apoptosis in myocardium of cardiomyocytes.J Clin Invest,1994,94:1621～1929.
8，Cleary MY,Sklar J.Nrcleotide sequence of t(14∶18)chromosal breakpoint in follicular lymphoma and demostration of breakpoint-cluster region near a transcriptionally active locus on chromosome 18.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:7439～7443.
9，Olitvai ZN,Milliman CL,Korsmeyer SJ.Bcl-2 hetermodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerate programmed cell death.Cell,1993,74:609～619.
收稿日期：1999-08-01
修回日期：1999-10-17, 百拇医药
单位：首都医科大学附属北京同仁医院干部医疗科 100730
关键词：心肌梗塞；细胞凋亡；Bcl-2；Bax
心肺血管病杂志000212
摘要 探索人类心肌梗塞时心肌细胞凋亡的证据。选用TUNEL的方法对22例急慢性心肌梗塞的心肌标本及14例无心血管疾病的心肌标本进行检测。应用免疫组化的方法对细胞凋亡的相关基因Bcl-2和Bax进行检测。急性梗塞区及梗塞周边区凋亡细胞明显增多，以周边区域最为明显(P<0.001);陈旧梗塞区仍能见到凋亡细胞，较急性区域明显减少(P<0.001)；在梗塞组正常区域及对照组偶见有凋亡细胞，2组间无显著差异。在人类心肌梗塞的细胞学检测中发现有大量的凋亡细胞，为认识心血管疾病展示了新的视野。
细胞凋亡(Apoptosis)是一种与坏死截然不同的死亡方式，这是一种经基因精密调控的程序化细胞死亡(Programmed cell death)[1]。以往的研究认为细胞凋亡不发生在终末分化的心肌细胞和神经元细胞中。直到90年代初，由于凋亡的分子生物学方面的进展及实验手段的提高，人们在多种心血管疾病及正常老年心脏中发现了细胞凋亡的证据[2，3]，并开展了心肌细胞凋亡及相关基因的研究，但目前国内在此方面的报道较少。为此，我们将我院1986年至1997年36例尸检标本进行回顾性研究，以探索人类心肌梗塞与心肌细胞凋亡的关系，对人类最终控制心血管疾病提供理论依据和防治措施。
, 百拇医药
材料和方法
1.资料来源 36例心肌标本取自同仁医院1986年至1997年尸检标本。急性心肌梗塞病人22例，其中10例伴有陈旧心梗。临床上均有急慢性心肌梗塞病史，组织学有急慢性心肌梗塞的病理改变。对照组14例是临床无心血管疾病依据，(死于消化道出血，车祸，中毒性肺炎等)，病理无心肌缺血表现的心肌标本。
2.方法 凋亡细胞检测选用末端标记TUNEL法，TUNEL试剂盒购自美国Boehringer Mannheim公司，具体按照试剂盒内说明书操作，以Tris-HCL缓冲液替代生物素标记末端转移酶的切片同时染色作为阴性对照。Bcl-2和Bax检测应用生物素-链酶亲和标记蛋白显色法，Bax兔IgG多抗，Bcl-2鼠抗人单克隆抗体，生物素化山羊抗兔(IgF-Bio)二抗及辣根酶标记链霉卵白素(S-A/HRP)等试剂购自美国Zymed公司。具体操作如下：切片脱蜡至水，3% H2O2浸泡15min，滴加5%的正常大鼠血清封闭10min，吸干血清，滴加一抗，4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素孵育60min，DAB显色，苏木素复染。以Tris-HCL缓冲液替代一抗的切片同时染色作为阴性对照。所有标本同时切片行常规HE染色。
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3.评定方法 TUNEL染色，阳性细胞核为棕黄色；Bcl-2和Bax染色，阳性细胞浆为棕黄色。选取相应部位，细胞计数在200倍高倍视野下，用标准的10×10目镜栏珊计数，共计数10个视野；结果以阳性细胞数占细胞总数的平均百分比表示。
4.统计分析 本研究所有数据均用SPSS软件进行统计学处理。数据以均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验。
结 果
1. HE染色 (1)急性梗塞区域 早期损伤的心肌仍保存细胞轮廓，细胞核固缩，肌浆凝聚；胞浆嗜酸性增强，横纹不清或消失收缩带形成；进一步发生凝固性坏死。凝固性坏死的心肌细胞位于梗塞中心区，梗塞间质有出血和炎性细胞浸润(图1)。(2)陈旧梗塞区 心肌纤维消失代之以瘢痕组织形成(图2)。(3)对照组 观察左心室，均为正常的组织学形态，无出血坏死和炎症表现。所有标本未见有典型凋亡小体。
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图1 急性心梗组织胞浆嗜酸性增强，可见凝固性坏死及炎性细胞浸润HE×100
图2 陈旧心梗组织可见局部瘢痕形成HE×100
2.TUNEL染色 (1)与HE相对应的急性梗塞区梗塞周边区均有较多细胞核呈棕色凋亡细胞，较对照组明显增多(P<0.001)，以周边部增多最为显著，与梗塞中心区相比P<0.001。(2)陈旧梗塞区可见有散在的凋亡细胞，较急性区域明显减少(P<0.001)。(3)远离梗塞区及对照组的心肌组织中极偶见凋亡细胞。对照组的凋亡细胞数量与远离梗塞灶的正常区域的心肌组织无差异(P=0.698)见图3～图7，表1。
表1 凋亡细胞在心梗各区域及对照组中的分布
急性
, 百拇医药
梗塞区
A
急性
周边区
B
陈旧
梗塞区
C
梗塞组
正常区
D
对照组
E
均 数
, 百拇医药
标准差
标准误
19.37
7.94
1.69
36.27
14.44
3.08
4.72
1.82
0.67
3.52
1.99
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0.42
3.22
2.15
0.83
图3 急性心梗组织可见较多凋亡
细胞 TUNEL染色×200
图4 陈旧心梗组织凋亡细胞散在
分布 TUNEL染色×200
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图5 Bcl-2阳性细胞呈散在
分布 Bcl-2染色×100
图6 Bax阳性细胞呈散在分布 Bax染色×100
图7 凋亡细胞在各组分布
3.Bcl-2和Bax染色 (1)急性梗塞区及周边区域Bcl-2表达增加(20/22)；Bax的表达亦增加(21/22)(图5)。(2)陈旧梗塞区域Bcl-2偶见(1/10)，而瘢痕区未见Bcl-2的表达；陈旧梗塞区域仍可见Bax有较多表达(图6)。(3)正常对照组及梗塞组正常区域极偶见Bcl-2的表达；Bax的表达较前2组减少。
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表2 Bcl-2和Bax在心梗各组及对照组中的分布
急性梗塞区
陈旧梗塞区
梗塞组正常区
对照组
Bcl-2表达
Bax表达
91.1%(20/22)
95.4%(21/22)
20.0%(2/10)
33.3%(3/10)
9.1%(2/22)
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13.6%(3/22)
7.0%(1/14)
21.1%(3/14)
讨 论
程序化细胞死亡-细胞凋亡存在于各组织细胞中，对细胞的正常分化，成熟和发育具有重要的平衡意义。然而，细胞凋亡异常又会带来严重危害。在终末期分化的心肌细胞中，细胞凋亡的研究起步较晚。1993年，人们在ARVD(先天右室发育不良)的病人心肌上发现了细胞凋亡的证据[4]，它提示在人类心脏上亦存在有细胞凋亡。
Saraste等[5]用TUNEL和琼脂糖免疫凝胶电泳的方法对8例死于急性心肌梗塞的病人心肌标本进行研究，其中6例是生前接受了成功溶栓的组织标本，结果显示各标本均可见到典型的凋亡生化特征。心肌细胞凋亡在心肌梗塞的周边部(border zones)最为明显。本实验与Saraste等结果相一致，在急性心梗时，在急性梗塞中心部及其周边部可检测到较多凋亡细胞，以梗塞周边部最为显著，在陈旧梗塞区域仍能见到凋亡细胞。推测在心肌细胞发生缺血损伤时首先启动了凋亡机制，随着损伤加重和时间的延长，缺血中心区域便出现坏死，而梗塞周边的心肌细胞处于可逆的损伤状态，在这一区域的细胞死亡仍以凋亡为主。一些实验显示心室壁重构现象，存活的心肌细胞肥大及毛细血管增生减少在邻近梗塞区域更为明显[6]，提示心肌细胞凋亡使心梗后结构和功能的恢复受到限制。周边部心肌细胞凋亡使梗塞周围的心肌细胞继续死亡。可见心肌细胞凋亡在心梗预后中起着重要的作用。另外，在陈旧梗塞区域见到细胞凋亡，证实细胞凋亡可长期存在于梗塞周边部，在较长时间内可因细胞凋亡使心肌细胞丢失。
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本实验中未发现有凋亡小体，可能存在下列原因：1.细胞凋亡后凋亡小体迅速被巨噬细胞吞噬，这种过程较短暂，不易被观察到。2.由于邻近坏死细胞激活了炎性细胞而改变了细胞凋亡的进程。炎性细胞的浸润和激活可能使凋亡转化为坏死，即凋亡和坏死可能有共同途径。3.可能在心肌细胞中只要部分凋亡途径被激活。染色质固缩和DNA片段化可在心肌组织中观察到[7]，而形成凋亡小体的必要因素在心肌组织中缺失。但要发现凋亡小体缺失的确切原因，需进行系统细致的研究。
原癌基因Bcl-2是目前公认的促进细胞生存抑制细胞凋亡的长寿基因[8]。正常情况下，Bcl-2在心肌中不表达，Bax仅有弱表达。在本实验中在急性梗塞区域可见有Bcl-2表达增加，而陈旧梗塞区仅有弱表达。推测Bcl-2的表达挽救了心梗早期阶段的存活细胞。在心肌细胞受到缺血损伤时，Bcl-2立即启动，其基因产物的表达可抑制或逆转细胞凋亡的发生，与此同时Bax与Bcl-2平行增高，Bcl-2和Bax的相互作用决定了细胞是否继续存活[9]。Bcl-2抑制细胞凋亡的机制尚不十分清楚，可能与抗氧化途径，阻止细胞内钙重新分布，直接或间接影响其他死亡信号对细胞的作用，以及加速DNA的修复来起作用。Bax是与Bcl-2同处一家族的成员之一，可通过与Bcl-2形成异源二聚体，从而抑制了Bcl-2的作用。
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目前心血管疾病已成为威胁人类生命的重要病因，心肌梗塞的发病率亦呈上升趋势。在人类急性心肌梗塞中细胞凋亡及其标志物的发现拓展了心肌梗塞的发病机理。细胞凋亡是一个复杂的过程，是有动态发展的特点，如能寻求控制心肌细胞凋亡的机制，对心脏病患者的诊断及治疗有重要意义。
参考文献
1，Kerr,JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239～257.
2，Richardo HB,Hailey LS,Xie SS,et al.In situ apoptosis assay for the detection of early acute myocardial infarction.American J of Pathol,1996,149:821～829.
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3，Narula J,Haider N,Virmani R,et al.Apoptosis in cardiomcytes in end-stage heart failure.N Engl J Med,1996,335:1181～1189.
4，Mallat Z,Tedgui A,Fontaliran F,et al.Evidence of apoptosis in arrhythmogenic right ventricular dysplasia.The New England Journal of Medicine,1996,335(16):1190～1201.
5，Saraste A,Pulkki K,Kallagoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction.Circulation,1997,95:320～323.
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6，Anversa P,Oliveiti G,Meggs LG,et al.Cardiac anatomy and ventricular loading after myocardial infaract.Circulation,1993,87:22～27.
7，Gottlieb EA,Burleson KA,Kloner RA,et al.Reperfusion injury induces apoptosis in myocardium of cardiomyocytes.J Clin Invest,1994,94:1621～1929.
8，Cleary MY,Sklar J.Nrcleotide sequence of t(14∶18)chromosal breakpoint in follicular lymphoma and demostration of breakpoint-cluster region near a transcriptionally active locus on chromosome 18.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:7439～7443.
9，Olitvai ZN,Milliman CL,Korsmeyer SJ.Bcl-2 hetermodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerate programmed cell death.Cell,1993,74:609～619.
收稿日期：1999-08-01
修回日期：1999-10-17, 百拇医药