缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的效应
作者：王关嵩 钱桂生 陈维中
单位：第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所 400037
关键词：缺氧；肌，平滑；增殖
心肺血管病杂志000224
摘要 本实验应用免疫组织化学染色，3H-TdR掺入，流式细胞仪检测技术探讨缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PSMC)增殖的影响。结果：缺氧12 h其增殖细胞核抗原(PCNA)阳性反应颗粒增加，24 h明显增加，其含量是常氧组2.1倍；低氧8 h可使PSMC的3H-TdR摄取量减少(P<0.05)，12 h则促进其摄取，24 h则明显较常氧对照组增多(P<0.05)；流式细胞仪检测显示其G2/M期细胞比例明显增多(P<0.01)，G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.01)，细胞内总蛋白含量有所降低(P<0.01)。说明，缺氧早期抑制或损害PSMC增殖，而后促使PSMC的表型改变，出现增殖，从一侧面证实缺氧可以直接促进PSMC增生。
, 百拇医药
Effects of Hypoxia on Rat Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cell
Wang Guansong,Qian Guisheng,Chen Weizhong
(Institute of Respiratory Disease,Xinqiao Hospital,Third Military Medical College,Chongqing 400037)
Abstract The effects of hypoxia on rat pulmonary arterial smooth muscle cell (PSMC) proliferation were investigated by using immunocytochemical analysis.3H-TdR incorpotation and other ways.The results showed that immunocytochemical reaction of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in PSMC under hypoxia condition was stronger than under normoxia condition;PSMC 3H-TdR incorporation was decreased at the end of 8 h(P<0.05),then increased at the end of 12 h,significantly increased in 24 h(P<0.05);Flow cytometric DNA analysis revealed that hypoxia induced significant enhancement of G2/M phase of PSMC,decreased of G0/G1 phase of PSMC (P<0.01),and decreased of the protein contents in the PSMC.It suggest that PSMC proliferation may be hrslty inhibited and then stimulated by hypoxia and phehotype change may be induced.
, 百拇医药
Key words:Hypoxia;Muscle, smooth; Proliferation
慢性阻塞性肺病(COPD)发展的一个重要病理进程，就是肺血管结构改建，表现为肺动脉平滑肌细胞(PSMC)异常的增生肥大，导致血管中膜增厚，血管肌化，成纤维细胞增殖等变化。这个变化过程在体内比较复杂，各种病因作用于机体最终导致缺氧，其它细胞(如内皮细胞，成纤维细胞)的变化因素，以及神经激素等因素，难以探明血管改建的机制。本实验通过培养PSMC来进行缺氧处理，可从细胞水平上探明缺氧在COPD中的作用。
材料和方法
1.PSMC的培养 采用贴块法[1]。
2.增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫组织化学染色及测定 将PSMC接种于24孔培养板内的小玻片上(玻片面积相等)，生长成单层后换1%小牛血清的M199培养液再培养24 h后，分常氧和缺氧(1%) 24 h组，各取6孔玻片，应用S-P法进行PCNA免疫组化染色，以棕黄色为阳性。最后用真彩色医学图像分析系统测其积分光密度(IOD)值，作为PCNA的相对含量。结果采用t检测。
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3.3H-胸苷嘧啶(3H-TdR)摄取量的检测 按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，长成层后换为1%小牛血清的M199培养液再培养24 h，分常氧和低氧组(6 h,12 h,18 h,24 h)，n=8，最后6 h加入3H-TdR(1.25 μci/ml)用β-液体闪烁计数仪(Back β LKB-1217，芬兰)测dpm，间接推定3H-TdR量。结果作单因素方差分析，FLSD显著性检测。
4.细胞周期和细胞总蛋白的测定 分常氧、低氧12 h、24 h、48 h组，用流式细胞仪(FACstar,Becton dickinson公司，USA)480 nm的红色荧光测定细胞周期DNA含量。用FITC染色后用绿色荧光测蛋白质含量。结果采用总体率假设检验。
5.相关试剂 M199培养基(Gibco,USA),PCNA单克隆抗体和S-P免疫组织化学染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，3H-TdR(中国原子能科学研究院同位素研究所)
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6.统计学意义 P<0.05为相差有显著意义，P<0.01为相差有非常显著的意义。
结 果
1.缺氧对PSMC PCNA的作用 常氧24 h组PSMC的PCNA免疫组织化学染色，其细胞核内没有明显的阳性反应颗粒。缺氧12 h、24 h组PSMC的细胞核内PCNA染色为阳性和强阳性，可见密集的阳性反应颗粒，阳性反应的细胞数占该细胞总数的百分比为42%和67%。图象分析表明缺氧12 h、24 h组阳性染色积分光密度值为常氧组的1.9倍和2.6倍。
表1 免疫组化分析PSMC的PCNA含量情况 组别
细胞数量
IOD(
±s)
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24 h 21%O2
152
2.46±0.18
12 h 1%O2
204
4.39±0.22*
24 h 1%O2
257
6.44±0.20**
注：* P<0.05 ** P<0.01 vs 21%O2组
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2.缺氧对PSMC摄取3H-TdR的作用
缺氧8 h可见抑制PSMC摄取3H-TdR，12 h以后促进PSMC摄取，24 h时PSMC的摄取量明显增加，见表2。表2 低氧对3H-TdR PSMC掺入量的影响 分组
8 h
12 h
18 h
24 h
21%O2
10100
9200
, http://www.100md.com 9400
9960
1%O2
8100*
9350
11100
11850**
注：* P<0.05 ** P<0.01 vs 21%O2组
3.缺氧对PSMC细胞周期及细胞总蛋白含量的作用 流式细胞仪检测显示，缺氧12 h、24 h、48 h,均能使G2/M期的细胞比例显著增加P<0.01，使G0/G1期的细胞比例显著降低P<0.01；缺氧可使PSMC的总蛋白含量下降P<0.01，见表3。表3 低氧对PSMC细胞周期和蛋白含量的影响(%) 分组
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G0/G1
S
G2/M
蛋白含量
21%O224 h
67.35
18.37
14.28
89.85
1%O212 h
46.92**
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19.21*
33.87**
39.94**
1%O224 h
43.33**
13.35**
43.32**
52.51
1%O248 h
45.62**
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14.52**
40.46**
49.43
注：* P<0.05 ** P<0.01 vs 21%O224 h组讨 论
我们把缺氧组和正常组先放在1%小牛血清的培养液里培养24 h，使细胞耗尽血清中血小板源生长因子等生长因子，处于相对静止生长状态，此时检测PCNA基本上没有阳性反应颗粒。其后开始缺氧处理，可见PSMC的PCNA的表达明显升高。而PCNA是33-36KD分子量的核蛋白，可作为delta的DNA多聚酶辅助因子发挥作用，直接参与DNA的合成，是评价细胞增殖状态的常用重要指标。缺氧12 h和24 h均可促进PSMC的增生。其在大部分G0/G1期细胞中不表达，G1晚期增多，S期达高峰，G2/M期下降，与DNA合成变化一致[2]。
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实验结果还表明，缺氧时PSMC的摄取3H-TdR量先降低，而后增加，至24 h时明显高于常氧组。流式细胞仪检测到常氧条件下，PSMC中G0/G1期细胞为主，占67.35%；S期和G2/M期各占16.37%和12.85%，合计占细胞总数的1/3。缺氧能使G2/M期细胞明显增多，增加为常氧组数量的近4倍，细胞数与G0/G1期几乎相等，48 h时G2/M期细胞数降低，但仍明显高于正常组。造成这种现象的原因可能是缺氧对细胞除了促增生效应外，尚有其它的损害作用，有待深入探讨；此外，培养液积聚了大量细胞代谢有害成分，也影响细胞的生长。至于PSMC细胞总蛋白含量下降，可能是缺氧主要刺激PSMC DNA合成增加和有丝分裂活动加强，所以造成新分裂的细胞蛋白质含量较低。这些结果与罗兰等发现缺氧能直接刺激牛PSMC增殖[3]一致。不支持Dempsy[4]的结论，即PKC激活的PSMC才能直接感受缺氧。
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鉴于上述实验结果，我们推测对重症COPD患者进行氧疗和NO吸入都是有价值的。氧疗可以补充氧气，减轻缺氧以及对PSMC损害程度和反应，缓解病情；吸入NO除了可以直接使肺血管舒张，还可抑制PSMC的增殖缓解缺氧引起的症状[5]。
国家自然科学基金资助项目(No.39700057)
参考文献
1，王关嵩，杨晓静，钱桂生，等.大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨.第三军医大学学报，1998，20(4)：348～350.
2，Bravo R,Macdonald-Bravo H.Existence of two population of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle.J Cell Biol,1987,105(4):1549～1554.
, 百拇医药
3，罗兰，蔡英年，李世强，等.缺氧对新生小牛肺血管平滑肌细胞增殖的影响及764-3的抑制作用.中国应用生理学杂志，1997，9(3)：205～209.
4，Dempsey EC,Mcmurtry IF,O'Brien RF.Protein Kinase C activation allows pulmonary artery smooth muscle cells to proliferation to hypoxia.Am J Physiol,1991,260(4):L136～L145.
5，Hayward CS,Rogers P,Keogh AM,et al.Inhaled nitric oxide in cardiac failure:vascular versus ventricular effects.J Cardiovas Pharmacol,1996,27(1):80～85.
收稿日期：1999-02-10
修回日期：1999-03-17, http://www.100md.com
单位：第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所 400037
关键词：缺氧；肌，平滑；增殖
心肺血管病杂志000224
摘要 本实验应用免疫组织化学染色，3H-TdR掺入，流式细胞仪检测技术探讨缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PSMC)增殖的影响。结果：缺氧12 h其增殖细胞核抗原(PCNA)阳性反应颗粒增加，24 h明显增加，其含量是常氧组2.1倍；低氧8 h可使PSMC的3H-TdR摄取量减少(P<0.05)，12 h则促进其摄取，24 h则明显较常氧对照组增多(P<0.05)；流式细胞仪检测显示其G2/M期细胞比例明显增多(P<0.01)，G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.01)，细胞内总蛋白含量有所降低(P<0.01)。说明，缺氧早期抑制或损害PSMC增殖，而后促使PSMC的表型改变，出现增殖，从一侧面证实缺氧可以直接促进PSMC增生。
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Effects of Hypoxia on Rat Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cell
Wang Guansong,Qian Guisheng,Chen Weizhong
(Institute of Respiratory Disease,Xinqiao Hospital,Third Military Medical College,Chongqing 400037)
Abstract The effects of hypoxia on rat pulmonary arterial smooth muscle cell (PSMC) proliferation were investigated by using immunocytochemical analysis.3H-TdR incorpotation and other ways.The results showed that immunocytochemical reaction of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in PSMC under hypoxia condition was stronger than under normoxia condition;PSMC 3H-TdR incorporation was decreased at the end of 8 h(P<0.05),then increased at the end of 12 h,significantly increased in 24 h(P<0.05);Flow cytometric DNA analysis revealed that hypoxia induced significant enhancement of G2/M phase of PSMC,decreased of G0/G1 phase of PSMC (P<0.01),and decreased of the protein contents in the PSMC.It suggest that PSMC proliferation may be hrslty inhibited and then stimulated by hypoxia and phehotype change may be induced.
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Key words:Hypoxia;Muscle, smooth; Proliferation
慢性阻塞性肺病(COPD)发展的一个重要病理进程，就是肺血管结构改建，表现为肺动脉平滑肌细胞(PSMC)异常的增生肥大，导致血管中膜增厚，血管肌化，成纤维细胞增殖等变化。这个变化过程在体内比较复杂，各种病因作用于机体最终导致缺氧，其它细胞(如内皮细胞，成纤维细胞)的变化因素，以及神经激素等因素，难以探明血管改建的机制。本实验通过培养PSMC来进行缺氧处理，可从细胞水平上探明缺氧在COPD中的作用。
材料和方法
1.PSMC的培养 采用贴块法[1]。
2.增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫组织化学染色及测定 将PSMC接种于24孔培养板内的小玻片上(玻片面积相等)，生长成单层后换1%小牛血清的M199培养液再培养24 h后，分常氧和缺氧(1%) 24 h组，各取6孔玻片，应用S-P法进行PCNA免疫组化染色，以棕黄色为阳性。最后用真彩色医学图像分析系统测其积分光密度(IOD)值，作为PCNA的相对含量。结果采用t检测。
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3.3H-胸苷嘧啶(3H-TdR)摄取量的检测 按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板，长成层后换为1%小牛血清的M199培养液再培养24 h，分常氧和低氧组(6 h,12 h,18 h,24 h)，n=8，最后6 h加入3H-TdR(1.25 μci/ml)用β-液体闪烁计数仪(Back β LKB-1217，芬兰)测dpm，间接推定3H-TdR量。结果作单因素方差分析，FLSD显著性检测。
4.细胞周期和细胞总蛋白的测定 分常氧、低氧12 h、24 h、48 h组，用流式细胞仪(FACstar,Becton dickinson公司，USA)480 nm的红色荧光测定细胞周期DNA含量。用FITC染色后用绿色荧光测蛋白质含量。结果采用总体率假设检验。
5.相关试剂 M199培养基(Gibco,USA),PCNA单克隆抗体和S-P免疫组织化学染色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，3H-TdR(中国原子能科学研究院同位素研究所)
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6.统计学意义 P<0.05为相差有显著意义，P<0.01为相差有非常显著的意义。
结 果
1.缺氧对PSMC PCNA的作用 常氧24 h组PSMC的PCNA免疫组织化学染色，其细胞核内没有明显的阳性反应颗粒。缺氧12 h、24 h组PSMC的细胞核内PCNA染色为阳性和强阳性，可见密集的阳性反应颗粒，阳性反应的细胞数占该细胞总数的百分比为42%和67%。图象分析表明缺氧12 h、24 h组阳性染色积分光密度值为常氧组的1.9倍和2.6倍。
表1 免疫组化分析PSMC的PCNA含量情况 组别
细胞数量
IOD(
±s), http://www.100md.com
24 h 21%O2
152
2.46±0.18
12 h 1%O2
204
4.39±0.22*
24 h 1%O2
257
6.44±0.20**
注：* P<0.05 ** P<0.01 vs 21%O2组
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2.缺氧对PSMC摄取3H-TdR的作用
缺氧8 h可见抑制PSMC摄取3H-TdR，12 h以后促进PSMC摄取，24 h时PSMC的摄取量明显增加，见表2。表2 低氧对3H-TdR PSMC掺入量的影响 分组
8 h
12 h
18 h
24 h
21%O2
10100
9200
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9960
1%O2
8100*
9350
11100
11850**
注：* P<0.05 ** P<0.01 vs 21%O2组
3.缺氧对PSMC细胞周期及细胞总蛋白含量的作用 流式细胞仪检测显示，缺氧12 h、24 h、48 h,均能使G2/M期的细胞比例显著增加P<0.01，使G0/G1期的细胞比例显著降低P<0.01；缺氧可使PSMC的总蛋白含量下降P<0.01，见表3。表3 低氧对PSMC细胞周期和蛋白含量的影响(%) 分组
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G0/G1
S
G2/M
蛋白含量
21%O224 h
67.35
18.37
14.28
89.85
1%O212 h
46.92**
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19.21*
33.87**
39.94**
1%O224 h
43.33**
13.35**
43.32**
52.51
1%O248 h
45.62**
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14.52**
40.46**
49.43
注：* P<0.05 ** P<0.01 vs 21%O224 h组讨 论
我们把缺氧组和正常组先放在1%小牛血清的培养液里培养24 h，使细胞耗尽血清中血小板源生长因子等生长因子，处于相对静止生长状态，此时检测PCNA基本上没有阳性反应颗粒。其后开始缺氧处理，可见PSMC的PCNA的表达明显升高。而PCNA是33-36KD分子量的核蛋白，可作为delta的DNA多聚酶辅助因子发挥作用，直接参与DNA的合成，是评价细胞增殖状态的常用重要指标。缺氧12 h和24 h均可促进PSMC的增生。其在大部分G0/G1期细胞中不表达，G1晚期增多，S期达高峰，G2/M期下降，与DNA合成变化一致[2]。
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实验结果还表明，缺氧时PSMC的摄取3H-TdR量先降低，而后增加，至24 h时明显高于常氧组。流式细胞仪检测到常氧条件下，PSMC中G0/G1期细胞为主，占67.35%；S期和G2/M期各占16.37%和12.85%，合计占细胞总数的1/3。缺氧能使G2/M期细胞明显增多，增加为常氧组数量的近4倍，细胞数与G0/G1期几乎相等，48 h时G2/M期细胞数降低，但仍明显高于正常组。造成这种现象的原因可能是缺氧对细胞除了促增生效应外，尚有其它的损害作用，有待深入探讨；此外，培养液积聚了大量细胞代谢有害成分，也影响细胞的生长。至于PSMC细胞总蛋白含量下降，可能是缺氧主要刺激PSMC DNA合成增加和有丝分裂活动加强，所以造成新分裂的细胞蛋白质含量较低。这些结果与罗兰等发现缺氧能直接刺激牛PSMC增殖[3]一致。不支持Dempsy[4]的结论，即PKC激活的PSMC才能直接感受缺氧。
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鉴于上述实验结果，我们推测对重症COPD患者进行氧疗和NO吸入都是有价值的。氧疗可以补充氧气，减轻缺氧以及对PSMC损害程度和反应，缓解病情；吸入NO除了可以直接使肺血管舒张，还可抑制PSMC的增殖缓解缺氧引起的症状[5]。
国家自然科学基金资助项目(No.39700057)
参考文献
1，王关嵩，杨晓静，钱桂生，等.大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨.第三军医大学学报，1998，20(4)：348～350.
2，Bravo R,Macdonald-Bravo H.Existence of two population of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle.J Cell Biol,1987,105(4):1549～1554.
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3，罗兰，蔡英年，李世强，等.缺氧对新生小牛肺血管平滑肌细胞增殖的影响及764-3的抑制作用.中国应用生理学杂志，1997，9(3)：205～209.
4，Dempsey EC,Mcmurtry IF,O'Brien RF.Protein Kinase C activation allows pulmonary artery smooth muscle cells to proliferation to hypoxia.Am J Physiol,1991,260(4):L136～L145.
5，Hayward CS,Rogers P,Keogh AM,et al.Inhaled nitric oxide in cardiac failure:vascular versus ventricular effects.J Cardiovas Pharmacol,1996,27(1):80～85.
收稿日期：1999-02-10
修回日期：1999-03-17, http://www.100md.com