高血压患者外周血淋巴细胞中P53蛋白的表达
作者：魏玲 张崇德 杨举伦 刘大容 杨丽霞 江玲 齐峰 郭传明 骆加拉 张立权 李卿
单位：成都军区昆明总医院心内科 650032
关键词：高血压；P53蛋白；左室肥厚
高血压杂志/990121 目的 高血压、动脉粥样硬化、 心肌肥大等心血管病大都是以细胞增生为主要特征的疾病, 近年实验研究表明此过程与某些癌基因的表达紧密相关。方法 本实验对50例高血压患者及正常对照组用SP法测定其外周血涂片淋巴细胞中P53蛋白的表达。结果 发现高血压组阳性35例(70%)，正常组阳性37例(14%)(P<0.01)。高血压组阳性细胞率为59.9%±24.4%显著高于正常组的22.8%±15.2%(P<0.01)。结论 高血压患者存在P53蛋白基因的突变。相关分析显示P53蛋白阳性细胞率与室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)呈正相关(r值分别为0.48、0.66)。
, 百拇医药
Expression of P53 Protein in Lymphocyte in Hypertensive Patients
WEI Ling, ZHANG chongde, YANG Julun, et al.
(Department of Cardiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area, Kunming)
ABSTRACT Aim To deteremine the alteration and its significance of the expression of P53 protein in lymphocyte in patients of essential hypertension. Methods IVST and LVPWT were measured in patients with echocardiography. P53 protein expression was determined by immunohistochemical method. Results Positive P53 expressions were found in both hypertension group(70%) and control group(14%)(P<0.01), and the positive cell incidence of P53 protein was 59.9% in 50 hypertensive patients and 22.8% in normal persons(P<0.01). The correlation analysis showed that IVST and LVPWT correlated positively to the positive cell incedence of P53 protein. Conclusion These data suggested that the expression of P53 protein may be associated the development of left ventricle hypertrophy in hypertensive patients.
, 百拇医药
KEY WORDS hypertension; P53 gene; Left ventricular hypertrophy
P53是一种重要的抑癌的基因， 对细胞的生长起负性调节作用。近年来研究认为P53基因的突变参与心血管疾病的病理过程[1]。本实验运用免疫组织化学方法研究P53蛋白在高血压患者外周血涂片淋巴细胞中的表达，并初步探讨P53蛋白表达与左室肥厚的关系。
MATERIALS AND METHODS
1 对象
1.1 高血压组：为1996.5～1997.8 住我院心内科确诊为高血压病的患者50例(WHO诊断标准)。全部病例均经病史、体检、胸片、B超及超声心动图等检查排除继发性高血压及其他心血管疾病。平均年龄59.6±11.53岁，其中男性26例，女性24例。
, 百拇医药
1.2 正常对照组 经病史、体检、胸片、 心电图和B超等检查无高血压及其他疾病的正常人50例。平均年龄52.8±11.08岁， 其中男性25例，女性25例。
2 方法
2.1 超声心动图检查使用Mark 600超声心动图仪、探头频率 3.0 MHz，专人操作。患者平卧，取胸骨旁长轴观、在二维超声的指导下，使声速垂直于室间隔及左室后壁，固定理想图像后，以M超取样， 测量室间隔及左室后壁厚度。
2.2 标本采集：受试者晨起采外周血约0.5 ml，涂片，在空气中干燥约5分钟后置于-20℃冰箱保存待检。
2.3 免疫组织化染色：采用Maxim公司的SP免疫组化染色试剂盒及相应染色方法(Maxim Immunostain SP Kit)。P53单克隆抗体DO-1为Santa Cruz Biotechnology, Inc。产品为鼠骨髓瘤细胞与鼠脾细胞的融合细胞产生的IgG2α单克隆抗体，与野生型和突变型P53蛋白均能发生反应。详细方法见试剂盒说明书。以淋巴细胞核被染为棕黄色，胞浆、红细胞及背景不着色为阳性。结果分析采用半定量法，在×10倍(olympus)光镜下随机寻找50个淋巴细胞， 计数其中阳性细胞数，然后计算出阳性细胞百分率。
, 百拇医药
2.4 统计学处理：所有参数均以均数±标准差(
±s)表示，并进行组间的t检验，χ2检验及相关分析。以P<0.05为有统计学意义。
RESULTS
1 P53蛋白表达 50例高血压患者,35例(70%)阳性，15例(30%)阴性。50例正常对照组，7例(14%)阳性，43例(86%)阴性。 两者比较差异有显著(P<0.01)(表1)。P53蛋白阳性者，按半定量法计算阳性细胞率(%)，高血压组为59.9%±24.4%，正常对照组为22.8±15.2%。 两者比较差异有显著性(P<0.01)(Tab 2)。P53蛋白阳性物质在高血压组及正常组均位于细胞核，胞浆不着色(Fig 1)。
Tab 1 P53 protein expressed in lymphocyte of hypertensive patients
, http://www.100md.com
n
P53 protein+
P53 protein-
HP group
50
35(70%)*
15(30%)
Normal
50
7(14%)
43(86%)
, 百拇医药 *:P<0.01 vs normalTab 2 Positve expressive rate of P53 protein in control and hypertensive
n
Cell of expressed P53 protien(%)
HP group
50
59.9±24.4*
Normal
50
22.8±15.2
*:P<0.01 vs normalTab 3 Positve expressive rate of P53 protein in LVH group and NLVH group
, 百拇医药
n
Cell of expressed P53 protien(%)
LVH
23
65.88±14.08*
NLVH
16
50.78±10.65
*:P<0.01 vs NLVH group
2 高血压患者P53蛋白阳性细胞率与左室厚度的相关分析 高血压患者P53蛋白阳性者有超声记录的39例，室间隔厚度12.89±3.3 mm，左室后壁厚度12.21±1.9 mm。分别与P 53蛋白阳性细胞率进行相关分析，r值分别为0.48(P<0.05)及0.66(P<0.01)。 按有无室间隔增厚或和左室后壁增厚分为左室肥厚组(LVH)及无左室肥厚组(NLVH)， 发现LVH组外周血淋巴细胞中P53蛋白表达的阳性细胞率显著高于NLVH组，(P<0.01)。(见Tab 3)
, 百拇医药
DISCUSSION
高血压、动脉粥样硬化等心血管病大都是以细胞增生为主要特征的疾病。近年来人们发现许多心血管病与癌基因有密切关系，其中认为抑癌基因P53的表达不足或变异可能参与了心血管疾病的病理过程[1～3]。本实验研究了高血压患者外周血淋巴细胞中P53蛋白的表达。结果表明50例高血压患者外周血淋巴细胞中，有35例P 53蛋白呈阳性表达，阳性率70%。50例正常对照组中7例P53呈阳性表达， 阳性率为14%，两者比较有统计学差异(P<0.01)。按半定量法计算P53蛋白表达的阳性细胞率(%)，高血压组为59.9±24.4%，正常对照组为22.8±15.2%，两者比较差异有显著性(P<0.01)，说明高血压患者及正常人的外周血淋巴细胞均可存在P53蛋白的阳性表达， 但高血压组阳性率及阳性细胞率显著高于正常对照组。
野生型P53是目前唯一研究较明确的， 定位于细胞核内的抑制细胞增殖的抑癌基因。它位于人类第17号染色体短臂上，约20 kb的 DNA区域中，编码着一个由393个氨基酸组成、分子量为53 kD的核磷蛋白，对细胞增殖起负性调节作用。在正常组织细胞内P53蛋白产物的半衰期很短,导致其蛋白产物含量低,应用免疫组化方法不易测出。当P53基因突变(突变型P53),蛋白构型发生改变, 其负性调节细胞增殖作用消失,半衰期明显延长,P53蛋白就可以在细胞核中检测出来[4,5]。故一般用免疫组化所检测到的P53蛋白均为突变型P53。本组实验高血压组外周血淋巴细胞核中检测到的P53蛋白,其阳性细胞率较高，认为与P53基因突变、蛋白构型发生改变有关。 此结果与以往的研究报道类似[1,5]说明高血压病发病过程中存在P53基因的突变。而正常对照组外周血淋巴细胞核中也有P53蛋白阳性表达,此结果与以往报导结果不附合[5,6]。 其可能的原因是本实验研究检测的是外周血淋巴细胞核中的P53蛋白。从采血、涂片、干燥,到送入-20℃冰箱保存,全过程只需10分钟左右。而正常P53蛋白(野生型)的半衰期为20分钟左右[1]。因此本实验所用的P53单克隆抗体就可以与野生型P53蛋白结合，而显示阳性结果，但其含量较低，因此阳性率及阳性细胞率均较底。故正常对照组外周血淋巴细胞核中测到的P53蛋白可能是野生型的P53。
, http://www.100md.com
高血压左室肥厚是高血压病最常见的靶器管损害，也是心血管疾病的独立危险因子。而心肌肥厚乃是心肌细胞的肥大和非心肌细胞的增殖，间质胶原增生的结果[7]。 近年来有研究表明左室肥厚是心肌组织尤其是成纤维细胞中C-myc表达持续增强的结果[8,9]。本实验初步探讨了高血压患者室壁厚度与P53蛋白表达的关系。经研究有左室肥厚者外周血淋巴细胞中P53蛋白阳性细胞表达率显著高于无左室肥厚者，相关分析显示P53蛋白的阳性细胞率与室间隔厚度及左室后壁厚度呈正相关。r值分别显0.48(P<0.05)、0.66(P<0.01)，提示P53蛋白的突变可能与左室肥厚有关。
结论：本研究表明正常人和高血压患者外周血淋巴细胞中均存在P53蛋白的表达，高血压组阳性率及阳性细胞率均显著高于对照组(P<0.01)。提示高血压患者外周血淋巴细胞中存在P53蛋白的阳性表达，P53蛋白的阳性细胞率与高血压患者的左室肥厚呈正相关。
REFERENCES
, http://www.100md.com
1 李志远.C-myc和P53基因在心血管病中的研究,心血管病学进展1996;17(3):158
2 汤 健,周爱儒. 原癌基因与心血管疾病 北京:北京医科大学和协北京协和医科大学联合出版社 1990:100
3 杨和平,汤 健. 癌基因与抗癌基因在心血管病中的作用 北京医科大学报 1993;25(2):90
4 Janice MN, Baker SJ, Preisinger AC, et al. Mutations in the P53 gene occur in diverse human tumour Nature 1989;342:705
5 王 禹,李天德,刘建伟,等. 中国成人动脉粥样硬化病变中P53抑癌基因的结构突变及与病变程度的关系 中华心血管病杂志 1997;25(3);184
, 百拇医药
6 Hollestein M, Sidransky D,Vogelstein B, et al. P53 mutations in human cancersScience1992;253:29
7 Simpson PC. Proto-oncogenes and cardiac hypertrophy Annu Rev Physiol 1988;51:189
8 Sadoshima J,Izumo S. Molecular charaterization of angiotensin Ⅱ induced hypertrophy of cardiac myocytes and hyperplasia of cardiac fibroblasts Circ Res 1993;73:413
9 苏津自,陈达光,吴可贵,等.原癌基因C-myc,c-fos在自发性高血压大鼠左心室的表达 高血压杂志 1997;5(1):9
收稿日期：1998-09-05, 百拇医药
单位：成都军区昆明总医院心内科 650032
关键词：高血压；P53蛋白；左室肥厚
高血压杂志/990121 目的 高血压、动脉粥样硬化、 心肌肥大等心血管病大都是以细胞增生为主要特征的疾病, 近年实验研究表明此过程与某些癌基因的表达紧密相关。方法 本实验对50例高血压患者及正常对照组用SP法测定其外周血涂片淋巴细胞中P53蛋白的表达。结果 发现高血压组阳性35例(70%)，正常组阳性37例(14%)(P<0.01)。高血压组阳性细胞率为59.9%±24.4%显著高于正常组的22.8%±15.2%(P<0.01)。结论 高血压患者存在P53蛋白基因的突变。相关分析显示P53蛋白阳性细胞率与室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)呈正相关(r值分别为0.48、0.66)。
, 百拇医药
Expression of P53 Protein in Lymphocyte in Hypertensive Patients
WEI Ling, ZHANG chongde, YANG Julun, et al.
(Department of Cardiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Area, Kunming)
ABSTRACT Aim To deteremine the alteration and its significance of the expression of P53 protein in lymphocyte in patients of essential hypertension. Methods IVST and LVPWT were measured in patients with echocardiography. P53 protein expression was determined by immunohistochemical method. Results Positive P53 expressions were found in both hypertension group(70%) and control group(14%)(P<0.01), and the positive cell incidence of P53 protein was 59.9% in 50 hypertensive patients and 22.8% in normal persons(P<0.01). The correlation analysis showed that IVST and LVPWT correlated positively to the positive cell incedence of P53 protein. Conclusion These data suggested that the expression of P53 protein may be associated the development of left ventricle hypertrophy in hypertensive patients.
, 百拇医药
KEY WORDS hypertension; P53 gene; Left ventricular hypertrophy
P53是一种重要的抑癌的基因， 对细胞的生长起负性调节作用。近年来研究认为P53基因的突变参与心血管疾病的病理过程[1]。本实验运用免疫组织化学方法研究P53蛋白在高血压患者外周血涂片淋巴细胞中的表达，并初步探讨P53蛋白表达与左室肥厚的关系。
MATERIALS AND METHODS
1 对象
1.1 高血压组：为1996.5～1997.8 住我院心内科确诊为高血压病的患者50例(WHO诊断标准)。全部病例均经病史、体检、胸片、B超及超声心动图等检查排除继发性高血压及其他心血管疾病。平均年龄59.6±11.53岁，其中男性26例，女性24例。
, 百拇医药
1.2 正常对照组 经病史、体检、胸片、 心电图和B超等检查无高血压及其他疾病的正常人50例。平均年龄52.8±11.08岁， 其中男性25例，女性25例。
2 方法
2.1 超声心动图检查使用Mark 600超声心动图仪、探头频率 3.0 MHz，专人操作。患者平卧，取胸骨旁长轴观、在二维超声的指导下，使声速垂直于室间隔及左室后壁，固定理想图像后，以M超取样， 测量室间隔及左室后壁厚度。
2.2 标本采集：受试者晨起采外周血约0.5 ml，涂片，在空气中干燥约5分钟后置于-20℃冰箱保存待检。
2.3 免疫组织化染色：采用Maxim公司的SP免疫组化染色试剂盒及相应染色方法(Maxim Immunostain SP Kit)。P53单克隆抗体DO-1为Santa Cruz Biotechnology, Inc。产品为鼠骨髓瘤细胞与鼠脾细胞的融合细胞产生的IgG2α单克隆抗体，与野生型和突变型P53蛋白均能发生反应。详细方法见试剂盒说明书。以淋巴细胞核被染为棕黄色，胞浆、红细胞及背景不着色为阳性。结果分析采用半定量法，在×10倍(olympus)光镜下随机寻找50个淋巴细胞， 计数其中阳性细胞数，然后计算出阳性细胞百分率。
, 百拇医药
2.4 统计学处理：所有参数均以均数±标准差(
±s)表示，并进行组间的t检验，χ2检验及相关分析。以P<0.05为有统计学意义。RESULTS
1 P53蛋白表达 50例高血压患者,35例(70%)阳性，15例(30%)阴性。50例正常对照组，7例(14%)阳性，43例(86%)阴性。 两者比较差异有显著(P<0.01)(表1)。P53蛋白阳性者，按半定量法计算阳性细胞率(%)，高血压组为59.9%±24.4%，正常对照组为22.8±15.2%。 两者比较差异有显著性(P<0.01)(Tab 2)。P53蛋白阳性物质在高血压组及正常组均位于细胞核，胞浆不着色(Fig 1)。
Tab 1 P53 protein expressed in lymphocyte of hypertensive patients
, http://www.100md.com
n
P53 protein+
P53 protein-
HP group
50
35(70%)*
15(30%)
Normal
50
7(14%)
43(86%)
, 百拇医药 *:P<0.01 vs normalTab 2 Positve expressive rate of P53 protein in control and hypertensive
n
Cell of expressed P53 protien(%)
HP group
50
59.9±24.4*
Normal
50
22.8±15.2
*:P<0.01 vs normalTab 3 Positve expressive rate of P53 protein in LVH group and NLVH group
, 百拇医药
n
Cell of expressed P53 protien(%)
LVH
23
65.88±14.08*
NLVH
16
50.78±10.65
*:P<0.01 vs NLVH group
2 高血压患者P53蛋白阳性细胞率与左室厚度的相关分析 高血压患者P53蛋白阳性者有超声记录的39例，室间隔厚度12.89±3.3 mm，左室后壁厚度12.21±1.9 mm。分别与P 53蛋白阳性细胞率进行相关分析，r值分别为0.48(P<0.05)及0.66(P<0.01)。 按有无室间隔增厚或和左室后壁增厚分为左室肥厚组(LVH)及无左室肥厚组(NLVH)， 发现LVH组外周血淋巴细胞中P53蛋白表达的阳性细胞率显著高于NLVH组，(P<0.01)。(见Tab 3)
, 百拇医药
DISCUSSION
高血压、动脉粥样硬化等心血管病大都是以细胞增生为主要特征的疾病。近年来人们发现许多心血管病与癌基因有密切关系，其中认为抑癌基因P53的表达不足或变异可能参与了心血管疾病的病理过程[1～3]。本实验研究了高血压患者外周血淋巴细胞中P53蛋白的表达。结果表明50例高血压患者外周血淋巴细胞中，有35例P 53蛋白呈阳性表达，阳性率70%。50例正常对照组中7例P53呈阳性表达， 阳性率为14%，两者比较有统计学差异(P<0.01)。按半定量法计算P53蛋白表达的阳性细胞率(%)，高血压组为59.9±24.4%，正常对照组为22.8±15.2%，两者比较差异有显著性(P<0.01)，说明高血压患者及正常人的外周血淋巴细胞均可存在P53蛋白的阳性表达， 但高血压组阳性率及阳性细胞率显著高于正常对照组。
野生型P53是目前唯一研究较明确的， 定位于细胞核内的抑制细胞增殖的抑癌基因。它位于人类第17号染色体短臂上，约20 kb的 DNA区域中，编码着一个由393个氨基酸组成、分子量为53 kD的核磷蛋白，对细胞增殖起负性调节作用。在正常组织细胞内P53蛋白产物的半衰期很短,导致其蛋白产物含量低,应用免疫组化方法不易测出。当P53基因突变(突变型P53),蛋白构型发生改变, 其负性调节细胞增殖作用消失,半衰期明显延长,P53蛋白就可以在细胞核中检测出来[4,5]。故一般用免疫组化所检测到的P53蛋白均为突变型P53。本组实验高血压组外周血淋巴细胞核中检测到的P53蛋白,其阳性细胞率较高，认为与P53基因突变、蛋白构型发生改变有关。 此结果与以往的研究报道类似[1,5]说明高血压病发病过程中存在P53基因的突变。而正常对照组外周血淋巴细胞核中也有P53蛋白阳性表达,此结果与以往报导结果不附合[5,6]。 其可能的原因是本实验研究检测的是外周血淋巴细胞核中的P53蛋白。从采血、涂片、干燥,到送入-20℃冰箱保存,全过程只需10分钟左右。而正常P53蛋白(野生型)的半衰期为20分钟左右[1]。因此本实验所用的P53单克隆抗体就可以与野生型P53蛋白结合，而显示阳性结果，但其含量较低，因此阳性率及阳性细胞率均较底。故正常对照组外周血淋巴细胞核中测到的P53蛋白可能是野生型的P53。
, http://www.100md.com
高血压左室肥厚是高血压病最常见的靶器管损害，也是心血管疾病的独立危险因子。而心肌肥厚乃是心肌细胞的肥大和非心肌细胞的增殖，间质胶原增生的结果[7]。 近年来有研究表明左室肥厚是心肌组织尤其是成纤维细胞中C-myc表达持续增强的结果[8,9]。本实验初步探讨了高血压患者室壁厚度与P53蛋白表达的关系。经研究有左室肥厚者外周血淋巴细胞中P53蛋白阳性细胞表达率显著高于无左室肥厚者，相关分析显示P53蛋白的阳性细胞率与室间隔厚度及左室后壁厚度呈正相关。r值分别显0.48(P<0.05)、0.66(P<0.01)，提示P53蛋白的突变可能与左室肥厚有关。
结论：本研究表明正常人和高血压患者外周血淋巴细胞中均存在P53蛋白的表达，高血压组阳性率及阳性细胞率均显著高于对照组(P<0.01)。提示高血压患者外周血淋巴细胞中存在P53蛋白的阳性表达，P53蛋白的阳性细胞率与高血压患者的左室肥厚呈正相关。
REFERENCES
, http://www.100md.com
1 李志远.C-myc和P53基因在心血管病中的研究,心血管病学进展1996;17(3):158
2 汤 健,周爱儒. 原癌基因与心血管疾病 北京:北京医科大学和协北京协和医科大学联合出版社 1990:100
3 杨和平,汤 健. 癌基因与抗癌基因在心血管病中的作用 北京医科大学报 1993;25(2):90
4 Janice MN, Baker SJ, Preisinger AC, et al. Mutations in the P53 gene occur in diverse human tumour Nature 1989;342:705
5 王 禹,李天德,刘建伟,等. 中国成人动脉粥样硬化病变中P53抑癌基因的结构突变及与病变程度的关系 中华心血管病杂志 1997;25(3);184
, 百拇医药
6 Hollestein M, Sidransky D,Vogelstein B, et al. P53 mutations in human cancersScience1992;253:29
7 Simpson PC. Proto-oncogenes and cardiac hypertrophy Annu Rev Physiol 1988;51:189
8 Sadoshima J,Izumo S. Molecular charaterization of angiotensin Ⅱ induced hypertrophy of cardiac myocytes and hyperplasia of cardiac fibroblasts Circ Res 1993;73:413
9 苏津自,陈达光,吴可贵,等.原癌基因C-myc,c-fos在自发性高血压大鼠左心室的表达 高血压杂志 1997;5(1):9
收稿日期：1998-09-05, 百拇医药