高血压患者胰岛素受体基因突变的检测
作者：牛文彦 王野虹 汤新之
单位：牛文彦 汤新之 天津医科大学；王野虹 解放军二七一医院 300070 天津
关键词：原发性高血压；胰岛素抵抗；胰岛素受体；基因突变；单链构象多态性
高血压杂志/990112 目的 探讨胰岛素受体基因在高血压发病中的作用。 方法 采用聚合酶链式反应-单链构象多态性方法检测46例高血压患者和39例正常血压对照者的胰岛素受体基因第17、18外显子的多态性。 结果 检出外显子17突变，突变在高血压组和对照组的频率分别为8.12%和 6.88%(P<0.05),两组间有显著性差异(χ2=4.9082)。突变经核苷酸序列分析为CAC1058→CAT1058纯合或杂合多态性突变。外显子18未发现突变。 结论 提示编码第1 058位氨基酸的 CAC可能是原发性高血压易感的基因标志，外显子18为高度保守序列。
, http://www.100md.com
Detection of Mutations in Insulin Receptor Gene in Hypertensive Patients
NIU Wenyan1，WANG Yehong2, TANG Xinzhi1
(1.Tianjin Medical University 2.The 271 Hospital of the Chinese People's Liberation Army 300070 Tianjin)
ABSTRACT Aim To study the role of insulin receptor gene mutations in the pathogenesis of hypertension. Methods The polymorphism if exon 17 and 18 of insulin gene were detected in 46 hypertension patients and 39 normal controls using PCR and single strand conformation polymorphism. Results The mutations in exon 17 were found. The mutation frequency of exon 17 were 8.12% and 6.88% in patients and controls, respectively(χ2=4.9082, P<0.05). Based on direct sequence analysis of exon 17, homozygous and heterozygous nonsense mutations were found-silent polymorphism at position 1058(CAC→CAT). The mutations in exon 18 were not found. Conclusion The result suggests that codon 1058(CAC) may be a genetic marker of susceptibility for hypertension in Chinese.
, 百拇医药
KEY WORDS essential hypertension; insulin resistance; insulin receptor; gene mutation; single strand conformation polymorphism
胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是机体对一定浓度的胰岛素的生物反应低于正常，即对胰岛素不敏感。在IR状态下，机体分泌大量的胰岛素以代偿糖代谢的紊乱，而这种继发的高胰岛素状态又会使胰岛素作用于其它途径的生物效应增强。近年来，大量的动物实验和临床研究表明，胰岛素抵抗不仅与血糖及血浆脂蛋白升高有关，还与血压(包括收缩压和舒张压)升高有关，IR可通过多种机制致高血压。已有文献报道胰岛素受体(insulin receptor, INSR )基因突变可引发IR，高血压患者常伴IR表明INSR基因突变可能是致高血压病的又一候选基因。本文检测INSR基因第17、18外显子的基因突变。
OBJECTIVES AND METHODS
, 百拇医药
1 对象：高血压组46例：选择天津医科大学总医院高血压患者，年龄 51±9岁，病程 3年以上，体重指数 23±2 kg/m2，男女各 23例。高血压按照 WHO诊断标准，无糖尿病及肥胖。根据病史及检查结果排除继发性高血压。正常对照组39例：年龄45±12岁，体重指数21±3kg/m2，男20例，女19例。均无糖尿病及糖尿病家族史，血压正常，肝、肾、甲状腺功能正常。
2 主要试剂：蛋白酶K(德国Merck公司产品)、PCR试剂(Promega公司产品)、琼脂糖(美国Bio-Rad公司产品)、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺(美国Bio-Rad公司产品)、引物合成和纯化试剂(美国PE公司产品)、测序试剂盒(美国GiBco BRL公司产品)、[γ-32P]ATP(北京福瑞公司)
3 方法：(1)合成寡核苷酸引物：参照Seino等人的引物设计，经计算机检索，引物与Gene Bank核酸数据库的序列无明显同源性。
, 百拇医药
外显子17：
上游引物5'-CCAAGGATGCTGTGTAGATAAG
下游引物5'-TCAGGAAAGCCAGCCCATGTC
外显子18：
上游引物5'-CTGGTGAGTCGAATCACGGA
下游引物5'-AGCGGGTGCTCCACCGAGTA
(2)提取基因组DNA：取抗凝外周血3ml，采用裂解液和提取液两步法提取基因组DNA。
(3) PCR扩增目的基因片段：50μl扩增体系中含基因组DNA 0.5 μg，上下游引物各20 pmol, dNTPs 200 μM，95℃预变性10 min后，加入1.5 U Taq DNA聚合酶，94℃变性1 min，60℃50 s，72℃延伸1.5 min，每种反应进行30个循环后，于1.8%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
(4)SSCP分析：聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，交联度为49:1。取5μl PCR产物,加等体积的变性液(98%甲酰胺,10 mmol EDTA pH 8.0,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯蓝),98℃变性5 min后立即置于冰浴,上样后,在电压200 V，4℃电泳6小时。电泳结束后，用Bio-Rad银染试剂盒染色。
(5)核苷酸序列分析：将SSCP检出的突变样品，用GiBco BRL测序试剂盒，采用双脱氧末端终止法测序。
4 统计分析：组间比较用χ2检验，P<0.05时认为有统计学差异。
RESULTS
1 PCR扩增结果：INSR基因外显子17、18扩增片段长度分别为317 bp、214 bp(Fig 1)。由Fig 可见扩增产物特异性较好，产率较高。
, 百拇医药
Fig 1 The 1.8% agarose electrophoresis result of the amplified insulin receptor gene.The line 1,3 are the exon 17 and exon 18 fragment respectively; the line 2 is the PBR 322/HinfⅠMarker.
2 SSCP分析结果：在46例高血压患者中，检出12例外显子17突变(频率8.12%)在39例对照组中检出3例外显子17突变(频率6.88%)。高血压组中突变频率明显高于对照组(P<0.05)，有显著性差异(χ2=4.9082)两组中均未发现外显子18突变，(Fig 2～3)。
Fig 2 The result in exon 17 of insulin receptor gene detected by single strand conformation polymorphism. The pattern 1 is wild type,the pattern 2,3 are mutation type.
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Fig 3 The result in exon 18 of insulin receptor gene detected by single strand conformation polymorphism. All lanes are wild type.
3 核酸序列分析结果：外显子17突变样品序列分析结果为第1058位密码子CAC→CAT的纯合及杂合多态性突变(Fig 4)。
Fig 4 Direct sequencing of amplified exon 17. Partial nucleotide sequence of PCR product corresponding to the pattern 1,2,3 in the assay of SSCP respectively, pattern 2,3 showing a single nucleotide substitution in codon 1058(CAC→CAT). The pattern 2 is heterozygote mutation and the pattern 3 is homozygote mutation. They are all silent mutation.
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DISCUSSION
人的INSR基因为单拷贝基因，位于染色体P13.2上，全长约120 kb，含22个外显子和11个内含子。INSR是由 2个α亚基和 2个β亚基组成的杂四聚体，β亚基中有一段区域为酪氨酸激酶域，由外显子17-21编码。胰岛素的生理作用是通过与位于细胞膜上INSR的结合来完成的。胰岛素与α亚基结合后，首先导致β亚基上的酪氨酸磷酸化，并使受体蛋白激酶活化。活化的蛋白激酶从受体底物Ⅰ和其它底物磷酸化开始，通过信号瀑布途径，引起胰岛素的多效应作用。外显子17、18编码酶活性的主要部分，其结构的改变会影响胰岛素跨膜信号的传递，造成IR。IR可降低血管平滑肌细胞对胰岛素敏感的Na,K-ATP酶活性，引起血管平滑肌细胞内Na+潴留，从而导致细胞膜容易去极化而兴奋性增高；还可降低血管平滑肌细胞的钙泵(Ca，Mg-ATP)活性，使细胞内Ca2+浓度增加，引起血管收缩，增强血管对去甲肾上腺素、血管紧张素等升压物质的反应，诱发或维持高血压；此外还可使血浆极低密度脂蛋白升高而使血浆高密度脂蛋白降低，使罹患高血压的危险上升。由此可见 INSR基因是高血压的一个候选基因。
, 百拇医药
本文对 46例高血压患者和 39例正常血压对照者进行 INS-R基因突变分析,外显子17CAC1058→CAT1058突变在高血压组和正常组出现的频率为8.12%和6.88%，两组间有显著性差异(P<0.05)。此突变为多态性突变，并未影响其编码的氨基酸的改变，提示它并非直接与高血压病因学相关，可能由于该位点与高血压致病基因位点存在连锁不平衡，致病位点可能在此基因的其它位置，或其它基因上。SSCP方法不可能筛查出所有的突变，且文献报道此外显子有多个突变热点，所以此外显子的突变与高血压的关系还有待于进一步研究。O'rahilly报道exon 18错义突变(Lys1068→Glu1068),在本文研究的人群中没有检出,提示此突变在中国人群中出现的频率低。对此基因的其它外显子的分析工作正在进行中。
REFERENCES
1 李晨钟,张素华,邱鸿鑫. 胰岛素抵抗综合征 国外医学，内分泌学分册 1995;15(4):169
, http://www.100md.com
2 Krook A, Kumar S, Laing I, et al. Molecular scanning of the insulin receptor gene in syndromes of insulin resistance Diabetes 1994;43(3):357
3 O'hahilly S, Moller DE. Mutation insulin receptors in syndromes of insulin resistance Clin Endocrinology 1992;36:121
4 Taylor SI, Kadowaki T, Kadowaki H, et al. Mutations in insulin-receptor gene in insulin-resistant patients Diabetes Care 1990;13(3):257
, 百拇医药
5 Seino S, Seino M, Bell GI. Human Insulin-Receptor gene-partial sequence and amplication of exons by polymerase chain reaction. Diabetes, 1990;39:123-128
6 Richard SL, Andrea D. The role of insulin resistance in polycystic ovary syndrome The Endocrinologist 1996;6(4):307
7 O'rahilly S, Choi WH, Patel P, et al. Detection of mutations in insulin-receptor gene in NIDDM patients by analysis of single-stranded conformation polymorphisms Diabetes 1991;40:777
收稿日期：1998-09-11, 百拇医药
单位：牛文彦 汤新之 天津医科大学；王野虹 解放军二七一医院 300070 天津
关键词：原发性高血压；胰岛素抵抗；胰岛素受体；基因突变；单链构象多态性
高血压杂志/990112 目的 探讨胰岛素受体基因在高血压发病中的作用。 方法 采用聚合酶链式反应-单链构象多态性方法检测46例高血压患者和39例正常血压对照者的胰岛素受体基因第17、18外显子的多态性。 结果 检出外显子17突变，突变在高血压组和对照组的频率分别为8.12%和 6.88%(P<0.05),两组间有显著性差异(χ2=4.9082)。突变经核苷酸序列分析为CAC1058→CAT1058纯合或杂合多态性突变。外显子18未发现突变。 结论 提示编码第1 058位氨基酸的 CAC可能是原发性高血压易感的基因标志，外显子18为高度保守序列。
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Detection of Mutations in Insulin Receptor Gene in Hypertensive Patients
NIU Wenyan1，WANG Yehong2, TANG Xinzhi1
(1.Tianjin Medical University 2.The 271 Hospital of the Chinese People's Liberation Army 300070 Tianjin)
ABSTRACT Aim To study the role of insulin receptor gene mutations in the pathogenesis of hypertension. Methods The polymorphism if exon 17 and 18 of insulin gene were detected in 46 hypertension patients and 39 normal controls using PCR and single strand conformation polymorphism. Results The mutations in exon 17 were found. The mutation frequency of exon 17 were 8.12% and 6.88% in patients and controls, respectively(χ2=4.9082, P<0.05). Based on direct sequence analysis of exon 17, homozygous and heterozygous nonsense mutations were found-silent polymorphism at position 1058(CAC→CAT). The mutations in exon 18 were not found. Conclusion The result suggests that codon 1058(CAC) may be a genetic marker of susceptibility for hypertension in Chinese.
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KEY WORDS essential hypertension; insulin resistance; insulin receptor; gene mutation; single strand conformation polymorphism
胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是机体对一定浓度的胰岛素的生物反应低于正常，即对胰岛素不敏感。在IR状态下，机体分泌大量的胰岛素以代偿糖代谢的紊乱，而这种继发的高胰岛素状态又会使胰岛素作用于其它途径的生物效应增强。近年来，大量的动物实验和临床研究表明，胰岛素抵抗不仅与血糖及血浆脂蛋白升高有关，还与血压(包括收缩压和舒张压)升高有关，IR可通过多种机制致高血压。已有文献报道胰岛素受体(insulin receptor, INSR )基因突变可引发IR，高血压患者常伴IR表明INSR基因突变可能是致高血压病的又一候选基因。本文检测INSR基因第17、18外显子的基因突变。
OBJECTIVES AND METHODS
, 百拇医药
1 对象：高血压组46例：选择天津医科大学总医院高血压患者，年龄 51±9岁，病程 3年以上，体重指数 23±2 kg/m2，男女各 23例。高血压按照 WHO诊断标准，无糖尿病及肥胖。根据病史及检查结果排除继发性高血压。正常对照组39例：年龄45±12岁，体重指数21±3kg/m2，男20例，女19例。均无糖尿病及糖尿病家族史，血压正常，肝、肾、甲状腺功能正常。
2 主要试剂：蛋白酶K(德国Merck公司产品)、PCR试剂(Promega公司产品)、琼脂糖(美国Bio-Rad公司产品)、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺(美国Bio-Rad公司产品)、引物合成和纯化试剂(美国PE公司产品)、测序试剂盒(美国GiBco BRL公司产品)、[γ-32P]ATP(北京福瑞公司)
3 方法：(1)合成寡核苷酸引物：参照Seino等人的引物设计，经计算机检索，引物与Gene Bank核酸数据库的序列无明显同源性。
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外显子17：
上游引物5'-CCAAGGATGCTGTGTAGATAAG
下游引物5'-TCAGGAAAGCCAGCCCATGTC
外显子18：
上游引物5'-CTGGTGAGTCGAATCACGGA
下游引物5'-AGCGGGTGCTCCACCGAGTA
(2)提取基因组DNA：取抗凝外周血3ml，采用裂解液和提取液两步法提取基因组DNA。
(3) PCR扩增目的基因片段：50μl扩增体系中含基因组DNA 0.5 μg，上下游引物各20 pmol, dNTPs 200 μM，95℃预变性10 min后，加入1.5 U Taq DNA聚合酶，94℃变性1 min，60℃50 s，72℃延伸1.5 min，每种反应进行30个循环后，于1.8%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果。
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(4)SSCP分析：聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，交联度为49:1。取5μl PCR产物,加等体积的变性液(98%甲酰胺,10 mmol EDTA pH 8.0,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯蓝),98℃变性5 min后立即置于冰浴,上样后,在电压200 V，4℃电泳6小时。电泳结束后，用Bio-Rad银染试剂盒染色。
(5)核苷酸序列分析：将SSCP检出的突变样品，用GiBco BRL测序试剂盒，采用双脱氧末端终止法测序。
4 统计分析：组间比较用χ2检验，P<0.05时认为有统计学差异。
RESULTS
1 PCR扩增结果：INSR基因外显子17、18扩增片段长度分别为317 bp、214 bp(Fig 1)。由Fig 可见扩增产物特异性较好，产率较高。
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Fig 1 The 1.8% agarose electrophoresis result of the amplified insulin receptor gene.The line 1,3 are the exon 17 and exon 18 fragment respectively; the line 2 is the PBR 322/HinfⅠMarker.
2 SSCP分析结果：在46例高血压患者中，检出12例外显子17突变(频率8.12%)在39例对照组中检出3例外显子17突变(频率6.88%)。高血压组中突变频率明显高于对照组(P<0.05)，有显著性差异(χ2=4.9082)两组中均未发现外显子18突变，(Fig 2～3)。
Fig 2 The result in exon 17 of insulin receptor gene detected by single strand conformation polymorphism. The pattern 1 is wild type,the pattern 2,3 are mutation type.
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Fig 3 The result in exon 18 of insulin receptor gene detected by single strand conformation polymorphism. All lanes are wild type.
3 核酸序列分析结果：外显子17突变样品序列分析结果为第1058位密码子CAC→CAT的纯合及杂合多态性突变(Fig 4)。
Fig 4 Direct sequencing of amplified exon 17. Partial nucleotide sequence of PCR product corresponding to the pattern 1,2,3 in the assay of SSCP respectively, pattern 2,3 showing a single nucleotide substitution in codon 1058(CAC→CAT). The pattern 2 is heterozygote mutation and the pattern 3 is homozygote mutation. They are all silent mutation.
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DISCUSSION
人的INSR基因为单拷贝基因，位于染色体P13.2上，全长约120 kb，含22个外显子和11个内含子。INSR是由 2个α亚基和 2个β亚基组成的杂四聚体，β亚基中有一段区域为酪氨酸激酶域，由外显子17-21编码。胰岛素的生理作用是通过与位于细胞膜上INSR的结合来完成的。胰岛素与α亚基结合后，首先导致β亚基上的酪氨酸磷酸化，并使受体蛋白激酶活化。活化的蛋白激酶从受体底物Ⅰ和其它底物磷酸化开始，通过信号瀑布途径，引起胰岛素的多效应作用。外显子17、18编码酶活性的主要部分，其结构的改变会影响胰岛素跨膜信号的传递，造成IR。IR可降低血管平滑肌细胞对胰岛素敏感的Na,K-ATP酶活性，引起血管平滑肌细胞内Na+潴留，从而导致细胞膜容易去极化而兴奋性增高；还可降低血管平滑肌细胞的钙泵(Ca，Mg-ATP)活性，使细胞内Ca2+浓度增加，引起血管收缩，增强血管对去甲肾上腺素、血管紧张素等升压物质的反应，诱发或维持高血压；此外还可使血浆极低密度脂蛋白升高而使血浆高密度脂蛋白降低，使罹患高血压的危险上升。由此可见 INSR基因是高血压的一个候选基因。
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本文对 46例高血压患者和 39例正常血压对照者进行 INS-R基因突变分析,外显子17CAC1058→CAT1058突变在高血压组和正常组出现的频率为8.12%和6.88%，两组间有显著性差异(P<0.05)。此突变为多态性突变，并未影响其编码的氨基酸的改变，提示它并非直接与高血压病因学相关，可能由于该位点与高血压致病基因位点存在连锁不平衡，致病位点可能在此基因的其它位置，或其它基因上。SSCP方法不可能筛查出所有的突变，且文献报道此外显子有多个突变热点，所以此外显子的突变与高血压的关系还有待于进一步研究。O'rahilly报道exon 18错义突变(Lys1068→Glu1068),在本文研究的人群中没有检出,提示此突变在中国人群中出现的频率低。对此基因的其它外显子的分析工作正在进行中。
REFERENCES
1 李晨钟,张素华,邱鸿鑫. 胰岛素抵抗综合征 国外医学，内分泌学分册 1995;15(4):169
, http://www.100md.com
2 Krook A, Kumar S, Laing I, et al. Molecular scanning of the insulin receptor gene in syndromes of insulin resistance Diabetes 1994;43(3):357
3 O'hahilly S, Moller DE. Mutation insulin receptors in syndromes of insulin resistance Clin Endocrinology 1992;36:121
4 Taylor SI, Kadowaki T, Kadowaki H, et al. Mutations in insulin-receptor gene in insulin-resistant patients Diabetes Care 1990;13(3):257
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5 Seino S, Seino M, Bell GI. Human Insulin-Receptor gene-partial sequence and amplication of exons by polymerase chain reaction. Diabetes, 1990;39:123-128
6 Richard SL, Andrea D. The role of insulin resistance in polycystic ovary syndrome The Endocrinologist 1996;6(4):307
7 O'rahilly S, Choi WH, Patel P, et al. Detection of mutations in insulin-receptor gene in NIDDM patients by analysis of single-stranded conformation polymorphisms Diabetes 1991;40:777
收稿日期：1998-09-11, 百拇医药