人血浆中盐酸氟桂利嗪的HPLC测定及药代动力学研究
作者：何海霞 周远大 姚高琼 朱治本
单位：何海霞 周远大 姚高琼 朱治本(重庆医科大学附属第一医院临床药理研究室 重庆 400016)
关键词：盐酸氟桂利嗪；HPLC法；血药浓度；药代动力学
药物分析杂志000305 摘要 目的：建立血浆中盐酸氟桂利嗪浓度的反相HPLC测定法，并用此方法研究盐酸氟桂利嗪在人体内的药代动力学。方法：内标安定为内标，血浆经戊烷-异丙醇、盐酸溶液、二氯甲烷等多步提取后，采用C18分析柱，以甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化铵)(74∶26)为流动相，流速为0.8 mL.min-1；在紫外254 nm处检测。所得数据用3p87药代动力学程序处理，求出有关的参数。结果：盐酸氟桂利嗪在2.34～150 ng.mL-1范围内线性关系良好(r=0.998 5)，最低检测浓度2 ng.mL-1；平均回收率99.94%。应用本法对单剂量口服盐酸氟桂利嗪后的药代动力学进行了初步探讨。结果表明药时曲线符合一室药动学模型，药动学的主要参数t1/2(Ka)=1.61 h、t1/2(Ke)=4.09 h、tp=2.82 h、Cmax=59.54 ng.mL-1。结论：本方法以安定为内标，灵敏、可靠，回收率高，结果准确，适用于临床血药浓度监测及药代动力学研究。
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Determination of Flunarizine Hydrochloride in Human Plasma
by HPLC and Its Pharmacokinetics
He Haixia，Zhou Yuanda，Yao Gaoqiong，Zhu Zhiben
(Department of Clinical Pharmacology,the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)
Abstract Objective：To establish a HPLC method for the determination of flunarizine hydrochloride in human plasma and investigate its pharmacokinetic characteristics dichloromethane in healthy volunteers after a single oral dose.Methods:The drug and internal standard(Diazepam,DZP)were extracted from plasma with n-pentane—iso-propyl alcohol,1 mol.L-1 hydrochloric acid,and then detected by UV detector at 254 nm with the C18 column and methanol-water (containing 0.02 mol.L-1 tetrabutyl ammonium bromide)(74∶26) as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL.min-1.The data obtained were fitted with 3p87 program on computer.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.34 and 150 ng.mL-1 with a correlation coefficient of 0.998 5.The limit of detection of flunarizine hydrochloride in plasma was 2 ng.mL-1.The mean recovery of flunarizine hydrochloride was 99.94% in plasma.This assay procedure has been applied to pharmacokinetic study of flunarizine hydrochloride.The results showed that the drug concentration-time profile conformed to the one-compartment model.The pharmacokinetic parameters were estimated as follows:t1/2(Ka)=1.61 h,t1/2(Ke)=4.09 h，tp=2.82 h，Cmax=59.54 ng.mL-1.Conclusion:The method was sensitive,precise and reliable. It is suitable for the monitoring of blood drug concentration and its pharmacokinetic studies.
, 百拇医药
Key words flunarizine hydrochloride,HPLC,blood drug concentration,pharmacokinetics
氟桂利嗪(氟脑嗪，脑灵，Flunarizine)，化学名(E)-1-[双(4-氟苯基)甲基]-4(2-丙烯-3-苯基)哌嗪，是一种哌嗪类钙离子拮抗剂，其药理及应用与桂利嗪(脑益嗪)相似，有扩张血管作用，对注意力减弱、记忆力障碍、平衡功能障碍、眩晕等均有一定疗效。目前，国内外有关该药的血药浓度测定方法均为HPLC法。本文参阅文献[1，2]，加以改进，寻找出适宜的内标，建立了灵敏、准确的反相HPLC法测定人血浆中的盐酸氟桂利嗪，并对单剂口服该药后的药代动力学进行了初步研究。
1 仪器及试药
Bio-Rad高效液相色谱仪：1350泵系统，1306UV检测器，HP3392A数据处理机。
, 百拇医药
盐酸氟桂利嗪胶囊(简称FZ)，5 mg每粒(均以氟桂利嗪计)，批号971202；盐酸氟桂利嗪对照品(纯度99.21%)均由重庆制药七厂提供。安定(简称DZP)由湖北制药厂生产。甲醇、四丁基溴化铵、戊烷、异丙醇、二氯甲烷、硼砂、硼酸等均为AR级；三蒸水。
2 色谱条件
色谱柱：μBondapak C18，10 μm，250 mm×4.6 mm；C18预柱：10 μm，28 mm×7 mm(大连化学物理研究所)；柱温：室温；50 μL固定进样环；流动相：甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化铵)(74∶26)，流速0.8 mL.min-1；紫外检测波长：254 nm。内标：DZP。
3 样品处理
, 百拇医药
参照文献[2]，取受试者血浆1 mL于具塞离心管中，加DZP内标液(以甲醇配制成浓度为1.08 μg .mL-1)20 μL，混合，加0.012 5 mol .L-1硼酸缓冲液(pH 8.5，0.2 mol .L-1硼砂45 mL与0.2 mol .L-1硼酸55 mL混合)1 mL，混匀，用戊烷-异丙醇(98∶2)4 mL提取2次，合并有机相，加1 mol.L-1盐酸6 mL，混旋2 min后，弃去有机相，水层加10 mol.L-1氢氧化钠溶液0.7 mL，混匀，用二氯甲烷4 mL混旋1 min提取2次，合并有机相，在50 ℃水浴用氮气挥干，残渣用100 μL流动相复溶，进样50 μL。
4 实验结果
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4.1 色谱条件的研究
4.1.1 流动相 参照文献[2]，对流动相加以改进。FZ的色谱行为对流动相中甲醇比例最为敏感。当流速恒定，甲醇比例为65%时，FZ的tR为17.70 min，甲醇为74%时，FZ的tR为7.16 min，甲醇为80%时，FZ的tR为6.5 min。当甲醇比例达到74%以上，拖尾现象显著改善，峰形良好。
4.1.2 内标 在选定的色谱条件上筛选内标，曾试用多种内标物，有的分离效果尚可，但经提取回收率不佳，仅DZP为内标最佳，两方面均能兼顾。10.80，21.60，43.20 ng.mL-13种浓度DZP的平均回收率(%)±SD分别为92.00±7.21，94.77±3.88，95.60±2.89(n=5)，FZ与DZP的分离图谱见图1-C。
4.2 色谱行为 分别取空白血浆和含FZ血浆，按样品处理项下操作，记录色谱图(见图1)。血浆中FZ的tR为7.2 min；内标的tR为9.4 min，分离度好(R>2)。
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图1 空白血浆(A)、空白血浆加DZP(B)、含DZP的血浆
样品(C)、不含DZP的血浆样品(D)的色谱图
1.FZ 2.DZP
注：给药后2 h的血浆样品
4.3 方法学研究
4.3.1 线性关系与最低检测浓度 在空白血浆中分别添加FZ使血药浓度相当于2.34，4.69，9.38，18.75，37.5，75.0，150.0 ng.mL-1，按样品处理项下进行测定，所得数据经回归，得标准曲线方程。FZ与DZP峰高比R与FZ浓度C(ng .mL-1)的关系为：
R=6.668×10-3C-8.126×10-3 r=0.998 5
, 百拇医药
最低检测浓度2 ng.mL-1(信噪比>2)。
4.3.2 回收率、日内及日间精密度 按照“4.3.1”项下方法，采用高、中、低3个浓度，评价本法的回收率及日内、日间FZ与DZP峰高比值的RSD，见表1。
表1 HPLC法测定血浆中FZ含量的
回收率(n=3)及精密度(n=5) 浓度/ng .mL-1
回收率
±RSD/%
RSD/%
日内
日间
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2.34
104.0±9.24
9.29
11.09
18.75
99.25±4.26
4.56
8.41
150.00
96.59±4.29
4.58
5.64
, http://www.100md.com 4.4 药代动力学研究 健康男性志愿者12名，年龄(22.33±1.15)岁，体重(60.50±5.0)kg，受试前1周未服任何药物，经心、肝、肾功能检查均属正常。受试者禁食12 h后空腹一次口服FZ胶囊25 mg，于服药前及服药后0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h取血，分离血浆，按前述血样处理方法操作，计算血药浓度。每例受试者血药浓度-时间数据采用微机3p87程序自动拟合，结果表明口服FZ的药时数据符合一室药动学模型，见图2；求得有关药动学参数见表2。
图2 12名受试者单剂口服FZ胶囊25 mg后的平均药时曲线
表2 12名受试者单剂口服FZ胶囊25 mg后的
平均药动学参数 参 数
±S
, 百拇医药
tlag/h
0.17±0.14
t1/2(Ka)/h
1.16±0.63
t1/2(Ke)/h
4.09±1.32
tp/h
2.82±0.72
Cmax/ng .mL-1
59.54±4.75
, 百拇医药
AUC0～24 h/μg .h.L-1
597.79±159.21
5 讨论
文献[1,2]报道FZ的定量均用外标法，根据内标物选择原则，对多种药物进行了试验。仅DZP既能出峰，又与FZ分离良好，且回收率高，用DZP作为FZ测定的内标，国内外尚未见报道。
本实验曾在碱性环境下单用正己烷或二氯甲烷提取血浆中的FZ，但效果均不理想，2种萃取剂提取过程中均易发生乳化现象，且FZ回收率低；通过实践，采用文献[2]方法虽较繁琐，但方法灵敏可靠、重现性好、回收率高，仍不失为一种较好的提取方法。
对药代动力学的初步研究表明，口服FZ后在体内药动学过程用一室药动学模型拟合最佳。表明该药物吸收后能迅速在体内分布，未见明显的分布相，与国内文献[1，2]报道一致。该药滞后时间短，表明胶囊剂在体内崩解、溶出快，而后迅速吸收，于3 h左右达到血药浓度峰值，其消除半衰期(t1/2(Ke))平均为(4.09±1.32)h，与谢林等的报道[1]基本一致[平均为(5.07±0.52)h及(4.82±0.36)h]，而与曲福军等报道[2]的t1/2(Ke)仅(2.64±1.39)h，(2.19±0.86)h，(2.28±0.88)h相差较大，作者认为与该文给药后的采血时间较短(8.5 h)有关。
参考文献
1，谢林，刘晓东，高旭等.人血浆中盐酸氟桂利嗪HPLC测定及其药代动力学.中国药科大学学报，1995，26(5)：300
2，曲福军，夏军，姜礼红等.用反相HPLC法测定盐酸氟桂利嗪胶囊在人体中的相对生物利用度.中国药房，1997，8(4)：173
(本文于1999年4月12日收到), 百拇医药
单位：何海霞 周远大 姚高琼 朱治本(重庆医科大学附属第一医院临床药理研究室 重庆 400016)
关键词：盐酸氟桂利嗪；HPLC法；血药浓度；药代动力学
药物分析杂志000305 摘要 目的：建立血浆中盐酸氟桂利嗪浓度的反相HPLC测定法，并用此方法研究盐酸氟桂利嗪在人体内的药代动力学。方法：内标安定为内标，血浆经戊烷-异丙醇、盐酸溶液、二氯甲烷等多步提取后，采用C18分析柱，以甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化铵)(74∶26)为流动相，流速为0.8 mL.min-1；在紫外254 nm处检测。所得数据用3p87药代动力学程序处理，求出有关的参数。结果：盐酸氟桂利嗪在2.34～150 ng.mL-1范围内线性关系良好(r=0.998 5)，最低检测浓度2 ng.mL-1；平均回收率99.94%。应用本法对单剂量口服盐酸氟桂利嗪后的药代动力学进行了初步探讨。结果表明药时曲线符合一室药动学模型，药动学的主要参数t1/2(Ka)=1.61 h、t1/2(Ke)=4.09 h、tp=2.82 h、Cmax=59.54 ng.mL-1。结论：本方法以安定为内标，灵敏、可靠，回收率高，结果准确，适用于临床血药浓度监测及药代动力学研究。
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Determination of Flunarizine Hydrochloride in Human Plasma
by HPLC and Its Pharmacokinetics
He Haixia，Zhou Yuanda，Yao Gaoqiong，Zhu Zhiben
(Department of Clinical Pharmacology,the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016)
Abstract Objective：To establish a HPLC method for the determination of flunarizine hydrochloride in human plasma and investigate its pharmacokinetic characteristics dichloromethane in healthy volunteers after a single oral dose.Methods:The drug and internal standard(Diazepam,DZP)were extracted from plasma with n-pentane—iso-propyl alcohol,1 mol.L-1 hydrochloric acid,and then detected by UV detector at 254 nm with the C18 column and methanol-water (containing 0.02 mol.L-1 tetrabutyl ammonium bromide)(74∶26) as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL.min-1.The data obtained were fitted with 3p87 program on computer.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.34 and 150 ng.mL-1 with a correlation coefficient of 0.998 5.The limit of detection of flunarizine hydrochloride in plasma was 2 ng.mL-1.The mean recovery of flunarizine hydrochloride was 99.94% in plasma.This assay procedure has been applied to pharmacokinetic study of flunarizine hydrochloride.The results showed that the drug concentration-time profile conformed to the one-compartment model.The pharmacokinetic parameters were estimated as follows:t1/2(Ka)=1.61 h,t1/2(Ke)=4.09 h，tp=2.82 h，Cmax=59.54 ng.mL-1.Conclusion:The method was sensitive,precise and reliable. It is suitable for the monitoring of blood drug concentration and its pharmacokinetic studies.
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Key words flunarizine hydrochloride,HPLC,blood drug concentration,pharmacokinetics
氟桂利嗪(氟脑嗪，脑灵，Flunarizine)，化学名(E)-1-[双(4-氟苯基)甲基]-4(2-丙烯-3-苯基)哌嗪，是一种哌嗪类钙离子拮抗剂，其药理及应用与桂利嗪(脑益嗪)相似，有扩张血管作用，对注意力减弱、记忆力障碍、平衡功能障碍、眩晕等均有一定疗效。目前，国内外有关该药的血药浓度测定方法均为HPLC法。本文参阅文献[1，2]，加以改进，寻找出适宜的内标，建立了灵敏、准确的反相HPLC法测定人血浆中的盐酸氟桂利嗪，并对单剂口服该药后的药代动力学进行了初步研究。
1 仪器及试药
Bio-Rad高效液相色谱仪：1350泵系统，1306UV检测器，HP3392A数据处理机。
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盐酸氟桂利嗪胶囊(简称FZ)，5 mg每粒(均以氟桂利嗪计)，批号971202；盐酸氟桂利嗪对照品(纯度99.21%)均由重庆制药七厂提供。安定(简称DZP)由湖北制药厂生产。甲醇、四丁基溴化铵、戊烷、异丙醇、二氯甲烷、硼砂、硼酸等均为AR级；三蒸水。
2 色谱条件
色谱柱：μBondapak C18，10 μm，250 mm×4.6 mm；C18预柱：10 μm，28 mm×7 mm(大连化学物理研究所)；柱温：室温；50 μL固定进样环；流动相：甲醇-水(含0.02 mol.L-1四丁基溴化铵)(74∶26)，流速0.8 mL.min-1；紫外检测波长：254 nm。内标：DZP。
3 样品处理
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参照文献[2]，取受试者血浆1 mL于具塞离心管中，加DZP内标液(以甲醇配制成浓度为1.08 μg .mL-1)20 μL，混合，加0.012 5 mol .L-1硼酸缓冲液(pH 8.5，0.2 mol .L-1硼砂45 mL与0.2 mol .L-1硼酸55 mL混合)1 mL，混匀，用戊烷-异丙醇(98∶2)4 mL提取2次，合并有机相，加1 mol.L-1盐酸6 mL，混旋2 min后，弃去有机相，水层加10 mol.L-1氢氧化钠溶液0.7 mL，混匀，用二氯甲烷4 mL混旋1 min提取2次，合并有机相，在50 ℃水浴用氮气挥干，残渣用100 μL流动相复溶，进样50 μL。
4 实验结果
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4.1 色谱条件的研究
4.1.1 流动相 参照文献[2]，对流动相加以改进。FZ的色谱行为对流动相中甲醇比例最为敏感。当流速恒定，甲醇比例为65%时，FZ的tR为17.70 min，甲醇为74%时，FZ的tR为7.16 min，甲醇为80%时，FZ的tR为6.5 min。当甲醇比例达到74%以上，拖尾现象显著改善，峰形良好。
4.1.2 内标 在选定的色谱条件上筛选内标，曾试用多种内标物，有的分离效果尚可，但经提取回收率不佳，仅DZP为内标最佳，两方面均能兼顾。10.80，21.60，43.20 ng.mL-13种浓度DZP的平均回收率(%)±SD分别为92.00±7.21，94.77±3.88，95.60±2.89(n=5)，FZ与DZP的分离图谱见图1-C。
4.2 色谱行为 分别取空白血浆和含FZ血浆，按样品处理项下操作，记录色谱图(见图1)。血浆中FZ的tR为7.2 min；内标的tR为9.4 min，分离度好(R>2)。
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图1 空白血浆(A)、空白血浆加DZP(B)、含DZP的血浆
样品(C)、不含DZP的血浆样品(D)的色谱图
1.FZ 2.DZP
注：给药后2 h的血浆样品
4.3 方法学研究
4.3.1 线性关系与最低检测浓度 在空白血浆中分别添加FZ使血药浓度相当于2.34，4.69，9.38，18.75，37.5，75.0，150.0 ng.mL-1，按样品处理项下进行测定，所得数据经回归，得标准曲线方程。FZ与DZP峰高比R与FZ浓度C(ng .mL-1)的关系为：
R=6.668×10-3C-8.126×10-3 r=0.998 5
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最低检测浓度2 ng.mL-1(信噪比>2)。
4.3.2 回收率、日内及日间精密度 按照“4.3.1”项下方法，采用高、中、低3个浓度，评价本法的回收率及日内、日间FZ与DZP峰高比值的RSD，见表1。
表1 HPLC法测定血浆中FZ含量的
回收率(n=3)及精密度(n=5) 浓度/ng .mL-1
回收率
±RSD/%
RSD/%
日内
日间
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2.34
104.0±9.24
9.29
11.09
18.75
99.25±4.26
4.56
8.41
150.00
96.59±4.29
4.58
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图2 12名受试者单剂口服FZ胶囊25 mg后的平均药时曲线
表2 12名受试者单剂口服FZ胶囊25 mg后的
平均药动学参数 参 数
±S, 百拇医药
tlag/h
0.17±0.14
t1/2(Ka)/h
1.16±0.63
t1/2(Ke)/h
4.09±1.32
tp/h
2.82±0.72
Cmax/ng .mL-1
59.54±4.75
, 百拇医药
AUC0～24 h/μg .h.L-1
597.79±159.21
5 讨论
文献[1,2]报道FZ的定量均用外标法，根据内标物选择原则，对多种药物进行了试验。仅DZP既能出峰，又与FZ分离良好，且回收率高，用DZP作为FZ测定的内标，国内外尚未见报道。
本实验曾在碱性环境下单用正己烷或二氯甲烷提取血浆中的FZ，但效果均不理想，2种萃取剂提取过程中均易发生乳化现象，且FZ回收率低；通过实践，采用文献[2]方法虽较繁琐，但方法灵敏可靠、重现性好、回收率高，仍不失为一种较好的提取方法。
对药代动力学的初步研究表明，口服FZ后在体内药动学过程用一室药动学模型拟合最佳。表明该药物吸收后能迅速在体内分布，未见明显的分布相，与国内文献[1，2]报道一致。该药滞后时间短，表明胶囊剂在体内崩解、溶出快，而后迅速吸收，于3 h左右达到血药浓度峰值，其消除半衰期(t1/2(Ke))平均为(4.09±1.32)h，与谢林等的报道[1]基本一致[平均为(5.07±0.52)h及(4.82±0.36)h]，而与曲福军等报道[2]的t1/2(Ke)仅(2.64±1.39)h，(2.19±0.86)h，(2.28±0.88)h相差较大，作者认为与该文给药后的采血时间较短(8.5 h)有关。
参考文献
1，谢林，刘晓东，高旭等.人血浆中盐酸氟桂利嗪HPLC测定及其药代动力学.中国药科大学学报，1995，26(5)：300
2，曲福军，夏军，姜礼红等.用反相HPLC法测定盐酸氟桂利嗪胶囊在人体中的相对生物利用度.中国药房，1997，8(4)：173
(本文于1999年4月12日收到), 百拇医药