气相色谱-质谱法测定川芎哚血药浓度
作者：唐刚华 姜国辉 王世真 郑连芳
单位：唐刚华(第一军医大学南方医院南方PET中心 广州 510515)；姜国辉 王世真 郑连芳(中国医学科学院-中国协和医科大学北京协和医院核医学科 北京 100730)
关键词：川芎哚；药代动力学；气相色谱-质谱
药物分析杂志000301 摘要 目的：建立测定大鼠血浆样品中川芎哚浓度的气相色谱-质谱(GC-MS)定量分析方法。方法：血浆样品经乙醚-异丙醇(10∶1)提取、硅烷化处理后，选择GC-MS选择性离子和辅助定量离子监测。结果：本法线性范围为2～60 ng.mL-1，灵敏度为1 ng.mL-1，回收率达82%，日内日间RSD均小于9.0%。结论：本法为川芎哚临床药代动力学研究提供了准确、可靠的方法。
, 百拇医药
Determination of Perlolyrine in Rat Plasma by GC-MS
Tang Ganghua
(Nanfang PET Centre,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Jiang Guohui，Wang Shihzhen，Zheng Lianfang
(Department of Nuclear Medicine,PUMC Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100730)
Abstract Objective：To develop a method for the determination of perlolyrine in rat plasma using GC-MS. Methods:Perlolyrine in plasma was extracted with ethyl ether—iso-propyl alcohol and determined by means of GC-MS with selected ion and qualifier ion monitoring.Results:The standard curve was linear between 2～60 ng.mL-1 and the minimum detection limit was 1 ng.mL-1.The recovery of perlolyrine in plasma was above 82% and the relative standard deviation (RSD) less than 9.0%.Conclusion:It provided an important method for the determination of clinical pharmacokinetics.
, 百拇医药
Key words perlolyrine,pharmacokinetics,GC-MS
川芎哚(川芎Ⅲ号碱，perlolyrine)是中药川芎(Ligusticum wallichii Franch)中的一种有效活性生物碱，其化学结构为1-(5-羟甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚[1,2],药理实验证明川芎哚对冠心病有一定的疗效作用[3]。为了探讨川芎哚在动物体内的代谢动力学，本文建立了灵敏度高，特异性好的GC-MS选择离子(SIM)外标方法，该方法由MS化学工作站监测川芎哚的靶离子(Target Ion)和辅助定量离子(Qualifier Ion)[4]，其灵敏度可达1 ng.mL-1。该法适于川芎哚动物体内药代动力学参数的测定，同时也为川芎哚临床药代动力学研究提供了重要的方法。
1 仪器与试药
, 百拇医药
1.1 仪器 HP-5890Ⅱ/5971A型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)。
1.2 试药 川芎哚、[2-15N]-1-(5-羟甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚([2-15N]川芎哚)(自制)；N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)(Gemany 产，分析纯)；缓冲溶液：0.2 mol.mL-1碳酸钠-0.2 mol.L-1硼酸(含0.2 mol.L-1氯化钾)-水(57∶43∶100)，调pH=8～9；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 实验动物 Wistar大鼠，雌雄兼用，体重(200±20)g(中国医学科学院实验动物中心)。
2 方法与结果
, http://www.100md.com
2.1 GC-MS分析条件 毛细管气相色谱柱HP-1(12 m×0.22 mm×0.33 μm)，载气：氦气，流速1.0 mL.min-1，进样口温度：250 ℃，检测器温度：280 ℃，进样方式：不分流进样，柱升温程序：起始温度70 ℃，停留1 min后，以15 ℃.min-1速率升温至300 ℃，保持15 min，进样量为1 μL，电离方式为EI，电子轰击能量为70 eV。
2.2 生物样品的制备 从大鼠颈静脉采血约3 mL，以肝素抗凝，离心分离血浆，取血浆1 mL，加入氯化钠0.5 g及碳酸钠-硼酸-氯化钾缓冲液1 mL，振荡1 min，加入抽提液乙醚-异丙醇(10∶1)1 mL，振荡5 min，离心10 min，取上清液，氮气吹干，用注射器加入MSTFA 20 μL，70 ℃反应30 min，取1 μL进样。GC-MS法对川芎哚有较好的分离鉴别效果，图1为川芎哚质谱图，川芎哚TMS衍生物的分子离子峰为m/z 336，碎片基峰为m/z 247，为提高检测灵敏度和准确度，选择m/z 247为靶离子和m/z 336为辅助定量离子。
, 百拇医药
图1 川芎哚的质谱图
2.3 标准曲线制备 用大鼠空白血浆溶液配制浓度分别为2，5，10，20，30，60 ng.mL-1的川芎哚标准溶液，按生物样品制备方法提取测定，制备标准曲线。结果表明，川芎哚在2～60 ng.mL-1范围内，响应值与浓度呈良好的线性关系，回归方程：
Y=1.24×104X-8.32×102 r=0.996 0
信噪比S/N=3时，最低检测浓度为1 ng.mL-1。
2.4 回收率试验 取大鼠空白血浆溶液配制低、中、高3种浓度(2，10，30 ng.mL-1)各5管，按上法制备样品进样，以3个浓度不经抽提为标准对照，计算回收率，得3种浓度的回收率(RSD)分别为82.52%(5.50%)；83.46%(3.69%)；87.18%(0.52%)。
, http://www.100md.com
2.5 精密度
2.5.1 日内重复性 取大鼠空白血浆溶液配制低、中、高3种浓度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制备样品进样，在1 d内分别重复进样5次，得3种浓度的日内重复性(RSD)分别为1.94 ng.mL-1(7.22%)；9.82 ng.mL-1(6.21%)；30.12 ng.mL-1(2.36%)。
2.5.2 日间重复性 取空白血浆溶液配制低、中、高3种浓度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制备样品进样，在5 d内分别每天1次重复进样，得3种浓度的日间重复性RSD分别为1.92 ng.mL-1(8.85%)；9.91 ng.mL-1(6.86%)；29.98 ng.mL-1(7.61%)。
, http://www.100md.com
2.6 川芎哚的血药浓度测定 36只大鼠分为9组，每组为4只大鼠，分别灌胃给予川芎哚0.5 mg.kg-1后，于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12 h时从颈静脉采血3 mL，按生物样品制备方法提取测定。大鼠灌胃后平均血药浓度-时间曲线见图2。
3 讨论
川芎哚的挥发性和热稳定性较差，直接进样由于低的挥发性和热分解，重现性差，检出灵敏度低。经MSTFA衍生化后，川芎哚衍生物有一定的挥发性和稳定性，能产生良好的色谱和质谱图，检测受其它干扰少。
图2 川芎哚的血药浓度-时间曲线
川芎哚药代动力学研究已有文献报道[3]，但使用的是放射性同位素示踪法，不适于临床药代动力学研究。本文建立的GC-MS选择离子监测，外标定量方法，专一性好，灵敏度高，可以用于临床药代动力学研究，所以本研究为川芎哚临床药代动力学研究提供了可靠的方法。但本法提取回收率和重现性不是很理想，为保证方法有较好的重现性和准确性，要不断对标准曲线进行校正，在监测靶离子(m/z 247)时，必须同时监测辅助定量离子(m/z 336)，确定2者峰高的比例范围[100∶(39.86～51.34)]，其目的是确保未知样品的检测分析在此比例范围内，从而保证结果的准确性。本法测定结果与以[2-15N]川芎哚为内标准的内标法结果基本一致。
, http://www.100md.com
参考文献
1，唐刚华，王世真，吴淑琴等.川芎哚的有机合成研究.中国药学杂志，1998，33(8)：492
2，Tang Ganghua,Wang Shihzhen,Wu Shuqin,et al.Syntheses of dl-α-15N-tryptophan and 2-15N-perlolyrine.J Labelled Compd Radiopharm,1998，41(2):139
3，华英圣，马桂华，刘丽波等.川芎Ⅲ号碱药理作用的初步研究.中医药学报，1989，(2)：40
4，乔建忠，袁淑兰，张振清.气相色谱-质谱法测定人血浆中丁螺环酮浓度.药物分析杂志，1996，16(6)：370
(本文于1999年5月2日收到), 百拇医药
单位：唐刚华(第一军医大学南方医院南方PET中心 广州 510515)；姜国辉 王世真 郑连芳(中国医学科学院-中国协和医科大学北京协和医院核医学科 北京 100730)
关键词：川芎哚；药代动力学；气相色谱-质谱
药物分析杂志000301 摘要 目的：建立测定大鼠血浆样品中川芎哚浓度的气相色谱-质谱(GC-MS)定量分析方法。方法：血浆样品经乙醚-异丙醇(10∶1)提取、硅烷化处理后，选择GC-MS选择性离子和辅助定量离子监测。结果：本法线性范围为2～60 ng.mL-1，灵敏度为1 ng.mL-1，回收率达82%，日内日间RSD均小于9.0%。结论：本法为川芎哚临床药代动力学研究提供了准确、可靠的方法。
, 百拇医药
Determination of Perlolyrine in Rat Plasma by GC-MS
Tang Ganghua
(Nanfang PET Centre,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Jiang Guohui，Wang Shihzhen，Zheng Lianfang
(Department of Nuclear Medicine,PUMC Hospital,CAMS and PUMC,Beijing 100730)
Abstract Objective：To develop a method for the determination of perlolyrine in rat plasma using GC-MS. Methods:Perlolyrine in plasma was extracted with ethyl ether—iso-propyl alcohol and determined by means of GC-MS with selected ion and qualifier ion monitoring.Results:The standard curve was linear between 2～60 ng.mL-1 and the minimum detection limit was 1 ng.mL-1.The recovery of perlolyrine in plasma was above 82% and the relative standard deviation (RSD) less than 9.0%.Conclusion:It provided an important method for the determination of clinical pharmacokinetics.
, 百拇医药
Key words perlolyrine,pharmacokinetics,GC-MS
川芎哚(川芎Ⅲ号碱，perlolyrine)是中药川芎(Ligusticum wallichii Franch)中的一种有效活性生物碱，其化学结构为1-(5-羟甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3，4-b]吲哚[1,2],药理实验证明川芎哚对冠心病有一定的疗效作用[3]。为了探讨川芎哚在动物体内的代谢动力学，本文建立了灵敏度高，特异性好的GC-MS选择离子(SIM)外标方法，该方法由MS化学工作站监测川芎哚的靶离子(Target Ion)和辅助定量离子(Qualifier Ion)[4]，其灵敏度可达1 ng.mL-1。该法适于川芎哚动物体内药代动力学参数的测定，同时也为川芎哚临床药代动力学研究提供了重要的方法。
1 仪器与试药
, 百拇医药
1.1 仪器 HP-5890Ⅱ/5971A型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)。
1.2 试药 川芎哚、[2-15N]-1-(5-羟甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚([2-15N]川芎哚)(自制)；N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)(Gemany 产，分析纯)；缓冲溶液：0.2 mol.mL-1碳酸钠-0.2 mol.L-1硼酸(含0.2 mol.L-1氯化钾)-水(57∶43∶100)，调pH=8～9；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 实验动物 Wistar大鼠，雌雄兼用，体重(200±20)g(中国医学科学院实验动物中心)。
2 方法与结果
, http://www.100md.com
2.1 GC-MS分析条件 毛细管气相色谱柱HP-1(12 m×0.22 mm×0.33 μm)，载气：氦气，流速1.0 mL.min-1，进样口温度：250 ℃，检测器温度：280 ℃，进样方式：不分流进样，柱升温程序：起始温度70 ℃，停留1 min后，以15 ℃.min-1速率升温至300 ℃，保持15 min，进样量为1 μL，电离方式为EI，电子轰击能量为70 eV。
2.2 生物样品的制备 从大鼠颈静脉采血约3 mL，以肝素抗凝，离心分离血浆，取血浆1 mL，加入氯化钠0.5 g及碳酸钠-硼酸-氯化钾缓冲液1 mL，振荡1 min，加入抽提液乙醚-异丙醇(10∶1)1 mL，振荡5 min，离心10 min，取上清液，氮气吹干，用注射器加入MSTFA 20 μL，70 ℃反应30 min，取1 μL进样。GC-MS法对川芎哚有较好的分离鉴别效果，图1为川芎哚质谱图，川芎哚TMS衍生物的分子离子峰为m/z 336，碎片基峰为m/z 247，为提高检测灵敏度和准确度，选择m/z 247为靶离子和m/z 336为辅助定量离子。
, 百拇医药
图1 川芎哚的质谱图
2.3 标准曲线制备 用大鼠空白血浆溶液配制浓度分别为2，5，10，20，30，60 ng.mL-1的川芎哚标准溶液，按生物样品制备方法提取测定，制备标准曲线。结果表明，川芎哚在2～60 ng.mL-1范围内，响应值与浓度呈良好的线性关系，回归方程：
Y=1.24×104X-8.32×102 r=0.996 0
信噪比S/N=3时，最低检测浓度为1 ng.mL-1。
2.4 回收率试验 取大鼠空白血浆溶液配制低、中、高3种浓度(2，10，30 ng.mL-1)各5管，按上法制备样品进样，以3个浓度不经抽提为标准对照，计算回收率，得3种浓度的回收率(RSD)分别为82.52%(5.50%)；83.46%(3.69%)；87.18%(0.52%)。
, http://www.100md.com
2.5 精密度
2.5.1 日内重复性 取大鼠空白血浆溶液配制低、中、高3种浓度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制备样品进样，在1 d内分别重复进样5次，得3种浓度的日内重复性(RSD)分别为1.94 ng.mL-1(7.22%)；9.82 ng.mL-1(6.21%)；30.12 ng.mL-1(2.36%)。
2.5.2 日间重复性 取空白血浆溶液配制低、中、高3种浓度(2，10，30 ng.mL-1)，按上法制备样品进样，在5 d内分别每天1次重复进样，得3种浓度的日间重复性RSD分别为1.92 ng.mL-1(8.85%)；9.91 ng.mL-1(6.86%)；29.98 ng.mL-1(7.61%)。
, http://www.100md.com
2.6 川芎哚的血药浓度测定 36只大鼠分为9组，每组为4只大鼠，分别灌胃给予川芎哚0.5 mg.kg-1后，于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12 h时从颈静脉采血3 mL，按生物样品制备方法提取测定。大鼠灌胃后平均血药浓度-时间曲线见图2。
3 讨论
川芎哚的挥发性和热稳定性较差，直接进样由于低的挥发性和热分解，重现性差，检出灵敏度低。经MSTFA衍生化后，川芎哚衍生物有一定的挥发性和稳定性，能产生良好的色谱和质谱图，检测受其它干扰少。
图2 川芎哚的血药浓度-时间曲线
川芎哚药代动力学研究已有文献报道[3]，但使用的是放射性同位素示踪法，不适于临床药代动力学研究。本文建立的GC-MS选择离子监测，外标定量方法，专一性好，灵敏度高，可以用于临床药代动力学研究，所以本研究为川芎哚临床药代动力学研究提供了可靠的方法。但本法提取回收率和重现性不是很理想，为保证方法有较好的重现性和准确性，要不断对标准曲线进行校正，在监测靶离子(m/z 247)时，必须同时监测辅助定量离子(m/z 336)，确定2者峰高的比例范围[100∶(39.86～51.34)]，其目的是确保未知样品的检测分析在此比例范围内，从而保证结果的准确性。本法测定结果与以[2-15N]川芎哚为内标准的内标法结果基本一致。
, http://www.100md.com
参考文献
1，唐刚华，王世真，吴淑琴等.川芎哚的有机合成研究.中国药学杂志，1998，33(8)：492
2，Tang Ganghua,Wang Shihzhen,Wu Shuqin,et al.Syntheses of dl-α-15N-tryptophan and 2-15N-perlolyrine.J Labelled Compd Radiopharm,1998，41(2):139
3，华英圣，马桂华，刘丽波等.川芎Ⅲ号碱药理作用的初步研究.中医药学报，1989，(2)：40
4，乔建忠，袁淑兰，张振清.气相色谱-质谱法测定人血浆中丁螺环酮浓度.药物分析杂志，1996，16(6)：370
(本文于1999年5月2日收到), 百拇医药