RP-HPLC法测定诃子中3种可水解丹宁的含量
作者：刘延泽 丁岗 聂桂华 王文领 于丙午
单位：刘延泽(河南中医学院植化教研室 郑州 450003)；丁岗(河南省药品检验所，郑州，450003)；聂桂华(郑州大学化学系博士后流动站，郑州，450052)；王文领 于丙午(河南中医学院植化教研室 郑州 450003)
关键词：诃子；可水解丹宁；反相高效液相色谱法；诃子酸；诃黎勒酸
药物分析杂志000319 摘要 目的：建立诃子中3种可水解丹宁的高效液相色谱测定方法。方法：色谱柱为NovaPak C18，流动相为甲醇-2%冰醋酸水溶液(27∶73)，检测波长为280 nm，流速为1 mL.min-1。结果：3种可水解丹宁诃子酸(chebulinic acid，Ⅰ)，诃黎勒酸(chebulagic acid，Ⅱ)和1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖 (1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，Ⅲ)的线性范围分别为3.32～16.60 μg，3.48～17.40 μg和2.74～13.70 μg，回收率分别为100.3%，94.50 %和85.09%，精密度试验RSD分别为3.2%，3.4%和3.3%。结论：该法重现性较好，结果可靠，可为诃子药材的质量评价提供有效手段。
, http://www.100md.com
Determination of Three Hydrolyzable Tannins in the Fruits
of Terminalia chebula Retz. by RP—HPLC
Liu Yanze，Ding Gang，Ding Bingwu
(Department of Phytochemistry, He'nan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou，450003)
Nie Guihua
(He'nan Institute for Drug Control Zheng zhou 450003)
, 百拇医药 Wang Wenling(Department of Organic Chemistry, Zhengzhou University. Zhengzhou, 450052)
Abstract Objective：A RP-HPLC method was developed for the determination of three hydrolyzable tannins [chebulinic acid(Ⅰ)，chebulagic acid(Ⅱ) and 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose(Ⅲ)] in the fruits of Terminalia chebula Retz. Methods:Using a NovaPak C18 column (3.9 mm×150 mm，4 μm) in an oven at 30 ℃，with a solvent system consisting of MeOH-2%HAc(27∶73)and a UV detector at 280 nm, the flow rate was 1 mL.min-1.Results:The linear ranges of Ⅰ～Ⅲ were 3.32～16.60，3.48～17.40 and 2.74～13.70 μg respectively.The average recoveries were 100.3% (RSD=2.8%,n=5),94.50% (RSD=2.3%,n=5) and 85.09% (RSD=4.1%,n=5) respectively. The RSDs (n=5) of measurement precision test were 3.2%，3.4% and 3.3% respectively.Conclusion:The method is reproducible, dependable and useful in quality evaluation of the crude drug of Fructus Chebulae.
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Key words Terminalia chebula Retz., hydrolizable tannins, RP-HPLC, chebulinic acid，chebulagic acid
诃子为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)及其变种绒毛诃子(T. chebula Retz. var. tomentella Kurt.)的干燥成熟果实，为药典收载品种。具有良好的涩肠止泻、降火利咽、调和药性、解毒等功效，临床应用广泛，尤其在藏药和蒙药中最为常用[1]。曾有报道根据诃子中没食子酸及总丹宁含量的高低来评价其药材质量[2]，但对其中特征性丹宁成分的定量分析尚未见文献报道。根据我们研究证实，诃子酸(chebulinic acid)是诃子的主要有效成分之一，因此以诃子酸等可水解丹宁作为诃子药材质量评价指标具有较强的客观性。本文建立了诃子中3种可水解丹宁诃子酸(Ⅰ)，诃黎勒酸(chebulagic acid，Ⅱ)和1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖 (1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，Ⅲ)的反相高效液相色谱测定法，为科学评价诃子药材质量提供有效手段。
, 百拇医药
1 仪器与材料
Waters高效液相色谱仪，包括510型泵，486检测器，Rheodyne 7725i/20 μL手动进样阀，PC-800 色谱工作站。组织破碎提取器(河南中医学院等研制)[3]。对照品Ⅰ～Ⅲ及鞣料云实素(corilagin)均为作者从诃子药材中提取、分离并经光谱鉴定，HPLC法检测纯度均在95%以上。
诃子样品于1996年11月采自广西南宁，由广西壮族自治区中医药研究所覃德海副研究员鉴定为诃子(Terminalia chebula Retz.)。
甲醇(分析纯，色谱纯)，丙酮、冰醋酸(分析纯)。所有色谱用试剂均经0.45 μm微孔滤膜过滤。柱层析用吸附剂Toyopearl HW-40(C)为日本Tosoh公司产品。
2 方法与结果
, http://www.100md.com
2.1 色谱条件 色谱柱:NovaPak C18(3.9 mm×150 mm，4 μm)，保护柱(长1 cm)；流动相:甲醇-2%冰醋酸(27∶73，)；柱温:30 ℃；流速:1 mL.min-1；检测波长:280 nm。
2.2 检测波长的选择 由于对照品(Ⅰ～Ⅲ)的最大紫外吸收均在270～280 nm之间，因此选择280 nm为检测波长。
2.3 线性范围 分别准确称取Ⅰ～Ⅲ对照品1.66，1.74，1.37 mg，各置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成对照品溶液，依次以2，4，6，8，10 μL进样，作HPLC分析。以峰面积(X)为横坐标，成分含量(Y)为纵坐标，得回归方程、相关系数及线性范围(见表1，其中r均为0.999 9)。
表1 Ⅰ～Ⅲ的线性关系(n=5) 化合物
, http://www.100md.com
tR/min
回归方程
线性范围/μg
Ⅰ
10.38
Y=5.008×10-7X+9.590×10-2
3.32～16.60
Ⅱ
3.23
Y=7.728×10-7X+6.196×10-2
, 百拇医药 3.48～17.40
Ⅲ
2.01
Y=4.115×10-7X+1.201×10-1
2.74～13.70
2.4 提取方法的确定 为防止可水解丹宁水解，我们采用室温组织破碎提取法[4,5]进行提取。准确称取诃子干燥果肉1.020 g，置于高17 cm，直径5.5 cm的玻璃杯中，加入70%丙酮150 mL室温组织破碎提取1 min，静置5 min，上清液减压抽滤，杂质用蒸馏水冲洗3次，所得滤液用旋转蒸发器于60 ℃减压浓缩干至恒重，用减重法得出该次提取物重量，药渣同法再进行下一次组织破碎提取。结果，第1次提取出0.387 g，第2次提取出0.110 g，第3次提取出0.021 g，第4次提取出0.004 g。由此可见,组织破碎提取3次，已将诃子成分基本提尽。故确定采用组织破碎提取法提取3次。
, 百拇医药
2.5 样品液的制备 准确称取诃子干燥果肉粉末1 g，用70%丙酮室温组织破碎提取3次(150 mL×3)，提取液减压抽滤，杂质用少量70%丙酮冲洗3次，滤液合并，置于500 mL容量瓶中，以70%丙酮定容。精密吸取提取液100 mL，于60 ℃减压浓缩至5 mL，上Toyopearl HW-40柱(1 cm，柱长20 cm，吸附剂高10 cm)进行低压柱层析，依次用蒸馏水50 mL，5%甲醇50 mL洗脱除去杂质(HPLC分析不含被定量成分)，然后用甲醇-丙酮-水(6∶2∶2) 300 mL洗脱(至洗脱液FeCl3-铁氰化钾薄层显色反应为阴性)，所得洗脱液于60 ℃减压浓缩至干，用甲醇(色谱纯)溶解并定容于5 mL容量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样5～10 μL进行HPLC分析，如果浓度超出或低于标准曲线的线性范围，则相应地稀释或浓缩至一定体积后，再进行分析。
2.6 Toyopearl HW-40的处理 先用1 mol.L-1 NaOH 20 mL通过Toyopearl HW-40层析柱, 蒸馏水洗至中性, 再用1 mol.L-1 HCl 20mL 通过层析柱, 蒸馏水洗至中性, Toyopearl HW-40即可重新使用。
, 百拇医药
2.7 方法精密度测定 平行称取诃子干燥果肉粉末5份，按“2.5”项下方法制备样品液，进行HPLC分析，用外标2点法测得Ⅰ～Ⅲ的浓度，计算Ⅰ～Ⅲ的RSD分别为3.2%，3.4%和3.3%
2.8 稳定性试验 同一样品液在室温(约15 ℃)下，天内测定3次，天间测定3 d，Ⅰ～Ⅲ天内测定的RSD分别为0.65%，1.3%和0.94%，天间测定的RSD均为2.5%。
2.9 加样回收率试验 平行准确称取诃子干燥果肉粉末1.0g 6份，其中1份作为对照，其余5份分别准确加入一定量的对照品，按“2.5”项下方法制备样品液，测定加样回收率，结果见表2。
图1 对照品1～4(A)和诃子样品(B)的HPLC图
1. 诃子酸(tR=10.38 min) 2. 诃黎勒酸(tR=3.23 min)
, 百拇医药
3. 1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖(tR=2.01 min)
4. 鞣料云实素(tR=2.27 min)
表2 回收率试验(n=5) 化合物
平均回收率/%
RSD/%
Ⅰ
100.3
2.8
Ⅱ
94.50
2.3
, 百拇医药
Ⅲ
85.09
4.1
2.10 样品分析 按“2.5”项下方法制备样品液，进样分析，用外标2点法计算Ⅰ～Ⅲ的百分含量，测定3次，结果见表3。
表3 诃子中Ⅰ～Ⅲ的含量(n=3) 化合物
含量/%
RSD/%
Ⅰ
7.28
0.72
Ⅱ
, 百拇医药 13.06
0.16
Ⅲ
2.50
0.56
3 讨论
3.1 由于诃子干燥果肉较为坚硬，溶剂难以渗透，其中可水解丹宁成分稳定性较差，在提取过程中易分解破坏。本实验采用的室温组织破碎提取法可有效解决上述问题，且较超声提取法更为快速、有效。
3.2 制备样品液时,上Toyopearl HW-40柱可有效除去水溶性非丹宁成分[6],这样既有利于保护高效液相柱,又有利于丹宁成分的定量分析。
3.3 流动相中,甲醇的浓度变化可显著影响各成分的色谱行为。当甲醇浓度增高时，各成分的保留时间tR明显缩短；反之，则显著延长。
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3.4 本实验建立的方法能够对诃子中2种主要可水解丹宁:诃子酸、诃黎勒酸进行准确定量,为科学评价诃子药材质量提供有效手段。
3.5 由于鞣料云实素与1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖之间分离度<1.5,使后者回收率偏低,因此色谱条件还有待进一步优化。
国家九五攻关项目“中药材质量标准的规范化研究-诃子”
参考文献
1，李志恒,那生桑,赫向峰. 诃子在蒙医药中的独特应用. 中医药信息, 1994,11(4):34
2，林 励,徐鸿华,王乃规等. 不同品种及采收期诃子质量研究. 中国中药杂志，1997，22(3)：149
3，韩建海,章 琛,袁 珂等.一种用于高速硬组织捣碎机的破碎刀具.发明专利公报(中国)，ZL 94244358.6
4，刘延泽,袁 珂,冀春茹. 中草药化学成分提取的新方法-植物组织破碎提取法.河南科学, 1993, 11(4):265
5，袁珂,刘延泽,冀春茹. 中草药化学成分研究中几种不同提取方法的比较研究. 天然产物研究与开发，1997，9(4)：57
6，T Okuda,T Yoshida,T Hatano.New methods of analyzing tannins.J of Nat Prod，1989,52(1):1
(本文于1999年8月2日收到), 百拇医药
单位：刘延泽(河南中医学院植化教研室 郑州 450003)；丁岗(河南省药品检验所，郑州，450003)；聂桂华(郑州大学化学系博士后流动站，郑州，450052)；王文领 于丙午(河南中医学院植化教研室 郑州 450003)
关键词：诃子；可水解丹宁；反相高效液相色谱法；诃子酸；诃黎勒酸
药物分析杂志000319 摘要 目的：建立诃子中3种可水解丹宁的高效液相色谱测定方法。方法：色谱柱为NovaPak C18，流动相为甲醇-2%冰醋酸水溶液(27∶73)，检测波长为280 nm，流速为1 mL.min-1。结果：3种可水解丹宁诃子酸(chebulinic acid，Ⅰ)，诃黎勒酸(chebulagic acid，Ⅱ)和1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖 (1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，Ⅲ)的线性范围分别为3.32～16.60 μg，3.48～17.40 μg和2.74～13.70 μg，回收率分别为100.3%，94.50 %和85.09%，精密度试验RSD分别为3.2%，3.4%和3.3%。结论：该法重现性较好，结果可靠，可为诃子药材的质量评价提供有效手段。
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Determination of Three Hydrolyzable Tannins in the Fruits
of Terminalia chebula Retz. by RP—HPLC
Liu Yanze，Ding Gang，Ding Bingwu
(Department of Phytochemistry, He'nan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou，450003)
Nie Guihua
(He'nan Institute for Drug Control Zheng zhou 450003)
, 百拇医药 Wang Wenling(Department of Organic Chemistry, Zhengzhou University. Zhengzhou, 450052)
Abstract Objective：A RP-HPLC method was developed for the determination of three hydrolyzable tannins [chebulinic acid(Ⅰ)，chebulagic acid(Ⅱ) and 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose(Ⅲ)] in the fruits of Terminalia chebula Retz. Methods:Using a NovaPak C18 column (3.9 mm×150 mm，4 μm) in an oven at 30 ℃，with a solvent system consisting of MeOH-2%HAc(27∶73)and a UV detector at 280 nm, the flow rate was 1 mL.min-1.Results:The linear ranges of Ⅰ～Ⅲ were 3.32～16.60，3.48～17.40 and 2.74～13.70 μg respectively.The average recoveries were 100.3% (RSD=2.8%,n=5),94.50% (RSD=2.3%,n=5) and 85.09% (RSD=4.1%,n=5) respectively. The RSDs (n=5) of measurement precision test were 3.2%，3.4% and 3.3% respectively.Conclusion:The method is reproducible, dependable and useful in quality evaluation of the crude drug of Fructus Chebulae.
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Key words Terminalia chebula Retz., hydrolizable tannins, RP-HPLC, chebulinic acid，chebulagic acid
诃子为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)及其变种绒毛诃子(T. chebula Retz. var. tomentella Kurt.)的干燥成熟果实，为药典收载品种。具有良好的涩肠止泻、降火利咽、调和药性、解毒等功效，临床应用广泛，尤其在藏药和蒙药中最为常用[1]。曾有报道根据诃子中没食子酸及总丹宁含量的高低来评价其药材质量[2]，但对其中特征性丹宁成分的定量分析尚未见文献报道。根据我们研究证实，诃子酸(chebulinic acid)是诃子的主要有效成分之一，因此以诃子酸等可水解丹宁作为诃子药材质量评价指标具有较强的客观性。本文建立了诃子中3种可水解丹宁诃子酸(Ⅰ)，诃黎勒酸(chebulagic acid，Ⅱ)和1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖 (1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，Ⅲ)的反相高效液相色谱测定法，为科学评价诃子药材质量提供有效手段。
, 百拇医药
1 仪器与材料
Waters高效液相色谱仪，包括510型泵，486检测器，Rheodyne 7725i/20 μL手动进样阀，PC-800 色谱工作站。组织破碎提取器(河南中医学院等研制)[3]。对照品Ⅰ～Ⅲ及鞣料云实素(corilagin)均为作者从诃子药材中提取、分离并经光谱鉴定，HPLC法检测纯度均在95%以上。
诃子样品于1996年11月采自广西南宁，由广西壮族自治区中医药研究所覃德海副研究员鉴定为诃子(Terminalia chebula Retz.)。
甲醇(分析纯，色谱纯)，丙酮、冰醋酸(分析纯)。所有色谱用试剂均经0.45 μm微孔滤膜过滤。柱层析用吸附剂Toyopearl HW-40(C)为日本Tosoh公司产品。
2 方法与结果
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2.1 色谱条件 色谱柱:NovaPak C18(3.9 mm×150 mm，4 μm)，保护柱(长1 cm)；流动相:甲醇-2%冰醋酸(27∶73，)；柱温:30 ℃；流速:1 mL.min-1；检测波长:280 nm。
2.2 检测波长的选择 由于对照品(Ⅰ～Ⅲ)的最大紫外吸收均在270～280 nm之间，因此选择280 nm为检测波长。
2.3 线性范围 分别准确称取Ⅰ～Ⅲ对照品1.66，1.74，1.37 mg，各置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成对照品溶液，依次以2，4，6，8，10 μL进样，作HPLC分析。以峰面积(X)为横坐标，成分含量(Y)为纵坐标，得回归方程、相关系数及线性范围(见表1，其中r均为0.999 9)。
表1 Ⅰ～Ⅲ的线性关系(n=5) 化合物
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tR/min
回归方程
线性范围/μg
Ⅰ
10.38
Y=5.008×10-7X+9.590×10-2
3.32～16.60
Ⅱ
3.23
Y=7.728×10-7X+6.196×10-2
, 百拇医药 3.48～17.40
Ⅲ
2.01
Y=4.115×10-7X+1.201×10-1
2.74～13.70
2.4 提取方法的确定 为防止可水解丹宁水解，我们采用室温组织破碎提取法[4,5]进行提取。准确称取诃子干燥果肉1.020 g，置于高17 cm，直径5.5 cm的玻璃杯中，加入70%丙酮150 mL室温组织破碎提取1 min，静置5 min，上清液减压抽滤，杂质用蒸馏水冲洗3次，所得滤液用旋转蒸发器于60 ℃减压浓缩干至恒重，用减重法得出该次提取物重量，药渣同法再进行下一次组织破碎提取。结果，第1次提取出0.387 g，第2次提取出0.110 g，第3次提取出0.021 g，第4次提取出0.004 g。由此可见,组织破碎提取3次，已将诃子成分基本提尽。故确定采用组织破碎提取法提取3次。
, 百拇医药
2.5 样品液的制备 准确称取诃子干燥果肉粉末1 g，用70%丙酮室温组织破碎提取3次(150 mL×3)，提取液减压抽滤，杂质用少量70%丙酮冲洗3次，滤液合并，置于500 mL容量瓶中，以70%丙酮定容。精密吸取提取液100 mL，于60 ℃减压浓缩至5 mL，上Toyopearl HW-40柱(1 cm，柱长20 cm，吸附剂高10 cm)进行低压柱层析，依次用蒸馏水50 mL，5%甲醇50 mL洗脱除去杂质(HPLC分析不含被定量成分)，然后用甲醇-丙酮-水(6∶2∶2) 300 mL洗脱(至洗脱液FeCl3-铁氰化钾薄层显色反应为阴性)，所得洗脱液于60 ℃减压浓缩至干，用甲醇(色谱纯)溶解并定容于5 mL容量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样5～10 μL进行HPLC分析，如果浓度超出或低于标准曲线的线性范围，则相应地稀释或浓缩至一定体积后，再进行分析。
2.6 Toyopearl HW-40的处理 先用1 mol.L-1 NaOH 20 mL通过Toyopearl HW-40层析柱, 蒸馏水洗至中性, 再用1 mol.L-1 HCl 20mL 通过层析柱, 蒸馏水洗至中性, Toyopearl HW-40即可重新使用。
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2.7 方法精密度测定 平行称取诃子干燥果肉粉末5份，按“2.5”项下方法制备样品液，进行HPLC分析，用外标2点法测得Ⅰ～Ⅲ的浓度，计算Ⅰ～Ⅲ的RSD分别为3.2%，3.4%和3.3%
2.8 稳定性试验 同一样品液在室温(约15 ℃)下，天内测定3次，天间测定3 d，Ⅰ～Ⅲ天内测定的RSD分别为0.65%，1.3%和0.94%，天间测定的RSD均为2.5%。
2.9 加样回收率试验 平行准确称取诃子干燥果肉粉末1.0g 6份，其中1份作为对照，其余5份分别准确加入一定量的对照品，按“2.5”项下方法制备样品液，测定加样回收率，结果见表2。
图1 对照品1～4(A)和诃子样品(B)的HPLC图
1. 诃子酸(tR=10.38 min) 2. 诃黎勒酸(tR=3.23 min)
, 百拇医药
3. 1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖(tR=2.01 min)
4. 鞣料云实素(tR=2.27 min)
表2 回收率试验(n=5) 化合物
平均回收率/%
RSD/%
Ⅰ
100.3
2.8
Ⅱ
94.50
2.3
, 百拇医药
Ⅲ
85.09
4.1
2.10 样品分析 按“2.5”项下方法制备样品液，进样分析，用外标2点法计算Ⅰ～Ⅲ的百分含量，测定3次，结果见表3。
表3 诃子中Ⅰ～Ⅲ的含量(n=3) 化合物
含量/%
RSD/%
Ⅰ
7.28
0.72
Ⅱ
, 百拇医药 13.06
0.16
Ⅲ
2.50
0.56
3 讨论
3.1 由于诃子干燥果肉较为坚硬，溶剂难以渗透，其中可水解丹宁成分稳定性较差，在提取过程中易分解破坏。本实验采用的室温组织破碎提取法可有效解决上述问题，且较超声提取法更为快速、有效。
3.2 制备样品液时,上Toyopearl HW-40柱可有效除去水溶性非丹宁成分[6],这样既有利于保护高效液相柱,又有利于丹宁成分的定量分析。
3.3 流动相中,甲醇的浓度变化可显著影响各成分的色谱行为。当甲醇浓度增高时，各成分的保留时间tR明显缩短；反之，则显著延长。
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3.4 本实验建立的方法能够对诃子中2种主要可水解丹宁:诃子酸、诃黎勒酸进行准确定量,为科学评价诃子药材质量提供有效手段。
3.5 由于鞣料云实素与1，3，6-三-O-没食子酰基葡萄糖之间分离度<1.5,使后者回收率偏低,因此色谱条件还有待进一步优化。
国家九五攻关项目“中药材质量标准的规范化研究-诃子”
参考文献
1，李志恒,那生桑,赫向峰. 诃子在蒙医药中的独特应用. 中医药信息, 1994,11(4):34
2，林 励,徐鸿华,王乃规等. 不同品种及采收期诃子质量研究. 中国中药杂志，1997，22(3)：149
3，韩建海,章 琛,袁 珂等.一种用于高速硬组织捣碎机的破碎刀具.发明专利公报(中国)，ZL 94244358.6
4，刘延泽,袁 珂,冀春茹. 中草药化学成分提取的新方法-植物组织破碎提取法.河南科学, 1993, 11(4):265
5，袁珂,刘延泽,冀春茹. 中草药化学成分研究中几种不同提取方法的比较研究. 天然产物研究与开发，1997，9(4)：57
6，T Okuda,T Yoshida,T Hatano.New methods of analyzing tannins.J of Nat Prod，1989,52(1):1
(本文于1999年8月2日收到), 百拇医药
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