HPLC法测定帕司烟肼片中对氨基水杨酸和异烟肼的含量
作者：程辉跃
单位：程辉跃(重庆市药品检验所 400015)
关键词：帕司烟肼；对氨基水杨酸；异烟肼；HPLC
药物分析杂志000318 摘要 目的：用HPLC法测定帕司烟肼片中对氨基水杨酸和异烟肼的含量。方法：以ODS为固定相，流动相为0.05%十二烷基硫酸钠-甲醇(7∶1，含0.2%醋酸钠)，检测波长为254 nm，采用外标法。结果：对氨基水杨酸、异烟肼的线性范围分别为0.21～1.2 μg和0.18～1.1 μg，回收率分别为100.1%和100.5%。结论：本法结果准确，重现性好，以此法测定帕司烟肼的含量，更具合理性，能有效地控制质量。
Determination of Aminosalicylic Acid and Isoniazid
in Pasiniazide Tablets by HPLC
, 百拇医药
Cheng Huiyue
(Chongqing Institute for Drug Control,Chongqing 400015)
Abstract Objective：Aminosalicylic acid and isoniazid were determined by HPLC in pasiniazide tablet.Methods:SHIMADZU ODS(10 cm×4.6 mm,5 μm),the mobile phase constisted of 0.05% sodium dodecyl sulphate-methanol(7∶1,with 0.2% sodium acetate).Detection was done at 254 nm,external standard method.Results:The calibration curves were linear in the range of 0.21～1.2 μg for aminosalicylic acid and 0.18～1.1 μg for isoniazid.The average recoveries(n=5)of aminosalicylic acid and isoniazid were 100.1%(RSD=1.1%)and 100.5%(RSD=0.9%),respectively.Conclusion:This method is accurate,good repeatability and is very suitable for the quality control pasiniazide tablet.
, 百拇医药
Key words pasiniazide,aminosalicylic acid,isoniazid,HPLC
帕司烟肼(原名百生肼)为治疗肺结核的药物，其制法为等摩尔的对氨基水杨酸和异烟肼在热稀乙醇中冷却结晶而得，为异烟肼的衍生物[1]，其抗结核效果是基于其中所含的异烟肼，口服后在胃肠道迅速分解为对氨基水杨酸和异烟肼，分子中的对氨基水杨酸可阻止异烟肼在体内的乙酰化，从而加强异烟肼的抗结核作用。比单纯的异烟肼或异烟肼加高剂量的对氨基水杨酸混合治疗效果优越。原片剂质量标准[2，3]含量测定为高氯酸滴定，不能有效地控制本品的质量。本文采用HPLC法，分别测定了其中的对氨基水杨酸和异烟肼的含量。
1 试药与仪器
帕司烟肼片、对氨基水杨酸和异烟肼对照品均由重庆华邦制药有限公司提供(对氨基水杨酸、异烟肼经高效液相色谱面积归一化法测定，含量分别为99.2%和99.3%)，水为二次蒸馏水，其余试剂均为国产分析纯。
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高效液相色谱仪包括岛津LC-10AD，SPD-10A检测器，C-R3A处理机，Spectra System UV6000LP二极管阵列检测器及色谱工作站。
2 色谱条件
色谱柱：Shimadzu CLC-ODS(10 cm×4.6 mm,5 μm)；流动相：0.05%十二烷基硫酸钠-甲醇(7∶1，含0.2%醋酸钠)，流速：1 mL.min-1。检测波长：254 nm。
3 测定条件
3.1 系统适用性试验 分别取对氨基水杨酸和异烟肼对照品适量，用流动相配制成均为4 μg.mL-1的溶液，按照上述色谱条件进样20 μL，理论板数以对氨基水杨酸计为1 670，与异烟肼的分离度为5.5。
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3.2 流动相的选择 比较不同的pH的醋酸盐、磷酸盐缓冲液-甲醇，十二烷基硫酸钠-甲醇等系统，以十二烷基硫酸钠-甲醇为流动相分离效果为好，加入醋酸钠可改变对氨基水杨酸的保留时间及与异烟肼的分离度。HPLC图谱见图1。由图1-C可知，辅料对样品测定无干扰。经UV-6000LP检测器扫描图谱与对照品的紫外光吸收图谱比较，结果一致。
图1 样品(A)、对照品(B)、空白辅料(C)色谱图
1.对氨基水杨酸(6 min) 2.异烟肼(9.5 min)
3.杂质(12 min)
3.2 检测波长的选择 对氨基水杨酸和异烟肼的UV图中(以流动相为溶剂)，最大吸收波长分别为269 nm和263 nm，参照美国药典Ⅹ [4]版异烟肼制剂的HPLC测定及有关资料[5，6]，并根据试验结果，选择254 nm为检测波长，使2成分的色谱峰相匹配。
, 百拇医药
3.4 线性关系 取对氨基水杨酸、异烟肼对照品约50 mg，精密称定，用甲醇适量溶解，并稀释至50 mL。吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL于50 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀。按上述色谱条件分别进样20 μL，测定峰面积，以峰面积对对照品量(μg)进行回归分析，得到2条过原点的直线，对氨基水杨酸、异烟肼的线性范围分别为0.21～1.2 μg和0.18～1.1 μg。回归方程(n=6)分别为：
Y=1.81×106+1.23×106X r=0.999 9
Y=1.83×104+5.71×106X r=1.000 0
3.5 回收率 取已知含量的样品细粉5份(约相当于帕司烟肼0.1 g)，精密称定，置50 mL量瓶中，分别加入对氨基水杨酸和异烟肼对照品各2 mg，照样品测定项下的方法分别测定含量，计算对氨基水杨酸、异烟肼的回收率分别为100.1%和100.5%，RSD分别为1.1%和0.9%。
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3.6 精密度试验 取“3.4”项下溶液连续进样6次，每次进样20 μL，测得的对氨基水杨酸、异烟肼峰面积的RSD分别为0.11%和0.98%。
3.7 重复性试验 取同一批号供试品6份(约相当于帕司烟肼0.1 g)，精密称定，按照样品测定项下的方法分别测定对氨基水杨酸和异烟肼的含量，RSD分别为1.0%和1.1%，表明本法重现性较好。
3.8 样品溶液稳定性试验 取同一份样品溶液分别在0，6，12，24 h分别进样测定，样品峰面积基本不变，对氨基水杨酸和异烟肼的RSD分别为0.8%和0.6%。
4 样品测定
取本品20片精密称定，研细，称取细粉适量(约相当于帕司烟肼0.1 g)，加入甲醇适量，振摇使溶解，并稀释至50 mL。滤过，精密量取续滤液2.0 mL，于50 mL量瓶中，加流动相至刻度。取20 μL进行色谱分析。
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用本法和高氯酸滴定法[2，3]对3批样品进行了测定，结果见表1。
表1 样品测定结果(标示量%，n=4) 批号
本法
高氯酸滴定法
对氨基水杨酸
异烟肼
合计
981206P
51.3(0.6)
44.3(0.7)
94.8
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103.5
981205d
51.2(0.9)
44.7(0.6)
95.2
105.9
981201
52.8(1.0)
46.0(0.8)
98.8
100.0
注：括号内为RSD(%)值。
, 百拇医药
5 讨论
5.1 在十二烷基硫酸钠和醋酸钠的浓度恒定的情况下，随甲醇比例的增加，对氨基水杨酸和异烟肼的保留时间及分离度均减小(见图2，流动相其余部分为0.05%的十二烷基硫酸钠和0.2%的醋酸钠水溶液)。流动相中加入一定量的醋酸钠，可以延长对氨基水杨酸的保留时间，以及减小与异烟肼的分离度，本试验中醋酸钠的浓度为0.2%，对氨基水杨酸和异烟肼的分离度为5.5，并能将杂质完全分离，符合高效液相色谱的要求。
图2 不同浓度的甲醇对异烟肼(1)和
对氨基水杨酸(2)保留时间的影响
5.2 帕司烟肼是由等摩尔的对氨基水杨酸和异烟肼在热稀乙醇中结晶而得，理论上对氨基水杨酸、异烟肼各占帕司烟肼的52.75%和47.25%，根据测定样品对氨基水杨酸和异烟肼的含量，均表明对氨基水杨酸过量，并且均较原标准高氯酸滴定测定的含量结果低。故采用HPLC法分别测定对氨基水杨酸和异烟肼的含量，以确定帕司烟肼的含量，更具合理性。
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参考文献
1，王泽民主编.当代结构药物全集.上册.北京科学出版社，1993.665
2，北京市药品标准.1996.75
3，川卫药发(1995)字第277号文附发质量标准
4，USP.ⅩⅩⅢ.845
5，庞青云.反相高效液相色谱法同时测定利福烟胺片中利福平、异烟肼和吡嗪酰胺的含量.药物分析杂志，1998，18(4)：259
6，杨德柱，隋广志.高效液相色谱法测定异烟肼固体制剂血药浓度.黑龙江医药，1996，9(2)：68
(本文于1999年4月27日收到), 百拇医药
单位：程辉跃(重庆市药品检验所 400015)
关键词：帕司烟肼；对氨基水杨酸；异烟肼；HPLC
药物分析杂志000318 摘要 目的：用HPLC法测定帕司烟肼片中对氨基水杨酸和异烟肼的含量。方法：以ODS为固定相，流动相为0.05%十二烷基硫酸钠-甲醇(7∶1，含0.2%醋酸钠)，检测波长为254 nm，采用外标法。结果：对氨基水杨酸、异烟肼的线性范围分别为0.21～1.2 μg和0.18～1.1 μg，回收率分别为100.1%和100.5%。结论：本法结果准确，重现性好，以此法测定帕司烟肼的含量，更具合理性，能有效地控制质量。
Determination of Aminosalicylic Acid and Isoniazid
in Pasiniazide Tablets by HPLC
, 百拇医药
Cheng Huiyue
(Chongqing Institute for Drug Control,Chongqing 400015)
Abstract Objective：Aminosalicylic acid and isoniazid were determined by HPLC in pasiniazide tablet.Methods:SHIMADZU ODS(10 cm×4.6 mm,5 μm),the mobile phase constisted of 0.05% sodium dodecyl sulphate-methanol(7∶1,with 0.2% sodium acetate).Detection was done at 254 nm,external standard method.Results:The calibration curves were linear in the range of 0.21～1.2 μg for aminosalicylic acid and 0.18～1.1 μg for isoniazid.The average recoveries(n=5)of aminosalicylic acid and isoniazid were 100.1%(RSD=1.1%)and 100.5%(RSD=0.9%),respectively.Conclusion:This method is accurate,good repeatability and is very suitable for the quality control pasiniazide tablet.
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Key words pasiniazide,aminosalicylic acid,isoniazid,HPLC
帕司烟肼(原名百生肼)为治疗肺结核的药物，其制法为等摩尔的对氨基水杨酸和异烟肼在热稀乙醇中冷却结晶而得，为异烟肼的衍生物[1]，其抗结核效果是基于其中所含的异烟肼，口服后在胃肠道迅速分解为对氨基水杨酸和异烟肼，分子中的对氨基水杨酸可阻止异烟肼在体内的乙酰化，从而加强异烟肼的抗结核作用。比单纯的异烟肼或异烟肼加高剂量的对氨基水杨酸混合治疗效果优越。原片剂质量标准[2，3]含量测定为高氯酸滴定，不能有效地控制本品的质量。本文采用HPLC法，分别测定了其中的对氨基水杨酸和异烟肼的含量。
1 试药与仪器
帕司烟肼片、对氨基水杨酸和异烟肼对照品均由重庆华邦制药有限公司提供(对氨基水杨酸、异烟肼经高效液相色谱面积归一化法测定，含量分别为99.2%和99.3%)，水为二次蒸馏水，其余试剂均为国产分析纯。
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高效液相色谱仪包括岛津LC-10AD，SPD-10A检测器，C-R3A处理机，Spectra System UV6000LP二极管阵列检测器及色谱工作站。
2 色谱条件
色谱柱：Shimadzu CLC-ODS(10 cm×4.6 mm,5 μm)；流动相：0.05%十二烷基硫酸钠-甲醇(7∶1，含0.2%醋酸钠)，流速：1 mL.min-1。检测波长：254 nm。
3 测定条件
3.1 系统适用性试验 分别取对氨基水杨酸和异烟肼对照品适量，用流动相配制成均为4 μg.mL-1的溶液，按照上述色谱条件进样20 μL，理论板数以对氨基水杨酸计为1 670，与异烟肼的分离度为5.5。
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3.2 流动相的选择 比较不同的pH的醋酸盐、磷酸盐缓冲液-甲醇，十二烷基硫酸钠-甲醇等系统，以十二烷基硫酸钠-甲醇为流动相分离效果为好，加入醋酸钠可改变对氨基水杨酸的保留时间及与异烟肼的分离度。HPLC图谱见图1。由图1-C可知，辅料对样品测定无干扰。经UV-6000LP检测器扫描图谱与对照品的紫外光吸收图谱比较，结果一致。
图1 样品(A)、对照品(B)、空白辅料(C)色谱图
1.对氨基水杨酸(6 min) 2.异烟肼(9.5 min)
3.杂质(12 min)
3.2 检测波长的选择 对氨基水杨酸和异烟肼的UV图中(以流动相为溶剂)，最大吸收波长分别为269 nm和263 nm，参照美国药典Ⅹ [4]版异烟肼制剂的HPLC测定及有关资料[5，6]，并根据试验结果，选择254 nm为检测波长，使2成分的色谱峰相匹配。
, 百拇医药
3.4 线性关系 取对氨基水杨酸、异烟肼对照品约50 mg，精密称定，用甲醇适量溶解，并稀释至50 mL。吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL于50 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀。按上述色谱条件分别进样20 μL，测定峰面积，以峰面积对对照品量(μg)进行回归分析，得到2条过原点的直线，对氨基水杨酸、异烟肼的线性范围分别为0.21～1.2 μg和0.18～1.1 μg。回归方程(n=6)分别为：
Y=1.81×106+1.23×106X r=0.999 9
Y=1.83×104+5.71×106X r=1.000 0
3.5 回收率 取已知含量的样品细粉5份(约相当于帕司烟肼0.1 g)，精密称定，置50 mL量瓶中，分别加入对氨基水杨酸和异烟肼对照品各2 mg，照样品测定项下的方法分别测定含量，计算对氨基水杨酸、异烟肼的回收率分别为100.1%和100.5%，RSD分别为1.1%和0.9%。
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3.6 精密度试验 取“3.4”项下溶液连续进样6次，每次进样20 μL，测得的对氨基水杨酸、异烟肼峰面积的RSD分别为0.11%和0.98%。
3.7 重复性试验 取同一批号供试品6份(约相当于帕司烟肼0.1 g)，精密称定，按照样品测定项下的方法分别测定对氨基水杨酸和异烟肼的含量，RSD分别为1.0%和1.1%，表明本法重现性较好。
3.8 样品溶液稳定性试验 取同一份样品溶液分别在0，6，12，24 h分别进样测定，样品峰面积基本不变，对氨基水杨酸和异烟肼的RSD分别为0.8%和0.6%。
4 样品测定
取本品20片精密称定，研细，称取细粉适量(约相当于帕司烟肼0.1 g)，加入甲醇适量，振摇使溶解，并稀释至50 mL。滤过，精密量取续滤液2.0 mL，于50 mL量瓶中，加流动相至刻度。取20 μL进行色谱分析。
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用本法和高氯酸滴定法[2，3]对3批样品进行了测定，结果见表1。
表1 样品测定结果(标示量%，n=4) 批号
本法
高氯酸滴定法
对氨基水杨酸
异烟肼
合计
981206P
51.3(0.6)
44.3(0.7)
94.8
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103.5
981205d
51.2(0.9)
44.7(0.6)
95.2
105.9
981201
52.8(1.0)
46.0(0.8)
98.8
100.0
注：括号内为RSD(%)值。
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5 讨论
5.1 在十二烷基硫酸钠和醋酸钠的浓度恒定的情况下，随甲醇比例的增加，对氨基水杨酸和异烟肼的保留时间及分离度均减小(见图2，流动相其余部分为0.05%的十二烷基硫酸钠和0.2%的醋酸钠水溶液)。流动相中加入一定量的醋酸钠，可以延长对氨基水杨酸的保留时间，以及减小与异烟肼的分离度，本试验中醋酸钠的浓度为0.2%，对氨基水杨酸和异烟肼的分离度为5.5，并能将杂质完全分离，符合高效液相色谱的要求。
图2 不同浓度的甲醇对异烟肼(1)和
对氨基水杨酸(2)保留时间的影响
5.2 帕司烟肼是由等摩尔的对氨基水杨酸和异烟肼在热稀乙醇中结晶而得，理论上对氨基水杨酸、异烟肼各占帕司烟肼的52.75%和47.25%，根据测定样品对氨基水杨酸和异烟肼的含量，均表明对氨基水杨酸过量，并且均较原标准高氯酸滴定测定的含量结果低。故采用HPLC法分别测定对氨基水杨酸和异烟肼的含量，以确定帕司烟肼的含量，更具合理性。
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参考文献
1，王泽民主编.当代结构药物全集.上册.北京科学出版社，1993.665
2，北京市药品标准.1996.75
3，川卫药发(1995)字第277号文附发质量标准
4，USP.ⅩⅩⅢ.845
5，庞青云.反相高效液相色谱法同时测定利福烟胺片中利福平、异烟肼和吡嗪酰胺的含量.药物分析杂志，1998，18(4)：259
6，杨德柱，隋广志.高效液相色谱法测定异烟肼固体制剂血药浓度.黑龙江医药，1996，9(2)：68
(本文于1999年4月27日收到), 百拇医药