血浆中单硝酸异山梨酯的高效液相色谱法测定
作者：秦永平 邹远高 梁茂植 黄英 余勤 王建新
单位：秦永平 邹远高 梁茂植 黄英 余勤 王建新(华西医科大学附属第一医院临床药理研究室 成都 610041)
关键词：单硝酸异山梨酯；高效液相色谱法；血药浓度
药物分析杂志000308 摘要 目的：建立了高效液相色谱法测定血浆中单硝酸异山梨酯浓度。方法：采用硅胶分析柱,以二氯甲烷-正己烷-乙腈-甲醇(92∶4∶1.5∶2.5)为流动相,卡马西平作内标。样品在碱性条件下用二氯甲烷萃取浓集后进样, 234 nm波长下检测,按内标法定量。结果：标准曲线在25～1600 μg.L-1范围内有良好线性，最低检测浓度为10 μg.L-1，方法回收率为96%～104%，日内RSD小于4.5%，日间RSD小于5%。结论：本法具有快速简便，灵敏准确等特点，已用于单硝酸异山梨酯缓释制剂生物利用度测定，结果良好。
, 百拇医药
Determination of isosorbide-5-mononitrate in Human Plasma
by HPLC with UV Detection
Qin Yongping，Zou Yuangao，Liang Maozhi，Huang Ying，Yu Qin，Wang Jianxin
(Institute of Clinical Pharmacology,First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract Objective：This paper establishes a high performance liquid chromatography for the determination of isosorbide-5-mononitrate(ISMN) in human plasma using carbamazepine as the internal standard.Method:a variable wavelength UV detector and Nuclbosil 5 silica 100A column(250 mm×4.6 mm, 5 μm ) were used. The alkalinized plasma sample was extracted with 3.0 mL methylene chloride . After evaporation of the organic layer, the residue was dissolved in mobile phase and injected onto a column. The mobile phase of methylene chloride-hexane-acetonitrile-methanol(92∶4∶1.5∶2.5) was pumped at 2.0 mL.min-1 through the column. The detector at 0.005 AUFS was set at 234 nm.Results:The retention times for ISMN and carbamazepine were 6.4 min and 7.0 min respectively. Standard curve was linear in the concentration range of 25 to 1 600 μg.L-1. The detection limit in plasma was 10 μg.L-1; and method recovery was 96%～104%; within day RSD less than 4.5%; inter-day RSD less than 5%.Conclusion:This method was found to be simple, rapid, sensitive and accurate for determination of ISMN in human plasma.
, 百拇医药
Key words isosorbide-5-mononitrate，HPLC，plasma concentration
单硝酸异山梨酯(ISMN)为硝酸异山梨酯的主要活性代谢产物,可通过扩张外周血管、特别是增加静脉血容量,减少回心血量、降低心脏前后负荷而减少心肌耗氧量,同时还可通过促进心肌血流重新分布而改善缺血区血流供应。ISMN与硝酸异山梨酯相比除药理活性相同外,还具有吸收迅速、作用持久、没有首过效应。目前ISMN的普通片剂已广泛应用于临床,为考察ISMN控释片的相对生物利用度及了解药代动力学参数,本文建立了测定血浆中ISMN的高效液相色谱法。有关血中ISMN测定，文献报道均用气相色谱-电子捕获法[1～3]，高效液相色谱法仅见制剂中ISMN含量及杂质测定[4，5]。
1 仪器与试药
1.1 仪器与色谱条件 Waters 680型(包括486可变波长紫外检测器, 510型高压泵,7725型进样阀),使用Nuclbosil 5 silica 100A(250 mm×4.6 mm,5 μm，大于20 000塔板)不锈钢分析柱,岛津C-R7Ae型色谱数据处理机。以二氯甲烷-正己烷-乙腈-甲醇(92∶4∶1.5∶2.5)为流动相, 流速1.0 mL.min-1,检测器波长234 nm,灵敏度为0.005 AUFS。
, 百拇医药
1.2 药品与试剂 ISMN由成都华西药业有限公司提供(山东省医药工业研究所生产), 纯度100.3%;内标用卡马西平(中国药品生物制品检定所)。二氯甲烷(分析纯,用前经纯化处理并重蒸馏),乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
1.3 标准溶液 准确称取ISMN 10.0 mg及卡马西平10.0 mg, 分别置于2个50 mL容量瓶中,加乙腈溶解并定容至刻度即成ISMN和内标卡马西平贮备液(200 mg.L-1),-20 ℃保存可稳定2个月,临用时将贮备液用重蒸水稀释至所需浓度,即得ISMN系列工作液(8 000,4 000, 2 000, 1 000, 500, 250, 125 μg.L-1)和内标稀释液(126 μg.L-1)。
2 方法与结果
, 百拇医药 2.1 标准曲线 取正常人空白血浆各0.5 mL共7份, 分别加入ISMN标准系列工作液100 μL,使各管血浆浓度分别为1 600，800，400，200，100，50，25 μg.L-1,再分别加入内标稀释液100 μL, 0.25 mol.L-1氢氧化钠溶液100 μL, 混匀后用二氯甲烷3.0 mL涡旋混合萃取3 min, 离心(3 000 r.min-1)5 min, 负压吸弃上层液,倾二氯甲烷于尖底试管内,于40 ℃水浴中通空气流挥干, 残渣溶于100 μL流动相,进样50 μL。由ISMN与卡马西平的峰高比(Y)对ISMN浓度(X)作标准曲线, 计算得回归方程为:
Y=0.001 289 X-0.000 129 r=0.999 1
表明在血药浓度25～1 600 μg.L-1范围内有良好线性关系。
, 百拇医药
2.2 样品测定 取受试者血浆样品 0.5 mL, 加入重蒸水100 μL, 按标准曲线制备项下操作, 在标准曲线上求出各样品中ISMN浓度。
2.3 保留时间及检测限 空白及样品血浆色谱图见图1,ISMN及内标卡马西平的保留时间分别为6.4 min(16 000塔板)和7.0 min(分离度为2.2)。ISMN的最低检出量为2 ng, 最低检出浓度为10 μg.L-1(以信噪比≥3计)。
2.4 方法精密度 取含ISMN高、中、低3种浓度的样品,于同日内连续测定5次,RSD分别为3.4%，4.3%，3.1%; 2周内重复测定5次, RSD分别为4.8%，4.2%，4.2%。
2.5 方法回收率 取空白血浆3份, 配成含ISMN高、中、低3种浓度的样品，每个浓度样品分成5份按前述样品测定法测定, 计算方法回收率, 结果见表1。
, 百拇医药
图1 色谱图
a.空白 b.正常人口服ISMN控释胶囊50 mg后5 h
1.ISMN 2.内标卡马西平
表1 方法回收率 加入量
/μg.L-1
测得量/μg.L-1
平均回收率
±RSD/%
1
2
3
, 百拇医药
4
5
50
48.3
47.4
50.0
51.1
50.6
99.0±3.4
200
191
205
200
, 百拇医药
206
210
101.2±3.7
800
767
786
799
841
800
99.0±3.1
3 讨论
3.1 色谱柱选择 ISMN极性较大，用烷基柱和氰基柱测定时，所用流动相中水相比例高，前述提取法处理的样品进样杂质峰保留时间长，改用硅胶柱后，杂质大多在5 min内出峰，不干扰测定，且药物峰峰形好，有利于提高检测灵敏度。
, 百拇医药
3.2 检测波长选择 ISMN无明显紫外吸收峰，仅在近紫外区有吸收(见图2)，为提高检测灵敏度，检测波长应越短越好，但由于流动相所用二氯甲烷在近紫外区吸收明显增高,综合二者因素，本文采用234 nm测定既不使流动相本底吸收太高(本底吸收值0.50)，又能达到测定血浆中ISMN灵敏度要求。
图2 ISMN紫外吸收曲线
40 mg.L-1甲醇-水(1∶4)溶液
3.3 萃取条件选择 按赵弈等人报道[3]，在pH 7.0缓冲液存在下用乙酸乙酯提取，紫外检测杂质峰较多，本文用二氯甲烷提取，回收率与乙酸乙酯相当，但杂质峰较少，且在碱性条件下提取比中性条件下杂质峰更少。
, http://www.100md.com
本文建立的测定血浆中ISMN的高效液相色谱法具有操作简便、所用仪器较为普及、灵敏度、精密度、准确性均能满足临床用药动学和生物利用度研究的需要，已用于缓释制剂的生物利用度测定，结果准确可靠，为ISMN血浆中浓度测定提供了一种新的选择。
王建新：华西医科大学药学院博士生
参考文献
1 黄小芳，朱英姿，崔宝东等，毛细管气相色谱—电子捕获法测 定5-单硝酸异山梨酯血药浓度的研究. 中国药学杂志，1998，33(10)：608
2 夏桂珠，傅贻柯，董善年等. 毛细管气相色谱-电子捕获法测定人血清中5-单硝酸异山梨醇酯的浓度和药代动力学参数. 药学学报，1994，29(8)：634
3 赵奕，周莹，袁虹等. 5-单硝酸异山梨醇酯片在人体的药代动力学和生物利用度的研究. 中国临床药理学杂志，1995，11(1):33
, 百拇医药
4 Agbaba D, Janjic V, Zivanov-stakic D, et al. High performance liquid chromatographic assay for isosorbide 5-Mononitrate and impurities of inorganic nitrates in pharmaceuticals. J Liquid Chromatogr，1994,17(18):3983
5 张晓东，白秀梅，王建平. 高效液相色谱法测定5-单硝酸异山梨醇酯片含量. 中国药科大学学报，1993，24(4)：229
(本文于1999年2月23日收到), 百拇医药
单位：秦永平 邹远高 梁茂植 黄英 余勤 王建新(华西医科大学附属第一医院临床药理研究室 成都 610041)
关键词：单硝酸异山梨酯；高效液相色谱法；血药浓度
药物分析杂志000308 摘要 目的：建立了高效液相色谱法测定血浆中单硝酸异山梨酯浓度。方法：采用硅胶分析柱,以二氯甲烷-正己烷-乙腈-甲醇(92∶4∶1.5∶2.5)为流动相,卡马西平作内标。样品在碱性条件下用二氯甲烷萃取浓集后进样, 234 nm波长下检测,按内标法定量。结果：标准曲线在25～1600 μg.L-1范围内有良好线性，最低检测浓度为10 μg.L-1，方法回收率为96%～104%，日内RSD小于4.5%，日间RSD小于5%。结论：本法具有快速简便，灵敏准确等特点，已用于单硝酸异山梨酯缓释制剂生物利用度测定，结果良好。
, 百拇医药
Determination of isosorbide-5-mononitrate in Human Plasma
by HPLC with UV Detection
Qin Yongping，Zou Yuangao，Liang Maozhi，Huang Ying，Yu Qin，Wang Jianxin
(Institute of Clinical Pharmacology,First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract Objective：This paper establishes a high performance liquid chromatography for the determination of isosorbide-5-mononitrate(ISMN) in human plasma using carbamazepine as the internal standard.Method:a variable wavelength UV detector and Nuclbosil 5 silica 100A column(250 mm×4.6 mm, 5 μm ) were used. The alkalinized plasma sample was extracted with 3.0 mL methylene chloride . After evaporation of the organic layer, the residue was dissolved in mobile phase and injected onto a column. The mobile phase of methylene chloride-hexane-acetonitrile-methanol(92∶4∶1.5∶2.5) was pumped at 2.0 mL.min-1 through the column. The detector at 0.005 AUFS was set at 234 nm.Results:The retention times for ISMN and carbamazepine were 6.4 min and 7.0 min respectively. Standard curve was linear in the concentration range of 25 to 1 600 μg.L-1. The detection limit in plasma was 10 μg.L-1; and method recovery was 96%～104%; within day RSD less than 4.5%; inter-day RSD less than 5%.Conclusion:This method was found to be simple, rapid, sensitive and accurate for determination of ISMN in human plasma.
, 百拇医药
Key words isosorbide-5-mononitrate，HPLC，plasma concentration
单硝酸异山梨酯(ISMN)为硝酸异山梨酯的主要活性代谢产物,可通过扩张外周血管、特别是增加静脉血容量,减少回心血量、降低心脏前后负荷而减少心肌耗氧量,同时还可通过促进心肌血流重新分布而改善缺血区血流供应。ISMN与硝酸异山梨酯相比除药理活性相同外,还具有吸收迅速、作用持久、没有首过效应。目前ISMN的普通片剂已广泛应用于临床,为考察ISMN控释片的相对生物利用度及了解药代动力学参数,本文建立了测定血浆中ISMN的高效液相色谱法。有关血中ISMN测定，文献报道均用气相色谱-电子捕获法[1～3]，高效液相色谱法仅见制剂中ISMN含量及杂质测定[4，5]。
1 仪器与试药
1.1 仪器与色谱条件 Waters 680型(包括486可变波长紫外检测器, 510型高压泵,7725型进样阀),使用Nuclbosil 5 silica 100A(250 mm×4.6 mm,5 μm，大于20 000塔板)不锈钢分析柱,岛津C-R7Ae型色谱数据处理机。以二氯甲烷-正己烷-乙腈-甲醇(92∶4∶1.5∶2.5)为流动相, 流速1.0 mL.min-1,检测器波长234 nm,灵敏度为0.005 AUFS。
, 百拇医药
1.2 药品与试剂 ISMN由成都华西药业有限公司提供(山东省医药工业研究所生产), 纯度100.3%;内标用卡马西平(中国药品生物制品检定所)。二氯甲烷(分析纯,用前经纯化处理并重蒸馏),乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
1.3 标准溶液 准确称取ISMN 10.0 mg及卡马西平10.0 mg, 分别置于2个50 mL容量瓶中,加乙腈溶解并定容至刻度即成ISMN和内标卡马西平贮备液(200 mg.L-1),-20 ℃保存可稳定2个月,临用时将贮备液用重蒸水稀释至所需浓度,即得ISMN系列工作液(8 000,4 000, 2 000, 1 000, 500, 250, 125 μg.L-1)和内标稀释液(126 μg.L-1)。
2 方法与结果
, 百拇医药 2.1 标准曲线 取正常人空白血浆各0.5 mL共7份, 分别加入ISMN标准系列工作液100 μL,使各管血浆浓度分别为1 600，800，400，200，100，50，25 μg.L-1,再分别加入内标稀释液100 μL, 0.25 mol.L-1氢氧化钠溶液100 μL, 混匀后用二氯甲烷3.0 mL涡旋混合萃取3 min, 离心(3 000 r.min-1)5 min, 负压吸弃上层液,倾二氯甲烷于尖底试管内,于40 ℃水浴中通空气流挥干, 残渣溶于100 μL流动相,进样50 μL。由ISMN与卡马西平的峰高比(Y)对ISMN浓度(X)作标准曲线, 计算得回归方程为:
Y=0.001 289 X-0.000 129 r=0.999 1
表明在血药浓度25～1 600 μg.L-1范围内有良好线性关系。
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2.2 样品测定 取受试者血浆样品 0.5 mL, 加入重蒸水100 μL, 按标准曲线制备项下操作, 在标准曲线上求出各样品中ISMN浓度。
2.3 保留时间及检测限 空白及样品血浆色谱图见图1,ISMN及内标卡马西平的保留时间分别为6.4 min(16 000塔板)和7.0 min(分离度为2.2)。ISMN的最低检出量为2 ng, 最低检出浓度为10 μg.L-1(以信噪比≥3计)。
2.4 方法精密度 取含ISMN高、中、低3种浓度的样品,于同日内连续测定5次,RSD分别为3.4%，4.3%，3.1%; 2周内重复测定5次, RSD分别为4.8%，4.2%，4.2%。
2.5 方法回收率 取空白血浆3份, 配成含ISMN高、中、低3种浓度的样品，每个浓度样品分成5份按前述样品测定法测定, 计算方法回收率, 结果见表1。
, 百拇医药
图1 色谱图
a.空白 b.正常人口服ISMN控释胶囊50 mg后5 h
1.ISMN 2.内标卡马西平
表1 方法回收率 加入量
/μg.L-1
测得量/μg.L-1
平均回收率
±RSD/%
1
2
3
, 百拇医药
4
5
50
48.3
47.4
50.0
51.1
50.6
99.0±3.4
200
191
205
200
, 百拇医药
206
210
101.2±3.7
800
767
786
799
841
800
99.0±3.1
3 讨论
3.1 色谱柱选择 ISMN极性较大，用烷基柱和氰基柱测定时，所用流动相中水相比例高，前述提取法处理的样品进样杂质峰保留时间长，改用硅胶柱后，杂质大多在5 min内出峰，不干扰测定，且药物峰峰形好，有利于提高检测灵敏度。
, 百拇医药
3.2 检测波长选择 ISMN无明显紫外吸收峰，仅在近紫外区有吸收(见图2)，为提高检测灵敏度，检测波长应越短越好，但由于流动相所用二氯甲烷在近紫外区吸收明显增高,综合二者因素，本文采用234 nm测定既不使流动相本底吸收太高(本底吸收值0.50)，又能达到测定血浆中ISMN灵敏度要求。
图2 ISMN紫外吸收曲线
40 mg.L-1甲醇-水(1∶4)溶液
3.3 萃取条件选择 按赵弈等人报道[3]，在pH 7.0缓冲液存在下用乙酸乙酯提取，紫外检测杂质峰较多，本文用二氯甲烷提取，回收率与乙酸乙酯相当，但杂质峰较少，且在碱性条件下提取比中性条件下杂质峰更少。
, http://www.100md.com
本文建立的测定血浆中ISMN的高效液相色谱法具有操作简便、所用仪器较为普及、灵敏度、精密度、准确性均能满足临床用药动学和生物利用度研究的需要，已用于缓释制剂的生物利用度测定，结果准确可靠，为ISMN血浆中浓度测定提供了一种新的选择。
王建新：华西医科大学药学院博士生
参考文献
1 黄小芳，朱英姿，崔宝东等，毛细管气相色谱—电子捕获法测 定5-单硝酸异山梨酯血药浓度的研究. 中国药学杂志，1998，33(10)：608
2 夏桂珠，傅贻柯，董善年等. 毛细管气相色谱-电子捕获法测定人血清中5-单硝酸异山梨醇酯的浓度和药代动力学参数. 药学学报，1994，29(8)：634
3 赵奕，周莹，袁虹等. 5-单硝酸异山梨醇酯片在人体的药代动力学和生物利用度的研究. 中国临床药理学杂志，1995，11(1):33
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4 Agbaba D, Janjic V, Zivanov-stakic D, et al. High performance liquid chromatographic assay for isosorbide 5-Mononitrate and impurities of inorganic nitrates in pharmaceuticals. J Liquid Chromatogr，1994,17(18):3983
5 张晓东，白秀梅，王建平. 高效液相色谱法测定5-单硝酸异山梨醇酯片含量. 中国药科大学学报，1993，24(4)：229
(本文于1999年2月23日收到), 百拇医药