快速HPLC法测定舒林酸血药浓度
作者：姜丽霞
单位：姜丽霞(浙江省医学科学院药物研究所 杭州 310013)
关键词：舒林酸；高效液相色谱法；血药浓度
药物分析杂志000307 摘要 目的：为进行舒林酸人体相对生物利用度等研究，建立该药的人血清中舒林酸HPLC微量测定方法。方法：样品加甲醇混旋后，置 -20 ℃以进一步使血清蛋白凝聚，离心后取上清液直接进样; HPLC柱长度为100 mm，填料为粒径3 μm的 C18，流动相为醋酸盐缓冲液-乙腈-甲醇(59∶12∶29)，紫外检测波长为328 nm。结果：在0.05～12.0 μg.mL-1范围内线性关系良好，最低检测限为0.04 μg.mL-1，平均回收率为96.5% ～ 101.3%(n=15)。HPLC分离过程需时12 min，舒林酸与其主要代谢物分离良好。用本方法测定了8位志愿者口服200 mg舒林酸胶囊后的血药浓度，得到了合理的血药浓度经时曲线。结论：方法简便、快速、准确，专属性强。
, 百拇医药
Rapid Analysis of Sulindac in Human Serum by HPLC
Jiang Lixia
(Institution of Medica Materia，Zhejiang Academy of Medicine, Hangzhou 310013)
Abstract Objective：An improved high performance liquid chromatographic method was developed for the quantitative analysis of sulindac in human serum in order to examine the relative in vivo bioavailability.Methods:Following vortex-mixing with methanol, the sample was kept at -20 ℃ overnight for further deproteinization, and centrifuged. A portion (20 μL) of the supernatant was analyzed by HPLC on a column (10 cm ×5 mm) of Hypersil C18 (3 μm) with methanol-acetonitrile-acetate buffer (59∶12∶29) as mobile phase , and detection at 328 nm.Results:Good separation of sulindac and its major metabolite was achieved. Complete analysis took 12 min. Calibration graphs were rectilinear in the range of 0.05～12.0 μg.mL-1, the detection limit was 0.04 μg.mL-1 and the recoveries were 96.5%～101.3% (n=15). The method was applied to the determination of sulindac in human serum. Conclusion:This method is rapid, simple and accurate.
, http://www.100md.com
Key words sulindac, HPLC, serum drug concentration
舒林酸(sulindac)为非甾体抗炎药物，主要用于风湿性关节炎、骨关节炎及僵直性脊椎炎等，与同类药相比，疗效好、副作用低，我国已有片剂新药上市，其它新剂型正在研究开发中。舒林酸的血药浓度测定方法有质谱法、同位素放免法、HPLC-紫外法[1～4]及HPLC-电化学法[5]。已报道的HPLC法常需梯度洗脱，样品提取过程繁复冗长，不仅耗资较多，且易导致结果不准确，需时亦长。本文研究了简便、准确的样品提取方法，并选用分离效率高、出峰快的HPLC短柱，配以三元流动相体系，经分析方法学验证，该法简便、快速、可靠，此外，用血量少、费用低廉。
1 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪，包括510泵，U6K进样器，484紫外检测器；岛津 C-R2AX色谱处理机。
, http://www.100md.com
舒林酸对照品由浙江宁波制药厂生产，经浙江省药检所检定，含量为100%。
舒林酸胶囊剂(规格为每粒100 mg)由浙江宁波制药厂提供。
乙腈、甲醇为HPLC级，美国Fisher公司出品；水为重蒸水；其它试剂均为分析纯。空白血清为10名健康人的混合血清。
2 色谱条件
色谱柱：100 mm×5.0 mm 不锈钢柱，填料为Hypersil C18，3 μm，(自填)；流动相 ：0.08 mol.L-1醋酸钠(用50%醋酸调pH为 6.0)-甲醇-乙腈 (59∶12∶29)；流速：0.8 mL.min-1； 检测波长：UV 328 nm； 衰减：0.01 AUFS； 柱温：30 ℃。
, http://www.100md.com
3 样品处理
取血清0.2 mL于1.5 mL具塞离心管内，加入甲醇0.5 mL，密塞，涡旋30 s后，置-20 ℃过夜，离心(3 000 r.min-1)10 min，取上清液20 μL进样。
4 方法的验证
4.1 标准曲线绘制 取空白人血清，加入舒林酸对照品使浓度分别为0.05，0.15， 0.6， 1.5， 3.0， 6.0， 12.0 μg .mL-1的标准系列溶液，按样品处理方法处理。以浓度C(μg .mL-1)对峰面积A进行回归，得回归方程：(n=7)
C = 5.624 ×10-5A + 0.003 2 r = 0.999 9
, http://www.100md.com
在血药浓度为0.05～12.0 μg.mL-1范围内具有良好的线性关系。
4.2 回收率 取空白人血清，加入舒林酸对照品配成0.5， 2.0，8.0 μg.mL-1的浓度，各取5份，按上述方法提取测定。直接进对照品的甲醇溶液测得结果并绘制标准曲线，用以计算绝对回收率，结果3种浓度的回收率分别为96.5%，101.1%，101.3%，RSD 分别为4.3%，3.5%，2.1%，n=5。
4.3 精密度 采用血清逐步稀释法，制备0.5，2.0，8.0 μg.mL-1的血清溶液，第1天测定各5份，余者置-20 ℃，隔日测定1次，作日间精密度分析。结果见表1。RSD均在5%以内。
4.4 灵敏度 以信噪比为3计，最低检测限为0.04 μg .mL-1。
, http://www.100md.com
表1 血清中舒林酸日内、日间测定的精密度分析(n=5) 浓度/μg .mL-1
日内RSD/%
日间RSD/%
0.50
4.3
3.1
2.00
3.5
3.8
8.00
2.1
3.2
, 百拇医药
4.5 特异性 在所用的HPLC条件下，空白血清中内源性物质及舒林酸主要代谢产物对舒林酸的检测均无干扰，见图1。
图1 空白血清(A)、含药血清(B)及服药后4 h的
受试者血清(C)的HPLC图谱
1.舒林酸(3.7 min) 2.舒林酸主要代谢产物(4.9 min)
5 样品测定
8位健康志愿者空腹口服舒林酸胶囊200 mg，于服药前及服药后的0.5～12 h定时静脉取血，于1 h内避光分离出血清，并置-20 ℃储存。测定时按样品处理项下操作，每批测定前取精密度项下3种浓度的血清溶液作质控(QC)样品，并绘制标准曲线。测得的药时曲线见图2。
, 百拇医药
图2 8位受试者口服舒林酸200 mg后的
平均血药浓度-时间曲线
6 讨论
6.1 色谱柱类型 采用填料粒径为3 μm的短柱，分离效率高，出峰时间短。整个色谱过程需时12 min，而采用常规分析柱(5 μm，25 cm × 0.46 cm)，欲达相同的分离度则需时20 min左右。
6.2 流动相的选择 用HPLC法测定舒林酸血药浓度的报道[1～5]中流动相中均采用1种有机溶剂。本文参考了专为药品生产而研究的HPLC分离法[6]，采用甲醇和乙腈两元有机溶剂，并选择了最佳配比，其中乙腈对舒林酸与其主要代谢产物的分离起重要作用，甲醇则起修饰峰拖尾的作用。
6.3 提取条件的改进 所有文献报道[1～5]均采用溶剂提取或分离小柱提取后，挥干、再溶解，既费时，成本亦高，且会影响分析精密度。本文用甲醇直接沉淀血清蛋白，离心后取上清液进样，方法简便、快速，同时减少了反复提取可能带来的误差，但用有机溶剂直接沉淀血清蛋白常会发生上清液中蛋白去除不完全的现象。本实验将血清与甲醇混旋后，置-20 ℃过夜，使血清蛋白进一步凝聚，离心后所得溶液较混旋后直接离心更清澈。经数百次HPLC分析，柱效未见明显下降。
, 百拇医药
6.4 舒林酸化学性质的影响 实验中发现舒林酸在水性溶液中对光、热等不稳定。其水溶液在室温(28 ℃)置操作台1 h即有2%转化为其主要代谢产物；4 h后有5%转化；而置4 ℃冰箱内18 h，或置暗处数小时几乎无转化。在舒林酸血药浓度测定的报道中，均未提及此现象。该现象提示，采血样后，应注意避光，并尽快分得血清，同时置-20 ℃保存。舒林酸的甲醇溶液置室温7 d，仍稳定。
参考文献
1，Swanson Brian N，Boppana Venkata D. Measurement of sulindac and its metabolites in human plasma and urine by HPLC. J Chromatogr, 1981, 225 : 123
2，Clark C Randall, McMillian Carl L, Hoke John F, et al. Liquid chromatographic determination of sulindac and metabolites in serum. J Chromatogr Sci, 1987, 25 : 247
, 百拇医药
3，Dusci L J, Hackett L P. Determination of sulindac and its metabolites in serum by HPLC. J Chromatogr, 1979, 171 : 490
4，Musson D G, Vincek W C, Constanzer M L. Analytical methods for the determination of sulindac and metabolites in plasma, urine, bile, and gastric fluid by liquid chromatography using ultraviolet detection. J Pharm Sci, 1984, 73 (9) : 1270
5，Kazemifard Amir G, Moore Douglas E. Liquid chromatography with amperometric detection for the determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma. J Chromatogr, 1990, 533 : 125
6，Cotton M L, Down G R B. Reversed-phase HPLC of sulindac and related compounds using a computer simulation. J Chromatogr, 1983, 259:17
(本文于1999年2月11日收到), 百拇医药
单位：姜丽霞(浙江省医学科学院药物研究所 杭州 310013)
关键词：舒林酸；高效液相色谱法；血药浓度
药物分析杂志000307 摘要 目的：为进行舒林酸人体相对生物利用度等研究，建立该药的人血清中舒林酸HPLC微量测定方法。方法：样品加甲醇混旋后，置 -20 ℃以进一步使血清蛋白凝聚，离心后取上清液直接进样; HPLC柱长度为100 mm，填料为粒径3 μm的 C18，流动相为醋酸盐缓冲液-乙腈-甲醇(59∶12∶29)，紫外检测波长为328 nm。结果：在0.05～12.0 μg.mL-1范围内线性关系良好，最低检测限为0.04 μg.mL-1，平均回收率为96.5% ～ 101.3%(n=15)。HPLC分离过程需时12 min，舒林酸与其主要代谢物分离良好。用本方法测定了8位志愿者口服200 mg舒林酸胶囊后的血药浓度，得到了合理的血药浓度经时曲线。结论：方法简便、快速、准确，专属性强。
, 百拇医药
Rapid Analysis of Sulindac in Human Serum by HPLC
Jiang Lixia
(Institution of Medica Materia，Zhejiang Academy of Medicine, Hangzhou 310013)
Abstract Objective：An improved high performance liquid chromatographic method was developed for the quantitative analysis of sulindac in human serum in order to examine the relative in vivo bioavailability.Methods:Following vortex-mixing with methanol, the sample was kept at -20 ℃ overnight for further deproteinization, and centrifuged. A portion (20 μL) of the supernatant was analyzed by HPLC on a column (10 cm ×5 mm) of Hypersil C18 (3 μm) with methanol-acetonitrile-acetate buffer (59∶12∶29) as mobile phase , and detection at 328 nm.Results:Good separation of sulindac and its major metabolite was achieved. Complete analysis took 12 min. Calibration graphs were rectilinear in the range of 0.05～12.0 μg.mL-1, the detection limit was 0.04 μg.mL-1 and the recoveries were 96.5%～101.3% (n=15). The method was applied to the determination of sulindac in human serum. Conclusion:This method is rapid, simple and accurate.
, http://www.100md.com
Key words sulindac, HPLC, serum drug concentration
舒林酸(sulindac)为非甾体抗炎药物，主要用于风湿性关节炎、骨关节炎及僵直性脊椎炎等，与同类药相比，疗效好、副作用低，我国已有片剂新药上市，其它新剂型正在研究开发中。舒林酸的血药浓度测定方法有质谱法、同位素放免法、HPLC-紫外法[1～4]及HPLC-电化学法[5]。已报道的HPLC法常需梯度洗脱，样品提取过程繁复冗长，不仅耗资较多，且易导致结果不准确，需时亦长。本文研究了简便、准确的样品提取方法，并选用分离效率高、出峰快的HPLC短柱，配以三元流动相体系，经分析方法学验证，该法简便、快速、可靠，此外，用血量少、费用低廉。
1 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪，包括510泵，U6K进样器，484紫外检测器；岛津 C-R2AX色谱处理机。
, http://www.100md.com
舒林酸对照品由浙江宁波制药厂生产，经浙江省药检所检定，含量为100%。
舒林酸胶囊剂(规格为每粒100 mg)由浙江宁波制药厂提供。
乙腈、甲醇为HPLC级，美国Fisher公司出品；水为重蒸水；其它试剂均为分析纯。空白血清为10名健康人的混合血清。
2 色谱条件
色谱柱：100 mm×5.0 mm 不锈钢柱，填料为Hypersil C18，3 μm，(自填)；流动相 ：0.08 mol.L-1醋酸钠(用50%醋酸调pH为 6.0)-甲醇-乙腈 (59∶12∶29)；流速：0.8 mL.min-1； 检测波长：UV 328 nm； 衰减：0.01 AUFS； 柱温：30 ℃。
, http://www.100md.com
3 样品处理
取血清0.2 mL于1.5 mL具塞离心管内，加入甲醇0.5 mL，密塞，涡旋30 s后，置-20 ℃过夜，离心(3 000 r.min-1)10 min，取上清液20 μL进样。
4 方法的验证
4.1 标准曲线绘制 取空白人血清，加入舒林酸对照品使浓度分别为0.05，0.15， 0.6， 1.5， 3.0， 6.0， 12.0 μg .mL-1的标准系列溶液，按样品处理方法处理。以浓度C(μg .mL-1)对峰面积A进行回归，得回归方程：(n=7)
C = 5.624 ×10-5A + 0.003 2 r = 0.999 9
, http://www.100md.com
在血药浓度为0.05～12.0 μg.mL-1范围内具有良好的线性关系。
4.2 回收率 取空白人血清，加入舒林酸对照品配成0.5， 2.0，8.0 μg.mL-1的浓度，各取5份，按上述方法提取测定。直接进对照品的甲醇溶液测得结果并绘制标准曲线，用以计算绝对回收率，结果3种浓度的回收率分别为96.5%，101.1%，101.3%，RSD 分别为4.3%，3.5%，2.1%，n=5。
4.3 精密度 采用血清逐步稀释法，制备0.5，2.0，8.0 μg.mL-1的血清溶液，第1天测定各5份，余者置-20 ℃，隔日测定1次，作日间精密度分析。结果见表1。RSD均在5%以内。
4.4 灵敏度 以信噪比为3计，最低检测限为0.04 μg .mL-1。
, http://www.100md.com
表1 血清中舒林酸日内、日间测定的精密度分析(n=5) 浓度/μg .mL-1
日内RSD/%
日间RSD/%
0.50
4.3
3.1
2.00
3.5
3.8
8.00
2.1
3.2
, 百拇医药
4.5 特异性 在所用的HPLC条件下，空白血清中内源性物质及舒林酸主要代谢产物对舒林酸的检测均无干扰，见图1。
图1 空白血清(A)、含药血清(B)及服药后4 h的
受试者血清(C)的HPLC图谱
1.舒林酸(3.7 min) 2.舒林酸主要代谢产物(4.9 min)
5 样品测定
8位健康志愿者空腹口服舒林酸胶囊200 mg，于服药前及服药后的0.5～12 h定时静脉取血，于1 h内避光分离出血清，并置-20 ℃储存。测定时按样品处理项下操作，每批测定前取精密度项下3种浓度的血清溶液作质控(QC)样品，并绘制标准曲线。测得的药时曲线见图2。
, 百拇医药
图2 8位受试者口服舒林酸200 mg后的
平均血药浓度-时间曲线
6 讨论
6.1 色谱柱类型 采用填料粒径为3 μm的短柱，分离效率高，出峰时间短。整个色谱过程需时12 min，而采用常规分析柱(5 μm，25 cm × 0.46 cm)，欲达相同的分离度则需时20 min左右。
6.2 流动相的选择 用HPLC法测定舒林酸血药浓度的报道[1～5]中流动相中均采用1种有机溶剂。本文参考了专为药品生产而研究的HPLC分离法[6]，采用甲醇和乙腈两元有机溶剂，并选择了最佳配比，其中乙腈对舒林酸与其主要代谢产物的分离起重要作用，甲醇则起修饰峰拖尾的作用。
6.3 提取条件的改进 所有文献报道[1～5]均采用溶剂提取或分离小柱提取后，挥干、再溶解，既费时，成本亦高，且会影响分析精密度。本文用甲醇直接沉淀血清蛋白，离心后取上清液进样，方法简便、快速，同时减少了反复提取可能带来的误差，但用有机溶剂直接沉淀血清蛋白常会发生上清液中蛋白去除不完全的现象。本实验将血清与甲醇混旋后，置-20 ℃过夜，使血清蛋白进一步凝聚，离心后所得溶液较混旋后直接离心更清澈。经数百次HPLC分析，柱效未见明显下降。
, 百拇医药
6.4 舒林酸化学性质的影响 实验中发现舒林酸在水性溶液中对光、热等不稳定。其水溶液在室温(28 ℃)置操作台1 h即有2%转化为其主要代谢产物；4 h后有5%转化；而置4 ℃冰箱内18 h，或置暗处数小时几乎无转化。在舒林酸血药浓度测定的报道中，均未提及此现象。该现象提示，采血样后，应注意避光，并尽快分得血清，同时置-20 ℃保存。舒林酸的甲醇溶液置室温7 d，仍稳定。
参考文献
1，Swanson Brian N，Boppana Venkata D. Measurement of sulindac and its metabolites in human plasma and urine by HPLC. J Chromatogr, 1981, 225 : 123
2，Clark C Randall, McMillian Carl L, Hoke John F, et al. Liquid chromatographic determination of sulindac and metabolites in serum. J Chromatogr Sci, 1987, 25 : 247
, 百拇医药
3，Dusci L J, Hackett L P. Determination of sulindac and its metabolites in serum by HPLC. J Chromatogr, 1979, 171 : 490
4，Musson D G, Vincek W C, Constanzer M L. Analytical methods for the determination of sulindac and metabolites in plasma, urine, bile, and gastric fluid by liquid chromatography using ultraviolet detection. J Pharm Sci, 1984, 73 (9) : 1270
5，Kazemifard Amir G, Moore Douglas E. Liquid chromatography with amperometric detection for the determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma. J Chromatogr, 1990, 533 : 125
6，Cotton M L, Down G R B. Reversed-phase HPLC of sulindac and related compounds using a computer simulation. J Chromatogr, 1983, 259:17
(本文于1999年2月11日收到), 百拇医药