HPLC法测定缓释滴眼剂中匹罗卡品含量
作者：吴正中 张一萍 龙恩武 曾明辉
单位：四川省人民医院 成都 610072
关键词：匹罗卡品；高效液相色谱法；缓释滴眼液
华西药学杂志990424 提要 用HPLC法测定匹罗卡品缓释眼液含量，并探讨pH值、流动相比例对保留时间(tR)的影响。色谱柱用硅胶柱；流动相为乙腈-水(75∶25)含0.05%H3PO4，pH为3～4；检测波长217 nm；外标法定量。最低检出限为5 ng，0.64～3.2 μg/ml范围线性关系良好，回收率为98.9%，日内和日间精密度分别为2.8%和2.4%。
DETERMINATION OF PILOCARPINE IN SUSTAINED
RELEASE EYE DROP BY HPLC
, 百拇医药
Wu Zhengzhong Zhang Yiping Long Enwu Zeng Minghui
(Sichuan Provincial People's Hospital Chengdu 610072)
ABSTRACT An HPLC method for assaying pilocarpine in eye drop was developed and observed the influence of pH and mobile phase composition on retention time (tR). With porons silico microparticles column, acteonitrile-water(75∶25) containing 0.05% H3PO4 as mobile phase; detective wavelength was at 217 nm. The minimum detective limit was 5 μg. Linear range of standard curve was 0.64～3.2 μg/ml. The recovery was 98.9%, within-day and between-day precision RSD were 2.8% and 2.4%, respectively.
, 百拇医药
Key Words Pilocarpine HPLC Sustained release eye drop
硝酸毛果芸香碱又名匹罗卡品(pilocarpine，PP)，是临床上治疗青光眼的常用药。但因眼内不易滞留药物，给药次数多，给长期用药者带来不便。采用高分子材料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为药物载体制成缓释滴眼液，效果良好。PVP为线型N-乙烯基-吡咯烷酮的聚合物，为一种较成熟的多用途的优良辅料，现已收载入USP23版和BP1993年版。经实验选择，用PVP-K90(平均分子量为360 000)配成的眼液可达缓释效果。由于加入了PVP-K90，紫外法测定[1]明显受到干扰，其灵敏度较差。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
Waters 510泵，7725进样器；810色谱工作站；Shimadzu SPD-10A紫外检测仪(日本)；超级恒温器(重庆实验设备厂)。硝酸匹罗卡品(上海长虹药品加工厂)；乙腈(色谱纯)。
, http://www.100md.com
1.2 色谱条件的选择
1.2.1 流动相pH值对tR的影响 乙腈-水(80∶20)含0.05%H3PO4[2]，用二乙胺分别将水相pH值调为2.20、2.37、2.63、2.86、4.08、5.83，在流速为1.5 ml/min时，tR分别为2.08、1.97、1.38、8.4、9 min，当pH值大于3时，tR变化不大，结合硅胶柱对pH值的要求范围2～10，水相pH值定为3～4。
1.2.2 流动相比例对tR的影响 水相pH 4.08，流动相比例(乙腈-水)分别为(80∶20)、(75∶25)、(70∶30)，在流速为 1.5 ml/min时，tR分别为8.4、7.1、5.7 min，结果增加水相比例，保留时间缩短，结合干扰情况，选为(75∶25)。
, 百拇医药
色谱条件为硅胶柱(4.6 mm×250 mm)(Spherisorb SiO2 5 μm，大连依利特科仪公司)；流动相为乙腈-水(75∶25)，含0.05%H3PO4(pH 3.24)；流速1.5 ml/min；灵敏度为0.01AUFS；tR为7.5 min。
1.3 对照液的配制
精密称取硝酸匹罗卡品适量，用蒸馏水配成32 μg/ml对照品贮备液，分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，即得。另制备空白液。
1.4 供试液的制备
取样品2.0 ml至100 ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，另取稀释液5.0 ml至50 ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，再取二次稀释液1.0 ml至10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。空白液同法处理。
, 百拇医药
2 结果
2.1 线性与精密度
按上述色谱条件进样20 μl，未见其它物质干扰待测组分(图1)，匹罗卡品药量与峰面积呈良好线性关系，回归方程为：
c=1.275×10-2+1.236×10-4R r=0.9994。用对照液高中低三个浓度进行精密度考察，结果(表1)该法精密度良好。
Fig 1 Chromatogram of sample(a) and blank(b)
Table 1 Precision of within-day and between-day of pilocarpine (n=5) Precision
, http://www.100md.com
Added
(mg/L)
Detected
(
±SD)
RSD
(%)
Within-day
0.640
0.652±0.010
1.5
1.919
, http://www.100md.com
1.870±0.086
4.6
3.196
3.179±0.013
0.4
Between-day
0.640
0.632±0.023
3.6
1.919
1.939±0.045
2.3
, http://www.100md.com
3.196
3.203±0.034
1.1
2.2 方法回收率
选择高中低三个浓度，按前述操作测定，结果见表2。Table 2 Recovery of pilocarpine(n=3) Added
(mg/L)
Detected
(
±SD)
Recovery
(%)
, http://www.100md.com
Average recovery
(%)
0.640
0.652±0.010
102.0
1.919
1.870±0.086
97.0
99.0
3.196
3.179±0.013
99.0
, 百拇医药
2.3 检出限
最低检出限为5 μg(S/N=3∶1)。
2.4 供试品测定
取供试品，按“1.4”项下处理，进样20 μl，结果见表3。Table 3 The results of samples analyses (g/100ml) Batch
Sample
±SD
RSD
(%)
1
2
, 百拇医药
3
4
5
980507
0.98
0.93
0.91
0.95
-
0.94±0.03
3.2
980511
0.87
, 百拇医药
0.89
0.88
0.89
0.89
0.88±0.01
1.0
3 讨论
3.1 曾用该法进行了稳定性实验，将供试品于70℃、80℃、90℃、98℃水浴中分别加热12、24、36、48 h，测定结果显示各温度下加热后样品浓度变化很小，其原因是piolcarpine异构化产物和水解产物产生干扰[4，5]，尤以异构化产物isopilocarpine干扰为大[6]。需进一步优化色谱条件，将pilocarpine与isopilocarpine进行色谱分离[7]，方能进行稳定性实验。
, 百拇医药
3.2 色谱条件选择过程中，用二乙胺调整流动相pH，滴入过程中存在一个pH突跃(水相中有0.5%H3PO4，二乙胺滴入即为酸碱滴定)，pH值前后难以调整为一个相同值，故pH为3～4。
3.3 在用RP-HPLC分析碱性药物中，近年来有一种发展趋势，即使用不经过化学改性的硅胶作固定相，而用各种不同组成的水性溶剂作流动相。其分离机理是[8]流动组中水分(或加入适量的醇、酸、胺等)使硅胶表面羟基基团被水(醇、酸、胺)占据，既有分配色谱作用，同时还可能有吸附作用。
参考文献
1 廖德龙，吴正中.硝酸毛果芸香碱滴眼液含量的一阶导数光谱测定法.中国药房，1992，3(1)∶23
2 钱春梅.高效液相色谱法测定兔虹膜睫状体中匹罗卡品含量.中国医院药学杂志，1996，16(5)∶200
, 百拇医药
3 王学年，张嘉丽，高清江.硝酸毛果芸香碱处方的改进及其疗效.宁夏医学杂志，1991，13(1)∶18
4 周维书，陆丽珠译.药物的化学稳定性.北京：人民卫生版社，1983.244
5 Nunes MA, E.Brochmann-Hanssen. Hydrolysis and epimerization kinetics of pilocarpine in aqueous solution. J Pharm Sci, 1973, 63(5)∶716
6 Kennedy JM, McNamara DE. High-performance liquid chromatographic analysis of pilocarpine hydrochloride,isopilocarpine, pilocarpine acid and isopilocarpic acid in eye-drop preparations. J Chromatorgraphy, 1981, 212∶331
7 Stemitzke KD, Fan TY, Dunn DL. High-performance liquid chromatographic determination of pilorcarpine hydrochloride and its degration products using a β-cyclodextrin column, J Chromatography, 1992, 589∶159
8 卢佩章，张玉奎，梁鑫淼.高效液相色谱法及其专家系统.沈阳：辽宁科技技术出版社，1992.148, http://www.100md.com
单位：四川省人民医院 成都 610072
关键词：匹罗卡品；高效液相色谱法；缓释滴眼液
华西药学杂志990424 提要 用HPLC法测定匹罗卡品缓释眼液含量，并探讨pH值、流动相比例对保留时间(tR)的影响。色谱柱用硅胶柱；流动相为乙腈-水(75∶25)含0.05%H3PO4，pH为3～4；检测波长217 nm；外标法定量。最低检出限为5 ng，0.64～3.2 μg/ml范围线性关系良好，回收率为98.9%，日内和日间精密度分别为2.8%和2.4%。
DETERMINATION OF PILOCARPINE IN SUSTAINED
RELEASE EYE DROP BY HPLC
, 百拇医药
Wu Zhengzhong Zhang Yiping Long Enwu Zeng Minghui
(Sichuan Provincial People's Hospital Chengdu 610072)
ABSTRACT An HPLC method for assaying pilocarpine in eye drop was developed and observed the influence of pH and mobile phase composition on retention time (tR). With porons silico microparticles column, acteonitrile-water(75∶25) containing 0.05% H3PO4 as mobile phase; detective wavelength was at 217 nm. The minimum detective limit was 5 μg. Linear range of standard curve was 0.64～3.2 μg/ml. The recovery was 98.9%, within-day and between-day precision RSD were 2.8% and 2.4%, respectively.
, 百拇医药
Key Words Pilocarpine HPLC Sustained release eye drop
硝酸毛果芸香碱又名匹罗卡品(pilocarpine，PP)，是临床上治疗青光眼的常用药。但因眼内不易滞留药物，给药次数多，给长期用药者带来不便。采用高分子材料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为药物载体制成缓释滴眼液，效果良好。PVP为线型N-乙烯基-吡咯烷酮的聚合物，为一种较成熟的多用途的优良辅料，现已收载入USP23版和BP1993年版。经实验选择，用PVP-K90(平均分子量为360 000)配成的眼液可达缓释效果。由于加入了PVP-K90，紫外法测定[1]明显受到干扰，其灵敏度较差。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
Waters 510泵，7725进样器；810色谱工作站；Shimadzu SPD-10A紫外检测仪(日本)；超级恒温器(重庆实验设备厂)。硝酸匹罗卡品(上海长虹药品加工厂)；乙腈(色谱纯)。
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1.2 色谱条件的选择
1.2.1 流动相pH值对tR的影响 乙腈-水(80∶20)含0.05%H3PO4[2]，用二乙胺分别将水相pH值调为2.20、2.37、2.63、2.86、4.08、5.83，在流速为1.5 ml/min时，tR分别为2.08、1.97、1.38、8.4、9 min，当pH值大于3时，tR变化不大，结合硅胶柱对pH值的要求范围2～10，水相pH值定为3～4。
1.2.2 流动相比例对tR的影响 水相pH 4.08，流动相比例(乙腈-水)分别为(80∶20)、(75∶25)、(70∶30)，在流速为 1.5 ml/min时，tR分别为8.4、7.1、5.7 min，结果增加水相比例，保留时间缩短，结合干扰情况，选为(75∶25)。
, 百拇医药
色谱条件为硅胶柱(4.6 mm×250 mm)(Spherisorb SiO2 5 μm，大连依利特科仪公司)；流动相为乙腈-水(75∶25)，含0.05%H3PO4(pH 3.24)；流速1.5 ml/min；灵敏度为0.01AUFS；tR为7.5 min。
1.3 对照液的配制
精密称取硝酸匹罗卡品适量，用蒸馏水配成32 μg/ml对照品贮备液，分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，即得。另制备空白液。
1.4 供试液的制备
取样品2.0 ml至100 ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，另取稀释液5.0 ml至50 ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，再取二次稀释液1.0 ml至10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。空白液同法处理。
, 百拇医药
2 结果
2.1 线性与精密度
按上述色谱条件进样20 μl，未见其它物质干扰待测组分(图1)，匹罗卡品药量与峰面积呈良好线性关系，回归方程为：
c=1.275×10-2+1.236×10-4R r=0.9994。用对照液高中低三个浓度进行精密度考察，结果(表1)该法精密度良好。
Fig 1 Chromatogram of sample(a) and blank(b)
Table 1 Precision of within-day and between-day of pilocarpine (n=5) Precision
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Added
(mg/L)
Detected
(
±SD)RSD
(%)
Within-day
0.640
0.652±0.010
1.5
1.919
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1.870±0.086
4.6
3.196
3.179±0.013
0.4
Between-day
0.640
0.632±0.023
3.6
1.919
1.939±0.045
2.3
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3.196
3.203±0.034
1.1
2.2 方法回收率
选择高中低三个浓度，按前述操作测定，结果见表2。Table 2 Recovery of pilocarpine(n=3) Added
(mg/L)
Detected
(
±SD)Recovery
(%)
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Average recovery
(%)
0.640
0.652±0.010
102.0
1.919
1.870±0.086
97.0
99.0
3.196
3.179±0.013
99.0
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2.3 检出限
最低检出限为5 μg(S/N=3∶1)。
2.4 供试品测定
取供试品，按“1.4”项下处理，进样20 μl，结果见表3。Table 3 The results of samples analyses (g/100ml) Batch
Sample
±SDRSD
(%)
1
2
, 百拇医药
3
4
5
980507
0.98
0.93
0.91
0.95
-
0.94±0.03
3.2
980511
0.87
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0.89
0.88
0.89
0.89
0.88±0.01
1.0
3 讨论
3.1 曾用该法进行了稳定性实验，将供试品于70℃、80℃、90℃、98℃水浴中分别加热12、24、36、48 h，测定结果显示各温度下加热后样品浓度变化很小，其原因是piolcarpine异构化产物和水解产物产生干扰[4，5]，尤以异构化产物isopilocarpine干扰为大[6]。需进一步优化色谱条件，将pilocarpine与isopilocarpine进行色谱分离[7]，方能进行稳定性实验。
, 百拇医药
3.2 色谱条件选择过程中，用二乙胺调整流动相pH，滴入过程中存在一个pH突跃(水相中有0.5%H3PO4，二乙胺滴入即为酸碱滴定)，pH值前后难以调整为一个相同值，故pH为3～4。
3.3 在用RP-HPLC分析碱性药物中，近年来有一种发展趋势，即使用不经过化学改性的硅胶作固定相，而用各种不同组成的水性溶剂作流动相。其分离机理是[8]流动组中水分(或加入适量的醇、酸、胺等)使硅胶表面羟基基团被水(醇、酸、胺)占据，既有分配色谱作用，同时还可能有吸附作用。
参考文献
1 廖德龙，吴正中.硝酸毛果芸香碱滴眼液含量的一阶导数光谱测定法.中国药房，1992，3(1)∶23
2 钱春梅.高效液相色谱法测定兔虹膜睫状体中匹罗卡品含量.中国医院药学杂志，1996，16(5)∶200
, 百拇医药
3 王学年，张嘉丽，高清江.硝酸毛果芸香碱处方的改进及其疗效.宁夏医学杂志，1991，13(1)∶18
4 周维书，陆丽珠译.药物的化学稳定性.北京：人民卫生版社，1983.244
5 Nunes MA, E.Brochmann-Hanssen. Hydrolysis and epimerization kinetics of pilocarpine in aqueous solution. J Pharm Sci, 1973, 63(5)∶716
6 Kennedy JM, McNamara DE. High-performance liquid chromatographic analysis of pilocarpine hydrochloride,isopilocarpine, pilocarpine acid and isopilocarpic acid in eye-drop preparations. J Chromatorgraphy, 1981, 212∶331
7 Stemitzke KD, Fan TY, Dunn DL. High-performance liquid chromatographic determination of pilorcarpine hydrochloride and its degration products using a β-cyclodextrin column, J Chromatography, 1992, 589∶159
8 卢佩章，张玉奎，梁鑫淼.高效液相色谱法及其专家系统.沈阳：辽宁科技技术出版社，1992.148, http://www.100md.com