二甲胺四环素促进骨髓基质细胞增殖作用的研究*
作者：邓力 李冰 彭雪梅
单位：邓力：华西医科大学药学院；李冰：牙种植医院；彭雪梅：法医系成都 610041
关键词：二甲胺四环素；成骨细胞；骨髓基质细胞
二甲胺四环素促进骨髓基质细胞 增殖作用的研究 提要 为弄清二甲胺四环素增加摘除卵巢的老龄大鼠骨量作用的细胞分子基础，采用细胞增殖曲线的绘制和碱性磷酸酶测定方法，了解二甲胺四环素对成骨细胞和骨髓基质细胞的影响。结果：二甲胺四环素在体外具有刺激骨髓基质细胞和成骨细胞增殖的作用，但抑制细胞的分化。
THE RESEARCH OF THE ACTION OF MINOCYCLINE PROMOTING
THE BONE MARROW STROMAL CELL TO PROLIFERATE
, 百拇医药
Deng Li
School of Pharmacy,The Hospital of Oral Implantology
Li Bing
Department of Forensic Psychiatry
Peng Xuemei
West China University of Medical Sciences Chengdu 610041
ABSTRACT In order to make clear that the cell molecule base of minocycline increase the bone quantity of the old rats which were excised the ovaries, we knew the effect of minocycline to the osteoblast and marrow stromal cells by drawing the proliferation and determined the alkaline phosphatase. Result:minocycline can stimulate the proliferation of osteoblast and marrow stromal cell,but also can restrain the differentiation.
, http://www.100md.com
Key Words Minocycline Osteoblast Bone morrow stromal cell
二甲胺四环素(minocycline,MC)具有增加摘除卵巢的老龄大鼠骨量的作用[1]，但是二甲胺四环素在体内是如何促进成骨细胞或成骨细胞的前驱细胞-骨髓基质细胞骨形成，这部分研究还未见有文献报道，据此，本实验对二甲胺四环素在体外对成骨细胞和骨髓基质细胞的作用进行探讨。
1 实验部分
1.1 材料
用淘汰种鼠Wister大鼠(雌、雄均可)的大腿骨培养骨髓基质细胞[2](BMSC)，以1×106有核细胞/cm2密度，在含15%小牛血清的α-MEM培养液中培养至细胞融合、传代，按以下所进行项目接种进行实验。二甲胺四环素(minocycline hydrochloride,Sigma公司)用0.05 mol/L HCl溶解制成贮备液待用。
, http://www.100md.com
1.2 方法和结果
1.2.1 细胞增殖曲线的绘制 将BMSC以每孔5×104 cell/cm2密度接种到6孔板中，不添加二甲胺四环素为空白对照，二甲胺四环素以1、3、10 μg/ml的浓度添加，在不同时间点上将用EDTA配制的胰蛋白酶消化处理后的细胞，收集并计数，绘制增殖曲线。各组样本重复3次实验，并采用方差分析及两两比较进行统计学处理。与空白组比较，二甲胺四环素1 μg/ml和3 μg/ml添加组，明显出现早期细胞增殖作用，最大可增加50%(细胞数)，而10 μg/ml组则明显抑制细胞增殖(表1)。
Table 1 Effect of minocyclin on proliferate in osteoblast and bone marrow stromal numbers (cell/ml×104,
±s)
, 百拇医药
Groups
n
Bone marrow stromal cell(d)
Osteoblast(d)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
, http://www.100md.com
5
1(μg/ml)
4
6.28
7.84
8.29
8.32**
8.38**
5.30
5.56
5.92
6.08
, 百拇医药 6.14
3(μg/ml)
4
6.49
8.01
8.82**
8.87**
8.91
5.82
6.46
7.21**
7.28**
, 百拇医药
7.39
10(μg/ml)
4
5.38
5.46
5.49
5.56
5.64
5.18
5.29
5.36
5.47
5.58
, 百拇医药
Control
4
5.43
5.76
5.88
5.94
6.01
5.20
5.47
5.63
5.70
5.76
**P<0.01 compared with the control
, http://www.100md.com
1.2.2 碱性磷酸酶活性的测定 将BMSC以每孔2×104 cell/cm2密度接种到24孔板中，不添加二甲胺四环素为空白对照，二甲胺四环素以1、3、10 μg/ml的浓度添加，培养6 d后，比色法测定碱性磷酸酶活性，分析方法同“1.2.1”。与空白组比较，二甲胺四环素各添加组均表现出抑制碱性磷酸酶活性的倾向(图1)。
Fig 1 Effect of minocycline on ALP action in bone marrow stromal cell vs control *P<0.05 **P<0.01
1.2.3 成骨细胞增殖曲线的绘制 采用成骨细胞样细胞MC3T3-E1以每孔5×104 cell/cm2密度接种到6孔板中，同“1.2.1”制成空白对照和二甲胺四环素组，并绘制增殖曲线，分析方法同“1.2.1”。成骨细胞样(MC3T3-E1)细胞与BMSC相同，3 μg/ml组表现早期促进细胞增殖作用，最大可增加28%(表1)。
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3 讨论
成骨细胞是骨的形成、骨骼发育与生长的重要细胞，骨髓基质细胞是成骨细胞的来源，已被证实骨髓基质细胞能被糖皮质激素诱导分化成具有成熟成骨细胞特征的细胞[3]，成骨细胞在骨的形成、骨骼的发育与生长过程中经历了细胞增殖、多层细胞结节形成、I型胶原合成、矿化增强、胶原成熟、细胞外基质中羟基磷灰石积累等过程。据此，把骨胶原基质的积累，碱性磷酸盐的出现和骨小结节矿化作为成骨细胞的表现型[4]。四环素除具有极强的骨亲和性外，还具有促进处于病理状态下的骨组织生长的活性，影响成骨细胞的结构和功能，恢复病理状态下成骨细胞的正常结构[5]，最近的研究发现投用MC后有增加摘除卵巢大鼠骨量的作用[1]。这表明四环素类药物为开发治疗骨质疏松症药物带来了生机。据此，对在体外就MC对成骨细胞和成骨细胞的前驱细胞-骨髓基质细胞的作用进行了观察。结果显示，MC在体外具有刺激骨髓基质细胞和成骨细胞增殖的作用，同时又显示出可能抑制细胞分化的作用，即MC在体内增加摘除卵巢大鼠骨量作用的切点与骨量增加在细胞中表现为成骨细胞增殖、分化最后成熟形成钙化不一致。四环素类药物与骨的结合依赖于骨细胞的活性。也有研究表明四环素并不依赖于骨细胞的生物活性与细胞内各组分的完整性，而是与骨组织中无机盐-羟基磷灰石反应的结果[6]。总之，四环素对成骨细胞活性是有影响的，推测在其反应过程中可能由于缺乏某种因子的参与和介导，或者由于没有充足无机盐成份的环境支持，导致细胞分化抑制的结果。因此寻找MC增加骨量作用的切点，体外实验研究还有待进一步进行。
, 百拇医药
*卫生部回国人员启动基金资助课题
参考文献
1 Willams S, Wakisaka A, Zeng QQ, et al. Minocycline prevents the decrease in bone mineral density and trabecular bone in ovariectomized aged rats. Bone,1996,19∶637
2 Keila S, Pitaru S, Grosskopf A, et al. Bono marrow from mechaniclly unloaded rat bones expresses reduced ostagenic in vitro. J Bone Miner Res,1994,9∶321
3 Owen M, Friedenstein AJ, Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp,1988,136∶42
, 百拇医药
4 QU Q, Perala-Heape A, Kapanen M. Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse mone marrow culture. Bone,1998,22(3)∶201
5 Kaneko H, Sasaki T, Ramamurthy NS, et al. Tetracycline administration normalizes the struction and acid phosphatase activity of osteoclasts in sterptozotocin-induced diabetes rats. Antomical Record,1990,227∶427
6 Sasaki,T,Ramamurthy,NS, Golub L, M.Tetracycline administration increases collagen synthesis in osteoblasts of streptozotocin-induced diabetic rats:A quantitative autoradiographic study. Calcif tiss Int,1992,50∶411, 百拇医药
单位：邓力：华西医科大学药学院；李冰：牙种植医院；彭雪梅：法医系成都 610041
关键词：二甲胺四环素；成骨细胞；骨髓基质细胞
二甲胺四环素促进骨髓基质细胞 增殖作用的研究 提要 为弄清二甲胺四环素增加摘除卵巢的老龄大鼠骨量作用的细胞分子基础，采用细胞增殖曲线的绘制和碱性磷酸酶测定方法，了解二甲胺四环素对成骨细胞和骨髓基质细胞的影响。结果：二甲胺四环素在体外具有刺激骨髓基质细胞和成骨细胞增殖的作用，但抑制细胞的分化。
THE RESEARCH OF THE ACTION OF MINOCYCLINE PROMOTING
THE BONE MARROW STROMAL CELL TO PROLIFERATE
, 百拇医药
Deng Li
School of Pharmacy,The Hospital of Oral Implantology
Li Bing
Department of Forensic Psychiatry
Peng Xuemei
West China University of Medical Sciences Chengdu 610041
ABSTRACT In order to make clear that the cell molecule base of minocycline increase the bone quantity of the old rats which were excised the ovaries, we knew the effect of minocycline to the osteoblast and marrow stromal cells by drawing the proliferation and determined the alkaline phosphatase. Result:minocycline can stimulate the proliferation of osteoblast and marrow stromal cell,but also can restrain the differentiation.
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Key Words Minocycline Osteoblast Bone morrow stromal cell
二甲胺四环素(minocycline,MC)具有增加摘除卵巢的老龄大鼠骨量的作用[1]，但是二甲胺四环素在体内是如何促进成骨细胞或成骨细胞的前驱细胞-骨髓基质细胞骨形成，这部分研究还未见有文献报道，据此，本实验对二甲胺四环素在体外对成骨细胞和骨髓基质细胞的作用进行探讨。
1 实验部分
1.1 材料
用淘汰种鼠Wister大鼠(雌、雄均可)的大腿骨培养骨髓基质细胞[2](BMSC)，以1×106有核细胞/cm2密度，在含15%小牛血清的α-MEM培养液中培养至细胞融合、传代，按以下所进行项目接种进行实验。二甲胺四环素(minocycline hydrochloride,Sigma公司)用0.05 mol/L HCl溶解制成贮备液待用。
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1.2 方法和结果
1.2.1 细胞增殖曲线的绘制 将BMSC以每孔5×104 cell/cm2密度接种到6孔板中，不添加二甲胺四环素为空白对照，二甲胺四环素以1、3、10 μg/ml的浓度添加，在不同时间点上将用EDTA配制的胰蛋白酶消化处理后的细胞，收集并计数，绘制增殖曲线。各组样本重复3次实验，并采用方差分析及两两比较进行统计学处理。与空白组比较，二甲胺四环素1 μg/ml和3 μg/ml添加组，明显出现早期细胞增殖作用，最大可增加50%(细胞数)，而10 μg/ml组则明显抑制细胞增殖(表1)。
Table 1 Effect of minocyclin on proliferate in osteoblast and bone marrow stromal numbers (cell/ml×104,
±s), 百拇医药
Groups
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Bone marrow stromal cell(d)
Osteoblast(d)
1
2
3
4
5
1
2
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5
1(μg/ml)
4
6.28
7.84
8.29
8.32**
8.38**
5.30
5.56
5.92
6.08
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3(μg/ml)
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6.49
8.01
8.82**
8.87**
8.91
5.82
6.46
7.21**
7.28**
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7.39
10(μg/ml)
4
5.38
5.46
5.49
5.56
5.64
5.18
5.29
5.36
5.47
5.58
, 百拇医药
Control
4
5.43
5.76
5.88
5.94
6.01
5.20
5.47
5.63
5.70
5.76
**P<0.01 compared with the control
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1.2.2 碱性磷酸酶活性的测定 将BMSC以每孔2×104 cell/cm2密度接种到24孔板中，不添加二甲胺四环素为空白对照，二甲胺四环素以1、3、10 μg/ml的浓度添加，培养6 d后，比色法测定碱性磷酸酶活性，分析方法同“1.2.1”。与空白组比较，二甲胺四环素各添加组均表现出抑制碱性磷酸酶活性的倾向(图1)。
Fig 1 Effect of minocycline on ALP action in bone marrow stromal cell vs control *P<0.05 **P<0.01
1.2.3 成骨细胞增殖曲线的绘制 采用成骨细胞样细胞MC3T3-E1以每孔5×104 cell/cm2密度接种到6孔板中，同“1.2.1”制成空白对照和二甲胺四环素组，并绘制增殖曲线，分析方法同“1.2.1”。成骨细胞样(MC3T3-E1)细胞与BMSC相同，3 μg/ml组表现早期促进细胞增殖作用，最大可增加28%(表1)。
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3 讨论
成骨细胞是骨的形成、骨骼发育与生长的重要细胞，骨髓基质细胞是成骨细胞的来源，已被证实骨髓基质细胞能被糖皮质激素诱导分化成具有成熟成骨细胞特征的细胞[3]，成骨细胞在骨的形成、骨骼的发育与生长过程中经历了细胞增殖、多层细胞结节形成、I型胶原合成、矿化增强、胶原成熟、细胞外基质中羟基磷灰石积累等过程。据此，把骨胶原基质的积累，碱性磷酸盐的出现和骨小结节矿化作为成骨细胞的表现型[4]。四环素除具有极强的骨亲和性外，还具有促进处于病理状态下的骨组织生长的活性，影响成骨细胞的结构和功能，恢复病理状态下成骨细胞的正常结构[5]，最近的研究发现投用MC后有增加摘除卵巢大鼠骨量的作用[1]。这表明四环素类药物为开发治疗骨质疏松症药物带来了生机。据此，对在体外就MC对成骨细胞和成骨细胞的前驱细胞-骨髓基质细胞的作用进行了观察。结果显示，MC在体外具有刺激骨髓基质细胞和成骨细胞增殖的作用，同时又显示出可能抑制细胞分化的作用，即MC在体内增加摘除卵巢大鼠骨量作用的切点与骨量增加在细胞中表现为成骨细胞增殖、分化最后成熟形成钙化不一致。四环素类药物与骨的结合依赖于骨细胞的活性。也有研究表明四环素并不依赖于骨细胞的生物活性与细胞内各组分的完整性，而是与骨组织中无机盐-羟基磷灰石反应的结果[6]。总之，四环素对成骨细胞活性是有影响的，推测在其反应过程中可能由于缺乏某种因子的参与和介导，或者由于没有充足无机盐成份的环境支持，导致细胞分化抑制的结果。因此寻找MC增加骨量作用的切点，体外实验研究还有待进一步进行。
, 百拇医药
*卫生部回国人员启动基金资助课题
参考文献
1 Willams S, Wakisaka A, Zeng QQ, et al. Minocycline prevents the decrease in bone mineral density and trabecular bone in ovariectomized aged rats. Bone,1996,19∶637
2 Keila S, Pitaru S, Grosskopf A, et al. Bono marrow from mechaniclly unloaded rat bones expresses reduced ostagenic in vitro. J Bone Miner Res,1994,9∶321
3 Owen M, Friedenstein AJ, Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp,1988,136∶42
, 百拇医药
4 QU Q, Perala-Heape A, Kapanen M. Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse mone marrow culture. Bone,1998,22(3)∶201
5 Kaneko H, Sasaki T, Ramamurthy NS, et al. Tetracycline administration normalizes the struction and acid phosphatase activity of osteoclasts in sterptozotocin-induced diabetes rats. Antomical Record,1990,227∶427
6 Sasaki,T,Ramamurthy,NS, Golub L, M.Tetracycline administration increases collagen synthesis in osteoblasts of streptozotocin-induced diabetic rats:A quantitative autoradiographic study. Calcif tiss Int,1992,50∶411, 百拇医药