毛细管胶束电动色谱法测定内江猪血清中的安替比林M*
作者：魏启欧 彭英** 王莉 蔡绍晖** 程惊秋 李幼平
单位：魏启欧 王莉 程惊秋 李幼平：华西医科大学附属第一医院 移植免疫实验室 成都 610041；彭英 蔡绍晖：华西医科大学基础医学院药理教研室
关键词：毛细管电泳；安替比林；猪血清；药物浓度
华西药学杂志990401 提要 而研究毛细管胶束电动色谱法(MEKC)测定血清安替比林的方法。以对-乙酰氨基酚为内标，采用MEKC技术，调节电泳缓冲液pH和表面活性剂SDS浓度，取得了最佳分离效果。最佳分析条件为50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(含50 mmol/L SDS，pH 9.01)；毛细管内径75 μm，有效长度40 cm，毛细管温度20℃，压力进样10 s，电压20 kV，254 nm UV检测。方法快速，电泳8 min即可完成对AP和AAP的有效分离和定量。在5～320 μg/ml范围内线性良好(r＝0.9999)。并研究了AP在内江猪体内的药代动力学，血药浓度-时间数据经3P87药动学软件处理得到药代动力学参数，发现内江猪对AP的代谢为二室开放模型，消除半衰期为62.35 min，血浆清除率为5.2 ml/(kg.min)。
, 百拇医药
DETERMINATION OF NEIJIANG PIGS’SERUM ANTIPYRINE
CONCENTRATION BY MICELLAR ELECTROKINETIC
CAPILLARY CHROMATOGRAPHY
Wei Qi’ou Peng Ying Wang Li Cai Shaohui Cheng Jingqiu Li Youping
(The First Affitiated Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT A micellar electrokinetic capillary chromatography method was developed to assay antipyrine in porcine blood serum. Sodium dodecyl sulfate was added to buffer solution as a surfactant, acetaminophen was added to serum as an internal standard. The influence of several factors such as pH and SDS concentration on the analysis was investigated. Final optimized condition was 40 cm×75 μm silica capillary, 50 mmol/L borate buffer (containing 50 mmol/L SDS, pH 9.01),10 s pressure load,20℃,20 kV for 8 min, 254 nm UV detection. The regression line was linear within the range of 5～320 μg/ml. To study the pharmacokinetic profile of antipyrine in adult pigs, three adult pigs were injected with 20 mg/kg antipyrine and all data were analyzed by pharmacokinetic software 3P87. Metabolism of antipyrine in adult pigs appeared to be a typical two-compartment model. The elimination half life was 62.35 min, the serum clearance was 5.2 ml/(kg.min).
, 百拇医药
Key Words Capillary electrophoresis Antipyrine Drug concentration in porcine serum
安替比林(antipyrine,AP)是常用探针药物之一，在体内主要通过肝脏进行代谢，测定其代谢情况可以反映肝脏氧化代谢功能。不同猪种肝脏功能评价是异种器官移植的重要前期工作，而测定AP血药浓度需要建立一种快速、准确的分析方法。采用毛细管电泳法，考查了电泳缓冲液pH、SDS浓度对分离效果和时间的影响，确定了最优测定条件。最后用此法测定了AP在内江猪体内的代谢情况。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
UV1601PC型紫外分光光度计(日本岛津)；P/ACE5510型毛细管电泳仪(美国Beckman)；Orion420A型pH计(美国Orion)；内径75 μm石英毛细管(河北永年光导纤维厂)。标准品(美国Sigma)；对-乙酰氨基酚(acetaminophen,AAP)(中国药品生物制品检定所)；硼酸、硼酸钠(成都化学试剂厂)分析纯，乙腈和SDS均为色谱纯。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 实验动物 中国成年内江猪3头[体重(40～60)kg]，按20 mg/kg静脉注射AP，给药后0、1、3、5、10、20、40、60、120、180、240、360、480 min及24 h经对侧上腔静脉采血各3 ml，血液凝固后2000 r/min离心10 min，分离血清立即保存于-70℃。
1.2.2 样品处理 取血清400 μl，加入内标溶液100 μl(含AAP 50 μg)，乙酸乙酯1 000 μl，旋涡混匀10 min，取乙酸乙酯层800 μl于试管内，挥发至干。残渣用缓冲液溶解后上样电泳。
2 结果
2.1 AP、AAP的紫外吸收光谱
从图1知，AP和AAP在254 nm有较强的吸收，故采用254 nm波长检测。
, 百拇医药
Fig 1 The absorbance spect-rum of antipyrine and acetaminophen
2.2 MEKC测定AP的条件优化
2.2.1 电泳缓冲液pH的选择 配制不同pH的50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(含50 mmol/L SDS)，对同一样品用此不同pH的缓冲液重复电泳，根据分离效率、峰形和迁移时间选择合适的pH。从表1可看出，pH近中性时，内标AAP分离效率最低，而AP则分离效率最高，但峰对称性差，并出现拖尾现象，迁移时间重复性也差。当pH为9.01时，则具有较高的分离效率，峰对称性较好，无拖尾现象，而且迁移时间基本恒定。
Table 1 Effect of pH on the separation of antipyrine and acetaminophen Buffer
, 百拇医药
pH
Theoretical
plates*
Peak symmetry**
Mean migration
time(min)
AAP
AP
AAP
AP
AAP
AP
, 百拇医药
7.05
7626
26887
1.756
0.890
3.011
6.322
7.71
9166
24198
1.17
1.064
3.181
, 百拇医药
5.011
8.20
9571
20658
1.13
1.194
3.312
4.639
8.73
9148
20379.5
1.022
1.123
, 百拇医药
3.553
4.900
9.01
17562
19039
0.973
1.013
4.170
6.133
9.61
19405
13909.0
0.839
, 百拇医药
0.886
4.253
5.039
*Theoretical plates:N=5.54(t/w1/2)2 **Peak symmetry=S1/S2
2.2.2电泳缓冲液中SDS浓度对分离的影响 配制含25、50、75、100 mmol/L SDS和不含SDS的50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(pH均为9.01)，在上述条件下考察AAP和AP电泳分离情况(表2)。从表2可以看出，随着SDS浓度增高，AAP和AP的电泳分离效率增加，出峰时间均延长；当SDS浓度为(75～100) mmol/L时，内标AAP峰形最好，峰对称指数接近为1，但引起AP峰拖尾，峰对称指数小于1。由此可见，SDS浓度增加虽能提高分离效率，但出峰时间则延长；同时，SDS浓度过高还引起拖尾现象。因此，电泳缓冲液中选择SDS浓度为50 mmol/L。
, http://www.100md.com
Table 2 Effect of SDS concentration on the separation of antipyrine and acetaminophen SDS
Conc.
(mmol/L)
Theoretical plates
Peak symmetry
Mean migration
time(min)
AAP
AP
AAP
, 百拇医药
AP
AAP
AP
0
46513
2072
0.621
1.341
3.102
2.772
25
40756
11935
, 百拇医药
0.699
0.926
3.519
4.165
50
68572
41423
0.923
0.902
4.101
6.102
75
79320
, 百拇医药
67738
0.998
0.875
4.631
7.699
100
87831
80962
1.085
0.842
4.811
8.315
2.3 电泳分离条件的确定
, http://www.100md.com
除缓冲液SDS浓度和pH外，还考察了进样时间、分离电压、毛细管长度和毛细管温度等对分离的影响。在保证较高分离效率的前提下，同时考虑到优化峰形和缩短出峰时间，确定毛细管电泳分离血清AP的最后条件为50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(内含50 mmol/L SDS，pH 9.01)，毛细管内径75 μm×40 cm，毛细管温度20℃，电压20 kV，电泳8 min，254 nm波长检测，电泳分离图谱见图2。
Fig 2 Separation of anti-pyrine and aceta-minophen
in Nei-jiang pigs' serum by MEKC
2.4 方法线性范围
在上述条件下，配制系例(5～320) μg/ml AP标准溶液，以AAP为内标；用峰面积比对浓度建立标准曲线，得到相关系数r＝0.9999。
, 百拇医药
2.5 内江猪静脉注射安替比林的药代动力学
成年内江猪3头，静脉注射AP 20 mg/kg后，不同时间采样后测定血药浓度，结果用3P87药动学软件处理。猪对AP的代谢为二室开放模型(表3)，其血浆清除率为5.2 ml/(kg.min)。
Table 3 The pharmacokinetic parameters of antipyrine metabolism in three adult Neijiang pigs Parameters
±SD
A(μg/ml)
81.15
±53.90
, 百拇医药
α(1/min)
0.71
±0.35
B(μg/ml)
44.42
±2.98
β(1/min)
0.012
±0.004
V(L/kg)
0.22
±0.09
, http://www.100md.com t1/2α(min)
1.45
±0.51
t1/2β(min)
62.35
±10.98
K21(1/min)
0.24
±0.01
K10(1/min)
0.03
, 百拇医药
±0.01
K12(1/min)
0.45
±0.33
AUC〔(μg/(ml.min)〕
4034.80
±600.18
Cls〔ml/(kg.min)〕
5.20
±0.90
, 百拇医药
3 讨论
AP体液中浓度常用高效液相色谱法测定，如血浆、尿液、唾液等样品中的AP分析[1～3]。但该法常需样品量较多，杂质峰常干扰，而且分析时间较长。毛细管电泳是80年代末期出现的一种新型分离、定量测定技术，已广泛地应用于核酸、氨基酸、蛋白质、药物研究等领域。国外已用毛细管电泳作药物代谢动力学研究、血药浓度监测等[4]。
毛细管胶束电动色谱技术(MEKC)是电泳和色谱相结合的分离技术，该法在毛细管电泳缓冲液中加入离子型表面活性剂形成胶束，使电中性物质能根据其在胶束相和水相的分配系数而进行分离。它是毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。由于SDS特殊的化学结构而被用作MEKC中常用的表面活性剂[5，6]。MEKC分离的条件优化可分成三类。第一类是对理论模型的优化，它对于影响分离的一些实验参数选择具指导意义，但不能预测实际样品的具体测定条件；第二类是从理论模型出发，推导出组分淌度或分离度和实验参数的关系，从而进行实验条件的优化，但这类方法对于未包括在理论模型中的实验参数(如添加剂，缓冲液浓度等)不优化；第三类方法是根据实验得到的分离情况进行优化，它不存在上述局限性。吴慧芳等[7]采用U58均匀设计法考察了5种因素对MEKC分离的影响，认为SDS浓度和缓冲液浓度对分离影响较大。Shigeru等[8]则认为在MEKC分离中，SDS浓度和缓冲液pH是主要影响因素，优化策略应在50 mmol/L SDS，50 mmol/L硼酸缓冲液基础上，逐一考察SDS浓度、pH和其它因素的影响。David等[9]采用MEKC方法测定了人唾液中AP浓度，并和HPLC方法进行了比较，测定结果相关良好(r＝0.99)。与HPLC不同的是，MEKC方法对唾液样品不需要预处理，而且耗时短。Lane等[10]用同样方法测定了AP在小鼠体内的药代动力学，发现该法重复性好，准确度高(测定浓度在10～25 μg/ml时加样回收率为(98.5～105.0)%)。在上述研究的基础上，重点考察了SDS和pH对MEKC分离AP的影响，根据实际的分离效果选择了最佳条件，在此条件下，以对乙酰氨基酚为内标，样品经简单处理上样电泳8 min即能对AP进行定量分析，方法线性范围广，特别实用于浓度范围变化较大的药代动力学研究。
, http://www.100md.com
临床上肝脏功能的评价具有极其重要的意义，一般通过测定内源性物质如胆红素、酶等间接反应肝脏的合成和代谢功能。而研究肝脏某一方面的特殊功能常采用外源性探针药物，其中AP能理想地反应肝脏功能特别是肝脏氧化代谢功能。AP体内代谢的唯一途径是通过肝脏微粒体氧化酶代谢，测定安替比林的清除率可以评价肝脏细胞色素P450代谢酶的活性。AP同血浆蛋白和组织蛋白结合率都很低，在体内分布迅速，一定程度上可以反应体内总水[11]。研究AP在猪体内的药代动力学，特别是研究猪肝脏对它的代谢，可反映猪肝脏对药物的耐受性和解毒功能；本研究发现猪对AP的消除半衰期为62.35 min，血浆清除率为5.2 ml/(kg.min)，这些参数对于异种移植用猪供体的研究和选择具有重要意义。
*国家自然科学基金重大项目资助课题(资助号39993430)；四川省重大科技攻关项目资助课题(资助号98B104)
参考文献
, 百拇医药
1 Sarkar MA, March C, Karnes HT. Solid phase extraction and simultaneous high performance liquid chromatographic determination of antipyrine and its major metabolites in urine. Biomed Chromatogr,1992,6(6)∶300
2 Echizen H, Nakura M, Ishizaki I. Rapid and simple high-performance liquid chromatographic determination of saliva antipyrine for routine antipyrine test. J Chromatogr,1990,526(1)∶296
3 Teumissen MWF, Meerbrug van der Torren JE, Uermeulen MPE, et al. Automated high-performance liquid chromatographic determination of antipyrine and its main metabolites in plasma, saliva and urine, including 4,4′-dihydroxyantipyrine. J Chromatogr, 1983,278(2)∶367
, 百拇医药
4 D Leveque, C Gallion-Renault, H Monteil, et al. Capillary electrophoresis for pharmacokinetic studies. J. Chromatogr (B),1997,697∶67
5 Khaledi MG, Smith SC, Strasters JK, Micellar electrokintic capillary chromatography of acidic Solutes:migration behavior and optimzation stratcgies. Annal. Chem,1991,(63)∶1820
6 Foley JP. Optimization of micellar electrokinetic chromatography. Annal. Chem,1990,(62)∶1302
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7 周同惠、林炳承、刘国诠主编.毛细管电泳进展，广州：华南理工大学出版社，1995.54
8 Shigern Terabe. Micellar electrokinetic chroma-tography. USA.1993.43
9 David Perrett, Gordon A, Ross. Rapid determination of drugs in biofluids by capillary electrophoresis. J Chromato (A),1995,(700)∶179
10 Lane J, Brunner. Serum antipyrine concentrations determined by micellar electrokinetic capillary chroma-tography.J Chromatogr.1993,(622)∶98
11 FF Uikers, TA Bowman, BH Dvorchik, et al. On the antipyrine test in laboratory animals. Studies in the dog and monkey. Drug Metab Dispos,1989,17(2)∶160, 百拇医药(魏启欧 彭英** 王莉 蔡绍晖** 程惊秋 李幼平)
单位：魏启欧 王莉 程惊秋 李幼平：华西医科大学附属第一医院 移植免疫实验室 成都 610041；彭英 蔡绍晖：华西医科大学基础医学院药理教研室
关键词：毛细管电泳；安替比林；猪血清；药物浓度
华西药学杂志990401 提要 而研究毛细管胶束电动色谱法(MEKC)测定血清安替比林的方法。以对-乙酰氨基酚为内标，采用MEKC技术，调节电泳缓冲液pH和表面活性剂SDS浓度，取得了最佳分离效果。最佳分析条件为50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(含50 mmol/L SDS，pH 9.01)；毛细管内径75 μm，有效长度40 cm，毛细管温度20℃，压力进样10 s，电压20 kV，254 nm UV检测。方法快速，电泳8 min即可完成对AP和AAP的有效分离和定量。在5～320 μg/ml范围内线性良好(r＝0.9999)。并研究了AP在内江猪体内的药代动力学，血药浓度-时间数据经3P87药动学软件处理得到药代动力学参数，发现内江猪对AP的代谢为二室开放模型，消除半衰期为62.35 min，血浆清除率为5.2 ml/(kg.min)。
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DETERMINATION OF NEIJIANG PIGS’SERUM ANTIPYRINE
CONCENTRATION BY MICELLAR ELECTROKINETIC
CAPILLARY CHROMATOGRAPHY
Wei Qi’ou Peng Ying Wang Li Cai Shaohui Cheng Jingqiu Li Youping
(The First Affitiated Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT A micellar electrokinetic capillary chromatography method was developed to assay antipyrine in porcine blood serum. Sodium dodecyl sulfate was added to buffer solution as a surfactant, acetaminophen was added to serum as an internal standard. The influence of several factors such as pH and SDS concentration on the analysis was investigated. Final optimized condition was 40 cm×75 μm silica capillary, 50 mmol/L borate buffer (containing 50 mmol/L SDS, pH 9.01),10 s pressure load,20℃,20 kV for 8 min, 254 nm UV detection. The regression line was linear within the range of 5～320 μg/ml. To study the pharmacokinetic profile of antipyrine in adult pigs, three adult pigs were injected with 20 mg/kg antipyrine and all data were analyzed by pharmacokinetic software 3P87. Metabolism of antipyrine in adult pigs appeared to be a typical two-compartment model. The elimination half life was 62.35 min, the serum clearance was 5.2 ml/(kg.min).
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Key Words Capillary electrophoresis Antipyrine Drug concentration in porcine serum
安替比林(antipyrine,AP)是常用探针药物之一，在体内主要通过肝脏进行代谢，测定其代谢情况可以反映肝脏氧化代谢功能。不同猪种肝脏功能评价是异种器官移植的重要前期工作，而测定AP血药浓度需要建立一种快速、准确的分析方法。采用毛细管电泳法，考查了电泳缓冲液pH、SDS浓度对分离效果和时间的影响，确定了最优测定条件。最后用此法测定了AP在内江猪体内的代谢情况。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
UV1601PC型紫外分光光度计(日本岛津)；P/ACE5510型毛细管电泳仪(美国Beckman)；Orion420A型pH计(美国Orion)；内径75 μm石英毛细管(河北永年光导纤维厂)。标准品(美国Sigma)；对-乙酰氨基酚(acetaminophen,AAP)(中国药品生物制品检定所)；硼酸、硼酸钠(成都化学试剂厂)分析纯，乙腈和SDS均为色谱纯。
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1.2 方法
1.2.1 实验动物 中国成年内江猪3头[体重(40～60)kg]，按20 mg/kg静脉注射AP，给药后0、1、3、5、10、20、40、60、120、180、240、360、480 min及24 h经对侧上腔静脉采血各3 ml，血液凝固后2000 r/min离心10 min，分离血清立即保存于-70℃。
1.2.2 样品处理 取血清400 μl，加入内标溶液100 μl(含AAP 50 μg)，乙酸乙酯1 000 μl，旋涡混匀10 min，取乙酸乙酯层800 μl于试管内，挥发至干。残渣用缓冲液溶解后上样电泳。
2 结果
2.1 AP、AAP的紫外吸收光谱
从图1知，AP和AAP在254 nm有较强的吸收，故采用254 nm波长检测。
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Fig 1 The absorbance spect-rum of antipyrine and acetaminophen
2.2 MEKC测定AP的条件优化
2.2.1 电泳缓冲液pH的选择 配制不同pH的50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(含50 mmol/L SDS)，对同一样品用此不同pH的缓冲液重复电泳，根据分离效率、峰形和迁移时间选择合适的pH。从表1可看出，pH近中性时，内标AAP分离效率最低，而AP则分离效率最高，但峰对称性差，并出现拖尾现象，迁移时间重复性也差。当pH为9.01时，则具有较高的分离效率，峰对称性较好，无拖尾现象，而且迁移时间基本恒定。
Table 1 Effect of pH on the separation of antipyrine and acetaminophen Buffer
, 百拇医药
pH
Theoretical
plates*
Peak symmetry**
Mean migration
time(min)
AAP
AP
AAP
AP
AAP
AP
, 百拇医药
7.05
7626
26887
1.756
0.890
3.011
6.322
7.71
9166
24198
1.17
1.064
3.181
, 百拇医药
5.011
8.20
9571
20658
1.13
1.194
3.312
4.639
8.73
9148
20379.5
1.022
1.123
, 百拇医药
3.553
4.900
9.01
17562
19039
0.973
1.013
4.170
6.133
9.61
19405
13909.0
0.839
, 百拇医药
0.886
4.253
5.039
*Theoretical plates:N=5.54(t/w1/2)2 **Peak symmetry=S1/S2
2.2.2电泳缓冲液中SDS浓度对分离的影响 配制含25、50、75、100 mmol/L SDS和不含SDS的50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(pH均为9.01)，在上述条件下考察AAP和AP电泳分离情况(表2)。从表2可以看出，随着SDS浓度增高，AAP和AP的电泳分离效率增加，出峰时间均延长；当SDS浓度为(75～100) mmol/L时，内标AAP峰形最好，峰对称指数接近为1，但引起AP峰拖尾，峰对称指数小于1。由此可见，SDS浓度增加虽能提高分离效率，但出峰时间则延长；同时，SDS浓度过高还引起拖尾现象。因此，电泳缓冲液中选择SDS浓度为50 mmol/L。
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Table 2 Effect of SDS concentration on the separation of antipyrine and acetaminophen SDS
Conc.
(mmol/L)
Theoretical plates
Peak symmetry
Mean migration
time(min)
AAP
AP
AAP
, 百拇医药
AP
AAP
AP
0
46513
2072
0.621
1.341
3.102
2.772
25
40756
11935
, 百拇医药
0.699
0.926
3.519
4.165
50
68572
41423
0.923
0.902
4.101
6.102
75
79320
, 百拇医药
67738
0.998
0.875
4.631
7.699
100
87831
80962
1.085
0.842
4.811
8.315
2.3 电泳分离条件的确定
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除缓冲液SDS浓度和pH外，还考察了进样时间、分离电压、毛细管长度和毛细管温度等对分离的影响。在保证较高分离效率的前提下，同时考虑到优化峰形和缩短出峰时间，确定毛细管电泳分离血清AP的最后条件为50 mmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液(内含50 mmol/L SDS，pH 9.01)，毛细管内径75 μm×40 cm，毛细管温度20℃，电压20 kV，电泳8 min，254 nm波长检测，电泳分离图谱见图2。
Fig 2 Separation of anti-pyrine and aceta-minophen
in Nei-jiang pigs' serum by MEKC
2.4 方法线性范围
在上述条件下，配制系例(5～320) μg/ml AP标准溶液，以AAP为内标；用峰面积比对浓度建立标准曲线，得到相关系数r＝0.9999。
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2.5 内江猪静脉注射安替比林的药代动力学
成年内江猪3头，静脉注射AP 20 mg/kg后，不同时间采样后测定血药浓度，结果用3P87药动学软件处理。猪对AP的代谢为二室开放模型(表3)，其血浆清除率为5.2 ml/(kg.min)。
Table 3 The pharmacokinetic parameters of antipyrine metabolism in three adult Neijiang pigs Parameters
±SDA(μg/ml)
81.15
±53.90
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α(1/min)
0.71
±0.35
B(μg/ml)
44.42
±2.98
β(1/min)
0.012
±0.004
V(L/kg)
0.22
±0.09
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1.45
±0.51
t1/2β(min)
62.35
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K21(1/min)
0.24
±0.01
K10(1/min)
0.03
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±0.01
K12(1/min)
0.45
±0.33
AUC〔(μg/(ml.min)〕
4034.80
±600.18
Cls〔ml/(kg.min)〕
5.20
±0.90
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3 讨论
AP体液中浓度常用高效液相色谱法测定，如血浆、尿液、唾液等样品中的AP分析[1～3]。但该法常需样品量较多，杂质峰常干扰，而且分析时间较长。毛细管电泳是80年代末期出现的一种新型分离、定量测定技术，已广泛地应用于核酸、氨基酸、蛋白质、药物研究等领域。国外已用毛细管电泳作药物代谢动力学研究、血药浓度监测等[4]。
毛细管胶束电动色谱技术(MEKC)是电泳和色谱相结合的分离技术，该法在毛细管电泳缓冲液中加入离子型表面活性剂形成胶束，使电中性物质能根据其在胶束相和水相的分配系数而进行分离。它是毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。由于SDS特殊的化学结构而被用作MEKC中常用的表面活性剂[5，6]。MEKC分离的条件优化可分成三类。第一类是对理论模型的优化，它对于影响分离的一些实验参数选择具指导意义，但不能预测实际样品的具体测定条件；第二类是从理论模型出发，推导出组分淌度或分离度和实验参数的关系，从而进行实验条件的优化，但这类方法对于未包括在理论模型中的实验参数(如添加剂，缓冲液浓度等)不优化；第三类方法是根据实验得到的分离情况进行优化，它不存在上述局限性。吴慧芳等[7]采用U58均匀设计法考察了5种因素对MEKC分离的影响，认为SDS浓度和缓冲液浓度对分离影响较大。Shigeru等[8]则认为在MEKC分离中，SDS浓度和缓冲液pH是主要影响因素，优化策略应在50 mmol/L SDS，50 mmol/L硼酸缓冲液基础上，逐一考察SDS浓度、pH和其它因素的影响。David等[9]采用MEKC方法测定了人唾液中AP浓度，并和HPLC方法进行了比较，测定结果相关良好(r＝0.99)。与HPLC不同的是，MEKC方法对唾液样品不需要预处理，而且耗时短。Lane等[10]用同样方法测定了AP在小鼠体内的药代动力学，发现该法重复性好，准确度高(测定浓度在10～25 μg/ml时加样回收率为(98.5～105.0)%)。在上述研究的基础上，重点考察了SDS和pH对MEKC分离AP的影响，根据实际的分离效果选择了最佳条件，在此条件下，以对乙酰氨基酚为内标，样品经简单处理上样电泳8 min即能对AP进行定量分析，方法线性范围广，特别实用于浓度范围变化较大的药代动力学研究。
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临床上肝脏功能的评价具有极其重要的意义，一般通过测定内源性物质如胆红素、酶等间接反应肝脏的合成和代谢功能。而研究肝脏某一方面的特殊功能常采用外源性探针药物，其中AP能理想地反应肝脏功能特别是肝脏氧化代谢功能。AP体内代谢的唯一途径是通过肝脏微粒体氧化酶代谢，测定安替比林的清除率可以评价肝脏细胞色素P450代谢酶的活性。AP同血浆蛋白和组织蛋白结合率都很低，在体内分布迅速，一定程度上可以反应体内总水[11]。研究AP在猪体内的药代动力学，特别是研究猪肝脏对它的代谢，可反映猪肝脏对药物的耐受性和解毒功能；本研究发现猪对AP的消除半衰期为62.35 min，血浆清除率为5.2 ml/(kg.min)，这些参数对于异种移植用猪供体的研究和选择具有重要意义。
*国家自然科学基金重大项目资助课题(资助号39993430)；四川省重大科技攻关项目资助课题(资助号98B104)
参考文献
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3 Teumissen MWF, Meerbrug van der Torren JE, Uermeulen MPE, et al. Automated high-performance liquid chromatographic determination of antipyrine and its main metabolites in plasma, saliva and urine, including 4,4′-dihydroxyantipyrine. J Chromatogr, 1983,278(2)∶367
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10 Lane J, Brunner. Serum antipyrine concentrations determined by micellar electrokinetic capillary chroma-tography.J Chromatogr.1993,(622)∶98
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