HPLC法测定低分子量肝素钠的分子量及其分布
作者：何书英 王 勇
单位：何书英(南京南大药业有限责任公司 南京 210093)；王 勇(南京大学医学院药物所 南京 210093)
关键词：低分子量肝素钠；HPLC；分子量；分子量分布
华西药学杂志990532 提要 采用HPLC法对低分子量肝素钠(LMWH)分子量及其分布进行了测定。流动相选用2.84%的硫酸钠溶液，采用紫外检测器与示差折光检测器串联连接，紫外检测波长234 nm，色谱柱为Protein-Pak Φ8 mm×300 mm。结果表明：所测三批LMWH的重均分子量分别为3 158 D,4 387D,4 226D；其中分子量小于8 000D的量分别为86.2%，89.4%，87.8%，符合英国药典1993年增补版标准。
DETERMINATION OF MOLECULAR WEIGHT AND ITS
, http://www.100md.com
DISTRIBUTION OF LMWH BY HPLC
He Shuying Wang Yong*
(Nanjing Nanda Pharmaceutical Co. Ltd, Pharmaceutical Institute of Nanjing University* Nanjing 210093)
ABSTRACT To develop a HPLC analytical method for determination of molecular weight and its distribution of low molecular weight heparins(LMWH). Chromatographic condition included mobile phase 2.84%(w/v) solution of sodium sulphate, the differential refractometer (RI) detector connect to the UV detector (234 nm), column was protein-pak Φ8 mm×300 mm.The results showed that the molecular weight and its distribution of LMWH (9701,9702,9703) were 3 158D, 4 387D, 4 226D and 86.2%, 89.4%, 87.8% correspondingly. It proved that the molecular and its distribution of LMWH(9701, 9702, 9703) conform to BP criterion.
, 百拇医药
Key Words LMWH HPLC Molecular Molecular weight distribution
低分子量肝素钠是商品肝素钠经化学解聚而得的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，临床上主要用于术后深静脉血栓、不稳定性心绞痛及血液透析等。近年来，国内外对低分子量肝素的剂型及临床应用报道较多，但以HPLC法测定其分子量报道较少，现采用HPLC法对LMWH分子量及其分布进行测定。
1 实验部分
1.1 仪器、药品及试剂
高效液相色谱仪(Waters公司)。低分子量肝素标准品(HO 190 000，进口，Mna为3 700)；供试品三批(色谱自制)；所用试剂均为色谱纯。
1.2 方法[1]与结果
, 百拇医药
以Protein-Pak Φ8 mm×300 mm为色谱柱，选用2.84%(w/v)硫酸钠作流动相，柱温40℃，示差折光检测器进口与UV检测器出口相连，紫外检测波长为234 nm。
精密称取低分子量肝素标准品及供试品，按10 mg/ml的比例加流动相溶解；用流动相配制0.01 mol/L的NaN3溶液。按以上条件进样，进样量10 μl，用NaN3测得紫外检测器与示差折光检测器出峰时间有一定的间隔，其间隔时间为15 s，标准品的UV色谱图及RI色谱图见图1(a，b)，供试品的RI色谱图见图2。
Fig 1 UV and RI chromatogram of LMWH for calibration
, 百拇医药
Fig 2 RI chromatogram of LMWH
根据标准品在RI曲线及UV234曲线下的面积计算r,r=ΣRI/ΣUV234[2]；图谱上任一点的分子量Mi=Mna RIi/r UV234i(Mna为低分子量肝素标准品的数均分子量3 700，RIi为此点的RI面积，UV234i为此点的UV234面积)，则供试品的重均分子量Mw＝Σ(RIi Mi)/ΣRIi。分子量分布按RI色谱图下小于8 000D的RI面积占RI总面积的百分数，结果见表1。
Table 1 The molecular weight and its distribution results of LMWH Batch NO.
, 百拇医药
mw
Molecular wieght distribution
9707
3158D
86.2%
9702
4387D
89.4%
9703
4226D
87.8%
2 讨论
, 百拇医药
低分子量肝素的生物活性与其分子量及分子量分布密切相关，随着分子量的降低，其抗FⅡa活性下降，因此低分子量肝素的分子量及分布是产品质量控制的关键指标。以往曾采用粘度法测定LMWH的分子量[3]，但此法不能考察其分子量的分布情况，实验采用HPLC方法，快速准确地测定了LMWH的分子量及其分布。
由于示差折光检测器与紫外检测器串联连接，因此由其产生的色谱图之间有时间间隔，通过NaN3可准确测定二者的时间差，使所测数值更准确。另外，通过RI图谱发现，盐峰、溶剂峰与主峰保留时间较接近，如何使其影响更小是今后有待解决的问题。
参考文献
1 Fareed J, Walenga JM, Hoppensteadt D, et al. Comparative study on the in vitro and in vivo activitics of seven low-molecular weight heparins. Haemostasis, 1988, 18(3)∶3
2 British Pharmacopoeia. 1993. suppl 1335
3 杨春雷，陶元器，曹跃琼.肝素平均分子量的粘度法测定.中国药学杂志，1995，(7)∶439, 百拇医药
单位：何书英(南京南大药业有限责任公司 南京 210093)；王 勇(南京大学医学院药物所 南京 210093)
关键词：低分子量肝素钠；HPLC；分子量；分子量分布
华西药学杂志990532 提要 采用HPLC法对低分子量肝素钠(LMWH)分子量及其分布进行了测定。流动相选用2.84%的硫酸钠溶液，采用紫外检测器与示差折光检测器串联连接，紫外检测波长234 nm，色谱柱为Protein-Pak Φ8 mm×300 mm。结果表明：所测三批LMWH的重均分子量分别为3 158 D,4 387D,4 226D；其中分子量小于8 000D的量分别为86.2%，89.4%，87.8%，符合英国药典1993年增补版标准。
DETERMINATION OF MOLECULAR WEIGHT AND ITS
, http://www.100md.com
DISTRIBUTION OF LMWH BY HPLC
He Shuying Wang Yong*
(Nanjing Nanda Pharmaceutical Co. Ltd, Pharmaceutical Institute of Nanjing University* Nanjing 210093)
ABSTRACT To develop a HPLC analytical method for determination of molecular weight and its distribution of low molecular weight heparins(LMWH). Chromatographic condition included mobile phase 2.84%(w/v) solution of sodium sulphate, the differential refractometer (RI) detector connect to the UV detector (234 nm), column was protein-pak Φ8 mm×300 mm.The results showed that the molecular weight and its distribution of LMWH (9701,9702,9703) were 3 158D, 4 387D, 4 226D and 86.2%, 89.4%, 87.8% correspondingly. It proved that the molecular and its distribution of LMWH(9701, 9702, 9703) conform to BP criterion.
, 百拇医药
Key Words LMWH HPLC Molecular Molecular weight distribution
低分子量肝素钠是商品肝素钠经化学解聚而得的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，临床上主要用于术后深静脉血栓、不稳定性心绞痛及血液透析等。近年来，国内外对低分子量肝素的剂型及临床应用报道较多，但以HPLC法测定其分子量报道较少，现采用HPLC法对LMWH分子量及其分布进行测定。
1 实验部分
1.1 仪器、药品及试剂
高效液相色谱仪(Waters公司)。低分子量肝素标准品(HO 190 000，进口，Mna为3 700)；供试品三批(色谱自制)；所用试剂均为色谱纯。
1.2 方法[1]与结果
, 百拇医药
以Protein-Pak Φ8 mm×300 mm为色谱柱，选用2.84%(w/v)硫酸钠作流动相，柱温40℃，示差折光检测器进口与UV检测器出口相连，紫外检测波长为234 nm。
精密称取低分子量肝素标准品及供试品，按10 mg/ml的比例加流动相溶解；用流动相配制0.01 mol/L的NaN3溶液。按以上条件进样，进样量10 μl，用NaN3测得紫外检测器与示差折光检测器出峰时间有一定的间隔，其间隔时间为15 s，标准品的UV色谱图及RI色谱图见图1(a，b)，供试品的RI色谱图见图2。
Fig 1 UV and RI chromatogram of LMWH for calibration
, 百拇医药
Fig 2 RI chromatogram of LMWH
根据标准品在RI曲线及UV234曲线下的面积计算r,r=ΣRI/ΣUV234[2]；图谱上任一点的分子量Mi=Mna RIi/r UV234i(Mna为低分子量肝素标准品的数均分子量3 700，RIi为此点的RI面积，UV234i为此点的UV234面积)，则供试品的重均分子量Mw＝Σ(RIi Mi)/ΣRIi。分子量分布按RI色谱图下小于8 000D的RI面积占RI总面积的百分数，结果见表1。
Table 1 The molecular weight and its distribution results of LMWH Batch NO.
, 百拇医药
mw
Molecular wieght distribution
9707
3158D
86.2%
9702
4387D
89.4%
9703
4226D
87.8%
2 讨论
, 百拇医药
低分子量肝素的生物活性与其分子量及分子量分布密切相关，随着分子量的降低，其抗FⅡa活性下降，因此低分子量肝素的分子量及分布是产品质量控制的关键指标。以往曾采用粘度法测定LMWH的分子量[3]，但此法不能考察其分子量的分布情况，实验采用HPLC方法，快速准确地测定了LMWH的分子量及其分布。
由于示差折光检测器与紫外检测器串联连接，因此由其产生的色谱图之间有时间间隔，通过NaN3可准确测定二者的时间差，使所测数值更准确。另外，通过RI图谱发现，盐峰、溶剂峰与主峰保留时间较接近，如何使其影响更小是今后有待解决的问题。
参考文献
1 Fareed J, Walenga JM, Hoppensteadt D, et al. Comparative study on the in vitro and in vivo activitics of seven low-molecular weight heparins. Haemostasis, 1988, 18(3)∶3
2 British Pharmacopoeia. 1993. suppl 1335
3 杨春雷，陶元器，曹跃琼.肝素平均分子量的粘度法测定.中国药学杂志，1995，(7)∶439, 百拇医药