AP对正常和内毒素化大鼠脾细胞体外分泌细胞因子的影响
作者：王 莉 杜俊蓉* 蔡绍晖** 朱 玲** 岑小波 陈淑杰 唐 琼* 包定元* 长谷川高明***
单位：华西医科大学附一院，药学院*，基础医学院** 成都 610041
关键词：巴巴多斯芦荟多糖提取物；细胞因子；免疫调节
华西药学杂志990516 提要 从分子免疫水平探讨了巴巴多斯芦荟多糖提取物(AP)对免疫系统的作用。结果表明巴巴多斯芦荟多糖提取物对体外正常大鼠脾细胞分泌IL-1、IL-6、TNFα等细胞因子均有一定的促进作用，而对内毒素诱导脾细胞分泌的细胞因子IL-1、IL-6、TNFα有显著抑制作用。对IL-2的分泌在以上两种情况下均表现促进作用。显示巴巴多斯芦荟多糖提取物对细胞因子的分泌可产生双向调控作用。
, http://www.100md.com
EFFECT OF POLYSACCHARIDE EXTRACT FROM
ALOE MILLER BARBADENSIS ON THE RELEASE OF
CYTOKINE IN RATS AND ENDOTOXEMIA RATS
Wang Li Du Junrong Cai Shaohui Zhu Ling Cen Xiaobo
Chen Shujie Tang Qiong Bao Dingyuan Hasegawa Takaaki*
(The First University Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
, 百拇医药
ABSTRACT The effect of polysaccharide extract from Aloe miller Barbadensis on release of cytokine was studied.BarBadensis Aloe Vera polysaccharide extract could increase release of cytokine IL-1、IL-6、TNF-α from spleen cell in vitro in rats; but it inhibited IL-1、IL-6、TNFα that released from endotoxemia rats. In addition, it could increase IL-2 release. It can be concluded that Aloe miller polysaccharide extract have biphasic regulation of immune response.
Key Words Aloe miller polysaccharide extract Cytokine Endotoxemia
, 百拇医药
细胞因子在免疫调节中发挥着极其重要的作用，对细胞因子的研究可以阐明免疫调节作用的机制。巴巴多斯芦荟多糖提取物对细胞因子分泌的影响研究不多。实验旨在研究巴巴多斯芦荟多糖提取物对体外正常与内毒素(LPS)诱导大鼠脾细胞分泌细胞因子的影响。
1 实验部分
1.1 材料 Wistar大鼠(华西医科大学实验动物中心，川实动管质第71号)，雄性，体重(200±20) g；C57/8小鼠(华西医科大学实验动物中心，川实动管质第68号)；培养依赖细胞株CTLL、L929(华西医科大学免疫室)。
1.2 药品与仪器
巴巴多斯芦荟多糖提取物(AP，成都赛维芦荟公司)分子量为15 000以上的多糖，其含量为80%冷冻干燥制品，外观呈白色粉末状，用生理盐水配制成所需浓度。肺炎杆菌内毒素[1](日本名古屋大学医学部细菌学研究室馈赠)；细胞因子标准品即基因重组白细胞介素1(rIL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)由美国Gibco公司提供；基因重组白细胞介素2(rIL-2)、四甲基偶氮唑(MTT)(Sigma)；IL-6、刀豆蛋白(COnA)(德国BM公司)；放线菌素D、十二烷基磺酸钠SDS(上海化学试剂厂)；二甲基甲酰胺(DMF)(天津试剂二厂)。
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二氮化碳孵箱(Shellab，美国)；酶标测定仪(Biorad model 550)；多头细胞收集仪。
1.2 实验方法[2]
将50只大鼠随机分为5组，无菌条件下取大鼠脾脏，用1640培养基配制成2×106/ml脾细胞悬液，然后按各实验组要求分别加入生理盐水，调制成2×106/ml脾细胞生理盐水及AP 20、10、3.75、1.25 mg/ml的细胞悬液。另取50只大鼠随机分为5组，取其脾脏，无菌条件下制成2×106/ml脾细胞悬液，分别加入20 μg/ml LPS，20 μg/ml LPS+20 mg/ml AP，20 μg/ml LPS+10 mg/ml AP，20 μg/ml LPS+3.75 mg/ml AP，20 μg/ml LPS+1.25 μg/ml AP。加入内毒素及AP后细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h。收集细胞培养上清液，4℃保存待检。
, 百拇医药
1.2.1 IL-1活性的测定(3H-TdR掺入法)
C57/8小鼠眼眶放血处死，在无菌条件下取胸腺，用1640培养基调制成1×107/ml细胞悬液，取细胞悬液加入96孔板，100 μl/孔，ConA 2 μg/孔，再加入待检细胞培养上清液25 μl/孔，每份样品作复孔，同时作标准rIL-1，对照及细胞培养上清液对照用5%完全1640每孔补足200 μl，37℃，5%CO2培养72 h，终止培养前6 h加3H-TdR3.7×104Bq/孔，用多头细胞收集仪收集细胞测CPM值，计算IL-1活性。
1.2.2 IL-2活性测定(MTT法) 传代培养依赖性CTL2用1640培养基调制成1×105/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，100 μl/孔，加待检上清液100 μl/孔，每份样品作复孔，同时作标准品及培养液对照，37℃ 5%CO2培养24 h，离心去上清110 μl，每孔加入10 μl MTT，37℃ 5%CO2培养6 h，加入20% SDS-50% DMF溶解液100 μl，37℃ 3 h，用酶标测定仪测定各孔OD570及OD630值。按下式计算IL-2活性单位。
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1.2.3 IL-6活性测定(3H-TdR掺入法) 传代培养依赖株细胞MH60，用5%完全1640制成1×106/ml 细胞悬液加入96孔细胞培养板，100 μl/孔，加待检上清液25 μl/孔，每份样品作复孔，同时作标准孔(rIL-6)对照及细胞培养上清液，用1640培养基每孔补足200 μl，37℃，5%CO2培养72 h，终止培养前6 h加3H-TdR，3.7×104 Bq/孔，多头细胞收集仪收集细胞，测CPM值，按下式计算IL-6活性。
1.2.4 TNF-α活性测定(MTT法) 传代培养依赖株细胞L929，用1640培养基调制成1×106/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，50 μl/孔，放线菌素D 4 μg/孔，加待检上清液25 μl/孔，每份样品作多孔，同时作标准品及培养液对照，5%1640补足200 μl/孔，37℃、5%CO2培养18 h，加入MTT 5 μg/孔，37℃ 5%CO2培养6 h，加入20%SDS及50%DMF溶解液100 μl/孔，37℃3 h，测OD570及OD630值，按下式计算TNF-α活性单位。
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1.3 结果
AP在体外能显著促进正常脾细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6，且呈剂量效应关系(r分别为0.99、0.98、0.97、0.99)。20 mg/ml AP可使上述各细胞因子的分泌分别提高114.0%、87.3%、112.5%及87.27%；当浓度为10 mg/ml，可使上述各细胞因子的分泌分别提高85.65%、50.92%、87.5%及60.9%(表1)。AP对LPS诱生脾细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6的升高具有显著抑制作用，且其抑制作用与剂量相关 (r分别为0.996、0.94、0.99)。多糖提取浓度为20 mg/ml时，内毒素诱生脾细胞分泌细胞因子的抑制率分别为52.82%，42.5%及41.05%；在浓度为10 mg/ml时，其抑制率分别为27.82%，26.5%，25.65%。但对于内毒素化脾细胞，IL-2分泌仍为促进作用，上述两剂量组IL-2分泌增长率分别为44.04%和37.36%，与剂量相关(r为0.98)(表2)。
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Table 1 Effect of Aloe Vera extract on cytokine released
of spleen cell in vitro Groups
Rats
TNFα(IU/ml)
IL-1(ng/ml)
IL-2(IU/ml)
IL-6(IU/ml)
0.9% NaCl
10
4.67±2.27
, 百拇医药
0.055±0.003
4.0±2.0
8.17±3.7
AP 20mg/ml
10
10.0±3.0***
0.103±0.003***
8.5±1.0**
15.3±3.0***
AP 10mg/ml
10
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8.67±1.42***
0.088±0.010**
7.5±1.9***
12.3±2.7***
AP 3.75mg/ml
10
7.83±1.73***
0.068±0.013**
5.8±1.4*
9.33±1.07*
, 百拇医药
AP 1.25mg/ml
10
7.16±1.14***
0.058±0.025
5.16±1.7
8.5±2.2
Compared with 0.9% NaCl * P<0.05， **P<0.01， *** P<0.001
Table 2 Effect of Aloe Vera extract on cytokine released of spleen cell in vitro in endotoxemia rats Groups
, 百拇医药
Rats
TNFα(IU/ml)
IL-1(ng/ml)
IL-2(IU/ml)
IL-6(IU/ml)
LPS 20μg/ml
10
41.3±3.33
0.80±0.05
12.5±4.3
65.0 ±5.62
LPS+AP 20mg/ml
, 百拇医药
10
19.5±3.42***
0.32±0.01***
18.0±3.1***
38.32±3.9***
LPS+AP 10mg/ml
10
29.8±3.19***
0.46±0.03***
17.2±2.6**
, 百拇医药
48.33±2.17***
LPS+AP 1.25mg/ml
10
41.0±2.48
0.78±0.09
12.0±1.4
60.83±4.65
Compared with LPS * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
2 讨论
AP对体外正常脾细胞分泌细胞因子TNFα、IL-1、IL-6具有显著促进作用，对内毒素诱导脾细胞分泌细胞因子TNFα、IL-1、IL-6具有显著抑制作用。对IL-2分泌的影响在以上两种情况下，均显示促进作用。恶性肿瘤、原发性和继发性免疫缺陷患者的IL-2明显减少，补充IL-2可促进免疫功能的恢复。美国FDA 1985年批准用IL-2联用LAK细胞协同治疗恶性患者，疗效较好。目前用IL-2治疗肾癌和黑色素癌的疗效已肯定。
, 百拇医药
本研究表明AP在正常条件下促进白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放，而对感染状态下由细菌产生内毒素所导致的过度释放具有显著抑制作用，IL-2均表现为正增长作用，表明巴巴多斯芦荟多糖提取物对炎症反应的免疫应答过程具有双相调节免疫功能作用。对自身免疫性疾病、肿瘤、恶病质综合症等的辅助治疗有着积极意义，有良好的临床应用价值[3～5]。
***日本名古屋大学医学部
参考文献
1 Wang L, Hasegawa T, Nadai M.The effect of lipopolysaceharide (LPS) on the disposition of xanthines in rats. J Pharmacol,1993, 45∶34
2 陈奇主编.中药药理研究方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996
, 百拇医药
3 Bruce WGG. Investigations of antibacterial activity in the Aloe. S Afr Med J,1967,41(38)∶984
4 Davis RH, Leitner MG. To pical anti-inflammatory activity of Aloe vera as measured by ear swelling. Journal of the American Podiatric Medical Association,1987,77(11)∶610
5 芦荟素的抗肿瘤、抗炎及免疫促进活性.国外医学中医中药分册,1988,10(5)∶58, 百拇医药(王 莉 杜俊蓉* 蔡绍晖** 朱 玲** 岑小波 陈淑杰 唐 琼* 包定元* 长谷川高明***)
单位：华西医科大学附一院，药学院*，基础医学院** 成都 610041
关键词：巴巴多斯芦荟多糖提取物；细胞因子；免疫调节
华西药学杂志990516 提要 从分子免疫水平探讨了巴巴多斯芦荟多糖提取物(AP)对免疫系统的作用。结果表明巴巴多斯芦荟多糖提取物对体外正常大鼠脾细胞分泌IL-1、IL-6、TNFα等细胞因子均有一定的促进作用，而对内毒素诱导脾细胞分泌的细胞因子IL-1、IL-6、TNFα有显著抑制作用。对IL-2的分泌在以上两种情况下均表现促进作用。显示巴巴多斯芦荟多糖提取物对细胞因子的分泌可产生双向调控作用。
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EFFECT OF POLYSACCHARIDE EXTRACT FROM
ALOE MILLER BARBADENSIS ON THE RELEASE OF
CYTOKINE IN RATS AND ENDOTOXEMIA RATS
Wang Li Du Junrong Cai Shaohui Zhu Ling Cen Xiaobo
Chen Shujie Tang Qiong Bao Dingyuan Hasegawa Takaaki*
(The First University Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
, 百拇医药
ABSTRACT The effect of polysaccharide extract from Aloe miller Barbadensis on release of cytokine was studied.BarBadensis Aloe Vera polysaccharide extract could increase release of cytokine IL-1、IL-6、TNF-α from spleen cell in vitro in rats; but it inhibited IL-1、IL-6、TNFα that released from endotoxemia rats. In addition, it could increase IL-2 release. It can be concluded that Aloe miller polysaccharide extract have biphasic regulation of immune response.
Key Words Aloe miller polysaccharide extract Cytokine Endotoxemia
, 百拇医药
细胞因子在免疫调节中发挥着极其重要的作用，对细胞因子的研究可以阐明免疫调节作用的机制。巴巴多斯芦荟多糖提取物对细胞因子分泌的影响研究不多。实验旨在研究巴巴多斯芦荟多糖提取物对体外正常与内毒素(LPS)诱导大鼠脾细胞分泌细胞因子的影响。
1 实验部分
1.1 材料 Wistar大鼠(华西医科大学实验动物中心，川实动管质第71号)，雄性，体重(200±20) g；C57/8小鼠(华西医科大学实验动物中心，川实动管质第68号)；培养依赖细胞株CTLL、L929(华西医科大学免疫室)。
1.2 药品与仪器
巴巴多斯芦荟多糖提取物(AP，成都赛维芦荟公司)分子量为15 000以上的多糖，其含量为80%冷冻干燥制品，外观呈白色粉末状，用生理盐水配制成所需浓度。肺炎杆菌内毒素[1](日本名古屋大学医学部细菌学研究室馈赠)；细胞因子标准品即基因重组白细胞介素1(rIL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)由美国Gibco公司提供；基因重组白细胞介素2(rIL-2)、四甲基偶氮唑(MTT)(Sigma)；IL-6、刀豆蛋白(COnA)(德国BM公司)；放线菌素D、十二烷基磺酸钠SDS(上海化学试剂厂)；二甲基甲酰胺(DMF)(天津试剂二厂)。
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二氮化碳孵箱(Shellab，美国)；酶标测定仪(Biorad model 550)；多头细胞收集仪。
1.2 实验方法[2]
将50只大鼠随机分为5组，无菌条件下取大鼠脾脏，用1640培养基配制成2×106/ml脾细胞悬液，然后按各实验组要求分别加入生理盐水，调制成2×106/ml脾细胞生理盐水及AP 20、10、3.75、1.25 mg/ml的细胞悬液。另取50只大鼠随机分为5组，取其脾脏，无菌条件下制成2×106/ml脾细胞悬液，分别加入20 μg/ml LPS，20 μg/ml LPS+20 mg/ml AP，20 μg/ml LPS+10 mg/ml AP，20 μg/ml LPS+3.75 mg/ml AP，20 μg/ml LPS+1.25 μg/ml AP。加入内毒素及AP后细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h。收集细胞培养上清液，4℃保存待检。
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1.2.1 IL-1活性的测定(3H-TdR掺入法)
C57/8小鼠眼眶放血处死，在无菌条件下取胸腺，用1640培养基调制成1×107/ml细胞悬液，取细胞悬液加入96孔板，100 μl/孔，ConA 2 μg/孔，再加入待检细胞培养上清液25 μl/孔，每份样品作复孔，同时作标准rIL-1，对照及细胞培养上清液对照用5%完全1640每孔补足200 μl，37℃，5%CO2培养72 h，终止培养前6 h加3H-TdR3.7×104Bq/孔，用多头细胞收集仪收集细胞测CPM值，计算IL-1活性。
1.2.2 IL-2活性测定(MTT法) 传代培养依赖性CTL2用1640培养基调制成1×105/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，100 μl/孔，加待检上清液100 μl/孔，每份样品作复孔，同时作标准品及培养液对照，37℃ 5%CO2培养24 h，离心去上清110 μl，每孔加入10 μl MTT，37℃ 5%CO2培养6 h，加入20% SDS-50% DMF溶解液100 μl，37℃ 3 h，用酶标测定仪测定各孔OD570及OD630值。按下式计算IL-2活性单位。
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1.2.3 IL-6活性测定(3H-TdR掺入法) 传代培养依赖株细胞MH60，用5%完全1640制成1×106/ml 细胞悬液加入96孔细胞培养板，100 μl/孔，加待检上清液25 μl/孔，每份样品作复孔，同时作标准孔(rIL-6)对照及细胞培养上清液，用1640培养基每孔补足200 μl，37℃，5%CO2培养72 h，终止培养前6 h加3H-TdR，3.7×104 Bq/孔，多头细胞收集仪收集细胞，测CPM值，按下式计算IL-6活性。
1.2.4 TNF-α活性测定(MTT法) 传代培养依赖株细胞L929，用1640培养基调制成1×106/ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，50 μl/孔，放线菌素D 4 μg/孔，加待检上清液25 μl/孔，每份样品作多孔，同时作标准品及培养液对照，5%1640补足200 μl/孔，37℃、5%CO2培养18 h，加入MTT 5 μg/孔，37℃ 5%CO2培养6 h，加入20%SDS及50%DMF溶解液100 μl/孔，37℃3 h，测OD570及OD630值，按下式计算TNF-α活性单位。
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1.3 结果
AP在体外能显著促进正常脾细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6，且呈剂量效应关系(r分别为0.99、0.98、0.97、0.99)。20 mg/ml AP可使上述各细胞因子的分泌分别提高114.0%、87.3%、112.5%及87.27%；当浓度为10 mg/ml，可使上述各细胞因子的分泌分别提高85.65%、50.92%、87.5%及60.9%(表1)。AP对LPS诱生脾细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6的升高具有显著抑制作用，且其抑制作用与剂量相关 (r分别为0.996、0.94、0.99)。多糖提取浓度为20 mg/ml时，内毒素诱生脾细胞分泌细胞因子的抑制率分别为52.82%，42.5%及41.05%；在浓度为10 mg/ml时，其抑制率分别为27.82%，26.5%，25.65%。但对于内毒素化脾细胞，IL-2分泌仍为促进作用，上述两剂量组IL-2分泌增长率分别为44.04%和37.36%，与剂量相关(r为0.98)(表2)。
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Table 1 Effect of Aloe Vera extract on cytokine released
of spleen cell in vitro Groups
Rats
TNFα(IU/ml)
IL-1(ng/ml)
IL-2(IU/ml)
IL-6(IU/ml)
0.9% NaCl
10
4.67±2.27
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0.055±0.003
4.0±2.0
8.17±3.7
AP 20mg/ml
10
10.0±3.0***
0.103±0.003***
8.5±1.0**
15.3±3.0***
AP 10mg/ml
10
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8.67±1.42***
0.088±0.010**
7.5±1.9***
12.3±2.7***
AP 3.75mg/ml
10
7.83±1.73***
0.068±0.013**
5.8±1.4*
9.33±1.07*
, 百拇医药
AP 1.25mg/ml
10
7.16±1.14***
0.058±0.025
5.16±1.7
8.5±2.2
Compared with 0.9% NaCl * P<0.05， **P<0.01， *** P<0.001
Table 2 Effect of Aloe Vera extract on cytokine released of spleen cell in vitro in endotoxemia rats Groups
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Rats
TNFα(IU/ml)
IL-1(ng/ml)
IL-2(IU/ml)
IL-6(IU/ml)
LPS 20μg/ml
10
41.3±3.33
0.80±0.05
12.5±4.3
65.0 ±5.62
LPS+AP 20mg/ml
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10
19.5±3.42***
0.32±0.01***
18.0±3.1***
38.32±3.9***
LPS+AP 10mg/ml
10
29.8±3.19***
0.46±0.03***
17.2±2.6**
, 百拇医药
48.33±2.17***
LPS+AP 1.25mg/ml
10
41.0±2.48
0.78±0.09
12.0±1.4
60.83±4.65
Compared with LPS * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
2 讨论
AP对体外正常脾细胞分泌细胞因子TNFα、IL-1、IL-6具有显著促进作用，对内毒素诱导脾细胞分泌细胞因子TNFα、IL-1、IL-6具有显著抑制作用。对IL-2分泌的影响在以上两种情况下，均显示促进作用。恶性肿瘤、原发性和继发性免疫缺陷患者的IL-2明显减少，补充IL-2可促进免疫功能的恢复。美国FDA 1985年批准用IL-2联用LAK细胞协同治疗恶性患者，疗效较好。目前用IL-2治疗肾癌和黑色素癌的疗效已肯定。
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本研究表明AP在正常条件下促进白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放，而对感染状态下由细菌产生内毒素所导致的过度释放具有显著抑制作用，IL-2均表现为正增长作用，表明巴巴多斯芦荟多糖提取物对炎症反应的免疫应答过程具有双相调节免疫功能作用。对自身免疫性疾病、肿瘤、恶病质综合症等的辅助治疗有着积极意义，有良好的临床应用价值[3～5]。
***日本名古屋大学医学部
参考文献
1 Wang L, Hasegawa T, Nadai M.The effect of lipopolysaceharide (LPS) on the disposition of xanthines in rats. J Pharmacol,1993, 45∶34
2 陈奇主编.中药药理研究方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996
, 百拇医药
3 Bruce WGG. Investigations of antibacterial activity in the Aloe. S Afr Med J,1967,41(38)∶984
4 Davis RH, Leitner MG. To pical anti-inflammatory activity of Aloe vera as measured by ear swelling. Journal of the American Podiatric Medical Association,1987,77(11)∶610
5 芦荟素的抗肿瘤、抗炎及免疫促进活性.国外医学中医中药分册,1988,10(5)∶58, 百拇医药(王 莉 杜俊蓉* 蔡绍晖** 朱 玲** 岑小波 陈淑杰 唐 琼* 包定元* 长谷川高明***)