基因重组bFGF的药效学研究
作者：李校坤 付小兵* 洪 岸 冯成利** 林 剑
单位：暨南大学生物工程研究所 广州 510632
关键词：创伤修复；剂量效应；碱性成纤维细胞生长因子
基因重组bFGF的药效学研究 提要 利用小型猪创伤模型，将bFGF分成3组(500、1 000、1 500 U/m)处理创面，并用SD-Ag及生理盐水做对照，观察创面愈合情况，结果表明1 000 U/ml浓度组促创伤作用比较明显，体外细胞培养50 ng/ml bFGF细胞增殖作用最明显。
STUDY OF RECOMBINATIVE BASIC RIBROBLAST
GROWTH FACTOR FOR PHARMACODYNAMICS
, 百拇医药
Li Xiaokun Fu Xiaobing Hong An Feng Chengli Lin jian
(Bio-Engineering Institute, Jinan University Guangzhou 510632)
ABSTRACT We try to explore the effect of bFGF with different concentrations on the wound healing and cell proliferation using the model of pigs back injured the method of cell culture in vitro. Concentration of bFGF was divided into three groups (500 U/ml, 1 000 U/ml,1 500 U/ml). Other experimental group was SD-Ag control. The results suggested that the group of concentration of 1 000 U/ml and in vitro the concentration of 50 ng/ml remarkably on cell proliferation.
, 百拇医药
Key Words bFGF Dosage-effect Wound-repairing
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进创伤修复已得到众多实验的肯定[1]。由于该因子是通过与其靶细胞上特异性受体相结合而起作用，因此，合理的剂量将有助于其更好地发挥作用。现采用小型猪背部刀伤模型与体外细胞培养技术，研究不同浓度(剂量)bFGF对创伤修复效果与细胞增殖的影响，并就可能的机理进行探讨。
1 材料与方法
1.1 动物模型 北京地区雄性小型猪(中国农科院动物中心)10只，体重20 kg左右，月龄为7～8月。实验前一周购入，单笼喂养，自由饮水与摄食。开始时从耳缘静脉推注硫妥钠30 mg/kg体重，使动物进入浅麻醉状态。用自来水肥皂清洁背部，然后用剃刀将背部去毛，面积为35 cm×25 cm，待创面消毒铺巾后用特制打孔器(创伤模型制作器)于猪背部脊柱两侧各切割5个圆形创面，直径1.8 cm，深至皮下，止血后备用。
, 百拇医药
1.2 生长因子与应用方法 bFGF(自制)；宿主菌为JM-103，所用菌种为第20代培养菌。临用前用无菌生理盐水将其分别配制成500、1 000、1 500 U/ml三种浓度，备用。
根据设计，将每一动物背部10个创面分成5组，即3个不同浓度bFGF生理盐水均匀滴注于三组治疗创面，隔天换药一次，直至活杀。其余两组创面则按相同的换药时间于创面单独应用0.5 g磺胺嘧啶-银(SD-Ag)霜剂或0.2 ml生理盐水。
为了进一步研究不同浓度bFGF对体外培养表皮细胞的影响，取本组实验的小型猪背部皮肤，用0.25%胰蛋白酶消化后制成表皮细胞悬液并接种于96孔细胞培养板中，市售标准化的培养基为20%小牛血清DMEM，分别加入不同浓度bFGF 0、10、50、100 ng/ml，并以不含bFGF的稀释液为对照。最后以MTT法确定猪表皮细胞在体外的生长活性。
1.3 评价指标 术后由一位未参加模型制作的外科医生用肉眼观察、直尺测量以及照像法记录创面愈合情况，重点记录肉芽组织生长与再上皮化速率。分别于伤后第7天(3只)、第10天(3只)与第14天(4只)将小猪活杀。每一创面按50%分割，其中1/2经10%福尔马林固定后行普通光镜HE染色与特殊色检查，余下的1/2用考马氏亮蓝法测定肉芽组织匀浆总蛋白量。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 以t检验测组间数据，差异的显著性定为P<0.05，结果以S±SD表示。
2 结果
2.1 大体观察 所有创面伤后干燥，微红，无明显分泌物。应用bFGF治疗三组创面组织修复有明显差别。伤后第3天，生长因子组与SD-Ag组创面已见有薄层肉芽组织生长，创面收缩明显；伤后第7天，生长因子组与SD-Ag组创面肉芽组织填充率已达50%左右，而生理盐水组仅为37%。比较创面面积，创后第10天，应用生长因子的三组创面已分别缩小至51.2%、39.6%与46.0%，而生理盐水组则仍高达59.2%(表1，2)。
Table 1 The comparison of area with the injured skin of pigs in the different days (cm2)
Group
, 百拇医药
bFGF
conc.
(U/ml)
Area restored
0 d
5 d
7 d
10 d
14 d
A
500
2.5
1.90±0.25
, 百拇医药
1.63±0.29
1.28±0.25
0.61±0.49
B
1000
2.5
1.69±0.06
1.46±0.30
0.99±0.26
0.30±0.34
C
1500
, 百拇医药
2.5
1.83±0.21
1.56±0.31
1.15±0.17
0.45±0.39
D
SD-Ag
2.5
1.81±0.23
1.52±0.32
1.12±0.26
0.40±0.28
, 百拇医药
NS
2.5
2.07±0.24
1.97±0.18
1.45±0.21
0.75±0.51
*All of the wound area is 2.5 cm2; compare with NS group, P<0.05
Table 2 The results of the cultural epidemic cells of pigs with MTT (
±10-2OD)
, 百拇医药
Group
bFGF conc. (ng/ml)
No.±s
1
0
8
69
±5
2
1
8
, http://www.100md.com
63
±5
3
5
8
70
±14
4
10
8
75
±20
5
50
, 百拇医药
8
74
±21
6
100
8
69
±9
比较三组应用bFGF创面愈合效果，可见因子浓度为1 000 U/ml组效果为最好。
2.2 组织学检查 伤后第7天应用生长因子的三组创面成纤维细胞数量与毛血管胚较对照组明显增加，其中以生长因子浓度为1 000 U/ml更明显(图1)。
, http://www.100md.com
图1 bFGF培养7天后成纤维细胞和胶原纤维的生长与增殖
Fig 1 Proliferation and growth in quantity of fibroblasts and collagenous fibers after 7 day bFGF treatment
2.3 肉芽组织匀浆蛋白含量 用考马氏亮蓝法测定蛋白含量，见生长因子(1 000 U/ml)组与SD-Ag 组创面肉芽中蛋白含量较生理盐水组有所增加。
2.4 细胞培养 用倒置显微镜观察，不同浓度bFGF刺激下的猪表皮细胞生长良好，以bFGF浓度为50 ng/ml的细胞生长最佳(图2)。
, 百拇医药
图2 bFGF组培养的表皮细胞的增殖
Fig 2 Proliferation of epidemic cell cultured by bFGF
A Control B 50 ng/ml bFGF
3 讨论
随着对FGFs类生长因子与表皮细胞生长关系研究的深入，人们认为FGFs类生长因子可能比EGF(表皮生长因子)更适用于烧伤、创伤与创伤修复等领域[4]。FGFs类生长因子是通过与其特异受体相结合而发挥作用[4]。表皮细胞与成纤维细胞膜，是一种依赖钙和磷脂的物质，具有苏氨酸特殊C蛋白激酶活性。其特点是bFGF与aFGF共同作用一类受体，因子与受体结合不进行酪氨酸磷酸化，形成的复合物不进细胞内。据此可以认为，外源性应用生长因子越多效果不一定越好。以上研究的动物实验与细胞培养结果均获证实。实验还发现，当外源性应用bFGF超过其最佳应用剂量时，过量bFGF反而对其生物学效应产生抑制反应，这种现象类似于酶促反应的竞争性抑制作用，但详细的机理还有待于阐明。
, 百拇医药
由于条件改变可能影响到生长因子与受体的亲和以及由此而引发的生物学效应，因此，对不同创伤修复的bFGF最佳浓度可能会有所不同。阐明这种差异将最终为临床更合理更有效的应用bFGF提供理论依据。综合国内外的报道和自己的研究[5]，认为就促修复而言，对机械性创伤(刀伤、枪伤)创面、烧伤创面和慢性难愈合创面(褥疮、窦道等)以1 000 U/ml左右的bFGF为佳。
*解放军304医院 北京100037
**陕西动物所生物化学研究室
参考文献
1 付小兵主编.生长因子与创伤修复.北京：人民军医出版社，1991.87
2 周延冲主编.多肽生长因子.北京：中国科学技术出版社，1992.235
, http://www.100md.com
3 Bennell NT.Growth factor and wound bealing biochemical properties of growth factors and their receptor. Amer J Sum, 1993,165∶728
4 Johnson DE. Structural and functional diversity in the FGF receptor.Advances in Cancer reasearch,1993,60∶1
5 Kingsnorth NA. Peptide growth factor and wound bealing. Br J Surg,1991,78∶1288, 百拇医药(李校坤 付小兵* 洪 岸 冯成利** 林 剑)
单位：暨南大学生物工程研究所 广州 510632
关键词：创伤修复；剂量效应；碱性成纤维细胞生长因子
基因重组bFGF的药效学研究 提要 利用小型猪创伤模型，将bFGF分成3组(500、1 000、1 500 U/m)处理创面，并用SD-Ag及生理盐水做对照，观察创面愈合情况，结果表明1 000 U/ml浓度组促创伤作用比较明显，体外细胞培养50 ng/ml bFGF细胞增殖作用最明显。
STUDY OF RECOMBINATIVE BASIC RIBROBLAST
GROWTH FACTOR FOR PHARMACODYNAMICS
, 百拇医药
Li Xiaokun Fu Xiaobing Hong An Feng Chengli Lin jian
(Bio-Engineering Institute, Jinan University Guangzhou 510632)
ABSTRACT We try to explore the effect of bFGF with different concentrations on the wound healing and cell proliferation using the model of pigs back injured the method of cell culture in vitro. Concentration of bFGF was divided into three groups (500 U/ml, 1 000 U/ml,1 500 U/ml). Other experimental group was SD-Ag control. The results suggested that the group of concentration of 1 000 U/ml and in vitro the concentration of 50 ng/ml remarkably on cell proliferation.
, 百拇医药
Key Words bFGF Dosage-effect Wound-repairing
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进创伤修复已得到众多实验的肯定[1]。由于该因子是通过与其靶细胞上特异性受体相结合而起作用，因此，合理的剂量将有助于其更好地发挥作用。现采用小型猪背部刀伤模型与体外细胞培养技术，研究不同浓度(剂量)bFGF对创伤修复效果与细胞增殖的影响，并就可能的机理进行探讨。
1 材料与方法
1.1 动物模型 北京地区雄性小型猪(中国农科院动物中心)10只，体重20 kg左右，月龄为7～8月。实验前一周购入，单笼喂养，自由饮水与摄食。开始时从耳缘静脉推注硫妥钠30 mg/kg体重，使动物进入浅麻醉状态。用自来水肥皂清洁背部，然后用剃刀将背部去毛，面积为35 cm×25 cm，待创面消毒铺巾后用特制打孔器(创伤模型制作器)于猪背部脊柱两侧各切割5个圆形创面，直径1.8 cm，深至皮下，止血后备用。
, 百拇医药
1.2 生长因子与应用方法 bFGF(自制)；宿主菌为JM-103，所用菌种为第20代培养菌。临用前用无菌生理盐水将其分别配制成500、1 000、1 500 U/ml三种浓度，备用。
根据设计，将每一动物背部10个创面分成5组，即3个不同浓度bFGF生理盐水均匀滴注于三组治疗创面，隔天换药一次，直至活杀。其余两组创面则按相同的换药时间于创面单独应用0.5 g磺胺嘧啶-银(SD-Ag)霜剂或0.2 ml生理盐水。
为了进一步研究不同浓度bFGF对体外培养表皮细胞的影响，取本组实验的小型猪背部皮肤，用0.25%胰蛋白酶消化后制成表皮细胞悬液并接种于96孔细胞培养板中，市售标准化的培养基为20%小牛血清DMEM，分别加入不同浓度bFGF 0、10、50、100 ng/ml，并以不含bFGF的稀释液为对照。最后以MTT法确定猪表皮细胞在体外的生长活性。
1.3 评价指标 术后由一位未参加模型制作的外科医生用肉眼观察、直尺测量以及照像法记录创面愈合情况，重点记录肉芽组织生长与再上皮化速率。分别于伤后第7天(3只)、第10天(3只)与第14天(4只)将小猪活杀。每一创面按50%分割，其中1/2经10%福尔马林固定后行普通光镜HE染色与特殊色检查，余下的1/2用考马氏亮蓝法测定肉芽组织匀浆总蛋白量。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 以t检验测组间数据，差异的显著性定为P<0.05，结果以S±SD表示。
2 结果
2.1 大体观察 所有创面伤后干燥，微红，无明显分泌物。应用bFGF治疗三组创面组织修复有明显差别。伤后第3天，生长因子组与SD-Ag组创面已见有薄层肉芽组织生长，创面收缩明显；伤后第7天，生长因子组与SD-Ag组创面肉芽组织填充率已达50%左右，而生理盐水组仅为37%。比较创面面积，创后第10天，应用生长因子的三组创面已分别缩小至51.2%、39.6%与46.0%，而生理盐水组则仍高达59.2%(表1，2)。
Table 1 The comparison of area with the injured skin of pigs in the different days (cm2)
Group
, 百拇医药
bFGF
conc.
(U/ml)
Area restored
0 d
5 d
7 d
10 d
14 d
A
500
2.5
1.90±0.25
, 百拇医药
1.63±0.29
1.28±0.25
0.61±0.49
B
1000
2.5
1.69±0.06
1.46±0.30
0.99±0.26
0.30±0.34
C
1500
, 百拇医药
2.5
1.83±0.21
1.56±0.31
1.15±0.17
0.45±0.39
D
SD-Ag
2.5
1.81±0.23
1.52±0.32
1.12±0.26
0.40±0.28
, 百拇医药
NS
2.5
2.07±0.24
1.97±0.18
1.45±0.21
0.75±0.51
*All of the wound area is 2.5 cm2; compare with NS group, P<0.05
Table 2 The results of the cultural epidemic cells of pigs with MTT (
±10-2OD), 百拇医药
Group
bFGF conc. (ng/ml)
No.
±s1
0
8
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±5
2
1
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, http://www.100md.com
63
±5
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±20
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, 百拇医药
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比较三组应用bFGF创面愈合效果，可见因子浓度为1 000 U/ml组效果为最好。
2.2 组织学检查 伤后第7天应用生长因子的三组创面成纤维细胞数量与毛血管胚较对照组明显增加，其中以生长因子浓度为1 000 U/ml更明显(图1)。
, http://www.100md.com
图1 bFGF培养7天后成纤维细胞和胶原纤维的生长与增殖
Fig 1 Proliferation and growth in quantity of fibroblasts and collagenous fibers after 7 day bFGF treatment
2.3 肉芽组织匀浆蛋白含量 用考马氏亮蓝法测定蛋白含量，见生长因子(1 000 U/ml)组与SD-Ag 组创面肉芽中蛋白含量较生理盐水组有所增加。
2.4 细胞培养 用倒置显微镜观察，不同浓度bFGF刺激下的猪表皮细胞生长良好，以bFGF浓度为50 ng/ml的细胞生长最佳(图2)。
, 百拇医药
图2 bFGF组培养的表皮细胞的增殖
Fig 2 Proliferation of epidemic cell cultured by bFGF
A Control B 50 ng/ml bFGF
3 讨论
随着对FGFs类生长因子与表皮细胞生长关系研究的深入，人们认为FGFs类生长因子可能比EGF(表皮生长因子)更适用于烧伤、创伤与创伤修复等领域[4]。FGFs类生长因子是通过与其特异受体相结合而发挥作用[4]。表皮细胞与成纤维细胞膜，是一种依赖钙和磷脂的物质，具有苏氨酸特殊C蛋白激酶活性。其特点是bFGF与aFGF共同作用一类受体，因子与受体结合不进行酪氨酸磷酸化，形成的复合物不进细胞内。据此可以认为，外源性应用生长因子越多效果不一定越好。以上研究的动物实验与细胞培养结果均获证实。实验还发现，当外源性应用bFGF超过其最佳应用剂量时，过量bFGF反而对其生物学效应产生抑制反应，这种现象类似于酶促反应的竞争性抑制作用，但详细的机理还有待于阐明。
, 百拇医药
由于条件改变可能影响到生长因子与受体的亲和以及由此而引发的生物学效应，因此，对不同创伤修复的bFGF最佳浓度可能会有所不同。阐明这种差异将最终为临床更合理更有效的应用bFGF提供理论依据。综合国内外的报道和自己的研究[5]，认为就促修复而言，对机械性创伤(刀伤、枪伤)创面、烧伤创面和慢性难愈合创面(褥疮、窦道等)以1 000 U/ml左右的bFGF为佳。
*解放军304医院 北京100037
**陕西动物所生物化学研究室
参考文献
1 付小兵主编.生长因子与创伤修复.北京：人民军医出版社，1991.87
2 周延冲主编.多肽生长因子.北京：中国科学技术出版社，1992.235
, http://www.100md.com
3 Bennell NT.Growth factor and wound bealing biochemical properties of growth factors and their receptor. Amer J Sum, 1993,165∶728
4 Johnson DE. Structural and functional diversity in the FGF receptor.Advances in Cancer reasearch,1993,60∶1
5 Kingsnorth NA. Peptide growth factor and wound bealing. Br J Surg,1991,78∶1288, 百拇医药(李校坤 付小兵* 洪 岸 冯成利** 林 剑)