大肠杆菌分泌型载体表达重组人碱性成纤维细胞生长因子
作者：袁 涛 张雪梅 黄 林 李春阳 王 静 王济源 徐 柳 蒋丽明 王 艳 王智杰 徐秀珍
单位：成都生物制品研究所 成都 610063
关键词：hbFGF；大肠杆菌；分泌；表达
大肠杆菌分泌型载体表达重组人碱性 成纤维细胞生长因子 提要 设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)信号肽序列的重组分泌型表达载体pSE-hbFGF，在大肠杆菌DH5α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)。SDS-PAGE、免疫印迹及生物活性测定均表明表达产物分泌到细菌细胞周质和培养基中。分泌到周质中的rhbFGF可占周质总蛋白的15%。
SECRETION OF RECOMBINANT HUMAN bFGF
EXPRESSED BY E.coli
, http://www.100md.com
Yuan Tao Zhang Xuemei Huang Lin Li Chunyang Wang Jing Wang Jiyuan
Xu Liu Jiang Liming Wang Yan Wang Zhijie Xu Xiuzhen
(Chengdu Institute of Biological Products Chengdu 610063)
ABSTRACT Human basic fibroblast growth factor (hbFGF) gene was inserted into expression vector with OmpA signal sequence and expressed in E.coli DH5α. SDS-PAGE analysis, western-blot and bioassay verified that the expressed rhbFGF was secreted into culture medium and periplast of bacteria. The yield of rhbFGF secreting into periplast accounted for 15% of total periplast protein.
, 百拇医药
Key Words hbFGF E.coli Secretion Expression
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是成纤维细胞生长因子家族中的一员，分子量为16～18 kD，是一种具有调控细胞增殖、分化功能的蛋白分子，可促进创伤愈合、骨修复、眼晶体再生及肢体再生等，具有广泛的潜在临床应用价值；并有可能开发成为治疗心肌梗塞、骨质疏松症和老年性痴呆等多种疾病的药物。由于分离和纯化天然的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)来源有限，因此，研究开发基因工程重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)就成了满足基础和临床应用研究需要的唯一途径。为此，设计构建了分泌型表达载体pSE-hbFGF在大肠杆菌脂蛋白启动子和乳糖启动子操纵子双重控制下，在大肠杆菌DH5α中分泌表达了hbFGF基因。
1 材料和方法
1.1 菌株、质粒和细胞株
, 百拇医药
含hbFGF cDNA的质粒pBluescript-hbFGF(自行构建)；大肠杆菌DH5α、分泌型表达质粒pSE均由实验室保存；3T3细胞株(中国生物制品检定所)。
1.2 试剂
限制酶EcoRI、BamHI及Taq酶、dNTP、DNA连接试剂盒、Dig标记与检测试剂盒和NBT/BCIP显色液均购自德国宝灵曼公司；质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒(美国Promega公司)；鼠源性抗hbFGF单克隆抗体、IPTG(Sigma)；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG/IgM(TAGO公司)；hbFGF生物活性检测标准品(中国生物制品检定所)；其余均为国产分析纯试剂。PCR扩增在PE9600扩增仪上进行。引物合成由美国赛百盛生物工程公司完成。
1.3 斑点杂交
Dig标记探针的制备与斑点杂交操作过程均按宝灵曼公司的Dig标记与检测试剂盒说明书进行。
, 百拇医药
1.4 分泌型表达载体的构建
酶切、连接、转化等基本操作均参照文献[1，2]的方法略作修改。用斑点杂交法和酶切鉴别阳性克隆。
1.5 重组菌的诱导表达
培养至对数的重组菌中加入IPTG诱导培养4～6 h。
1.6 SDS-PAGE电泳
按Laemmli的方法进行[2]。
1.7 免疫印迹鉴定实验
参照文献[2]的方法。
1.8 生物活性检测
, 百拇医药
用MTT法检测样品刺激3T3细胞增生的活性。
2 结果
2.1 引物的设计
pSE分泌型表达载体部分前导肽及多克隆位点处的序列分别为：
根据文献[3]报道的hbFGF cDNA序列，选择EcoRI和BamHI作为插入位点，设计合成了以下一对引物。
, 百拇医药
载体与hbFGF片段连接部位的核苷酸和氨基酸序列如下：
保留了EcoRI酶切位点，成熟蛋白跨膜时将有1、2、3三个可能的信号肽识别切割位点。如果跨膜时从1位切割，成熟蛋白N端将多出Ala-Glu-Phe三个氨基酸；而从2、3位切割将得到N端少2或3个氨基酸的hbFGF。从文献[4]报道看，N端少几个到十几个氨基酸对hbFGF的生物活性无影响。实验结果已证明。
2.2 分泌型表达载体pSE-hbFGF的构建
采用上述设计合成的引物，以含hbFGF cDNA的质粒pBluescript-hbFGF为模板进行PCR扩增。扩增时的复性温度为55℃。得到了约500 bp的扩增条带(图1)。利用两种酶EcoRI和BamHI分别消化载体pSE和PCR扩增产物，经0.7%琼脂糖凝胶电泳分离后分别回收线状质粒和PCR产物胶条，过柱纯化后用宝灵曼公司的Rapid DNA ligation kit连接，然后转化E.coli DH5α，用Dig标记探针杂交筛选阳性重组子，经EcoRI和BamHI双酶切证实插入片段大小正确(图2)。构建过程如图3。
, 百拇医药
Fig 1 Detection of PCR products
1 500 bp ladder dsDNA marker 2 480 bp PCR products
3 Negative template control
Fig 2 Electrophoresis pattern of restrictive fragments of recombinants plasmids
1,2 Plasmids containing insert fragments 3 250 bp ladder dsDNA marker 4,5 Plasmids without inserts
, 百拇医药
Fig 3 Construction of recombinant secretion plasmid pSE-hbFGF
2.3 重组菌的诱导表达与鉴定
根据表达载体的特点，hbFGF cDNA位于Lac操纵子片段下游，因此，只有在Lac诱导剂存在时才能表达。将构建好的重组菌pSE-hbFGF/DH5α接种于LB培养基中活化过夜后接种于HD培养基中培养到OD600为0.5时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，6 h后搜集菌液作SDS-PAGE和Western-blot鉴定。SDS-PAGE结果表明，在分子量约17 kD处的条带明显加深(图4)。Western-blot鉴定确证在约17 kD处有特异表达产物(图5)。
, http://www.100md.com
Fig 4 SDS-PAGE analysis of expressed product
1 pSE,IPTG induction for 6 h 2-3 pSE-hbFGF,IPTG induction for 5,6 h 4 Protein low molecular standard
Fig 5 Western-blot analysis of expressed product
1 pSE,IPTG induction for 6 h 2 pSE-hbFGF,IPTG indution for 6 h 3 Protein low molecular weight standard
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2.4 hbFGF基因表达产物的定位
将发酵培养诱导菌液6 000 g离心10 min，分别收集上清和菌体。菌体加入新配制的高渗缓冲液，内含溶菌酶(1 mg/ml)、20%(w/v)蔗糖、30 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、1 mmol/L EDTA(pH8.0)，冰浴振摇10 min，6 000 g离心20 min，收集上清为周质组分；沉淀重悬于0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，反复冻融使细胞裂解，再以12 000 g离心5 min，上清为细胞质蛋白，沉淀部分为细胞膜组分和包涵体。对上述培养基上清、细胞周质、细胞质和膜碎片几部份分别作SDS-PAGE电泳、免疫印迹和生物活性检测，结果证明有活性的表达产物存在于细菌细胞周质和培养基中。SDS-PAGE检测到的周质目的蛋白与我们预计的在前导肽2或3位切割的产物大小一致，约为17 kd。SDS-PAGE扫描结果表明分泌至周质的rhbFGF约占周质总蛋白的15%。
, 百拇医药 3 讨论
文献报道[5]及我们以前构建的表达rhbFGF的工程菌多为大肠杆菌胞质型表达，表达量都不高，加之rhbFGF水溶性较好，在胞质中表达时主要以可溶性形式存在，不形成包涵体，容易被胞内蛋白酶降解，活性不够稳定，因此分离纯化比较困难。分泌型载体表达外源蛋白具有以下优点。胞浆中的还原环境不利于形成二硫键，而在周质的氧化环境很容易形成，故表达产物能够正确折叠；由于周质空间的蛋白酶水解活性较低，因此，分泌到此的蛋白更加稳定；通过渗透休克法[7]很容易将周质蛋白释放出来，分离纯化工艺相对简单。OmpA是大肠杆菌的一种主要外膜蛋白[6]，实验所用的pSE分泌型表达载体中带有一段编码其信号肽的核苷酸序列，插入的外源基因能与之形成融合蛋白前体，移位跨膜时伴随前导肽的切割，因此，只要插入的外源蛋白结构与信号肽匹配就可以将完整的外源蛋白分泌到细胞周质中和培养基中。利用带OmpA信号肽序列的表达载体分泌表达外源蛋白时，目的蛋白最终分泌到什么位置，与目的蛋白的结构有关联。有的分泌到培养上清和周质中，有的仅分泌到周质中，而水溶性不好的蛋白则会镶嵌于细菌细胞膜上[8～10]。实验结果表明有活性的hbFGF基因表达产物分泌到了细菌细胞周质和培养基中，说明hbFGF基因适合用该分泌表达系统进行表达，这为下游纯化工作奠定了良好的基础。
, 百拇医药
pSE载体上含有表达Lac抑制因子的LacI基因，因此Lac操纵子被封闭，当Lac诱导剂如IPTG加入培养基中才能使抑制因子失活，从而诱导克隆的目的基因表达。有效利用pSE载体上的LacI基因可以很好地控制目的基因的表达。我们在实验中发现，在某些培养基如LB中诱导时，在未加诱导剂的情况下，已有rhbFGF的表达，这可能是因为这些培养基中的某些成分如酵母粉中含有Lac激活剂，可以在没有IPTG的情况下就诱导克隆基因表达。为避免这种情况，可采取发酵过程中菌体培养阶段用基础培养基加酪蛋白水解物。
参考文献
1 (美)J.萨姆布鲁克，EF佛里奇，T曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫译，侯云德校.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社出版，1992
2 Frederick M Ausubel, Roger Brent, Robert E Kingston, et al.Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons Inc,1995
, 百拇医药
3 Abraham JA, Wang JL.Tumolo A, et al.Human basic fibroblast growth factor:nucleotide sequence and genomic organization. EMBO(Eur.Mol.Biol.Organ.)J,1986,5∶2523
4 Ueno N, A Baird, Esch F,et al.Isolation of an amino terminal extended form of basic fibroblast growth factor. Biochem Biophys Res Commun,1986,138∶580
5 赵爱平，徐林，钱林法等.人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的克隆与表达.中国生化药物杂志，1996，17(3)∶93
6 Masayasu T, David WH, Philip JB,et al.The ompA signal peptide directed secretion of staphylococcal nuclease A by Escherichia coli.The Journal of Biological Chemistry,1985,260(5)∶2670
, http://www.100md.com
7 Neu HC, Heppel LA. The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J Bio Chem,1965,240∶3685
8 Hansen MH. Use of bacteriocin release protein in E.Coli for excretion of human growth hormone into the culture medium. Biotechnology,1989,7∶267
9 葛永红，何黔川.人粒细胞集落刺激因子与白细胞介素-6在大肠杆菌中分泌表达的比较研究.四川大学学报(自然科学版)细胞生物人类遗传学论文集，1998，35∶271
10 谭树华，吴梧桐，刘景晶.在大肠杆菌中分泌表达水蛭素Ⅲ基因的初步研究.药物生物技术，1998，5(4)∶197, 百拇医药
单位：成都生物制品研究所 成都 610063
关键词：hbFGF；大肠杆菌；分泌；表达
大肠杆菌分泌型载体表达重组人碱性 成纤维细胞生长因子 提要 设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)信号肽序列的重组分泌型表达载体pSE-hbFGF，在大肠杆菌DH5α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)。SDS-PAGE、免疫印迹及生物活性测定均表明表达产物分泌到细菌细胞周质和培养基中。分泌到周质中的rhbFGF可占周质总蛋白的15%。
SECRETION OF RECOMBINANT HUMAN bFGF
EXPRESSED BY E.coli
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Yuan Tao Zhang Xuemei Huang Lin Li Chunyang Wang Jing Wang Jiyuan
Xu Liu Jiang Liming Wang Yan Wang Zhijie Xu Xiuzhen
(Chengdu Institute of Biological Products Chengdu 610063)
ABSTRACT Human basic fibroblast growth factor (hbFGF) gene was inserted into expression vector with OmpA signal sequence and expressed in E.coli DH5α. SDS-PAGE analysis, western-blot and bioassay verified that the expressed rhbFGF was secreted into culture medium and periplast of bacteria. The yield of rhbFGF secreting into periplast accounted for 15% of total periplast protein.
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Key Words hbFGF E.coli Secretion Expression
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是成纤维细胞生长因子家族中的一员，分子量为16～18 kD，是一种具有调控细胞增殖、分化功能的蛋白分子，可促进创伤愈合、骨修复、眼晶体再生及肢体再生等，具有广泛的潜在临床应用价值；并有可能开发成为治疗心肌梗塞、骨质疏松症和老年性痴呆等多种疾病的药物。由于分离和纯化天然的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)来源有限，因此，研究开发基因工程重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)就成了满足基础和临床应用研究需要的唯一途径。为此，设计构建了分泌型表达载体pSE-hbFGF在大肠杆菌脂蛋白启动子和乳糖启动子操纵子双重控制下，在大肠杆菌DH5α中分泌表达了hbFGF基因。
1 材料和方法
1.1 菌株、质粒和细胞株
, 百拇医药
含hbFGF cDNA的质粒pBluescript-hbFGF(自行构建)；大肠杆菌DH5α、分泌型表达质粒pSE均由实验室保存；3T3细胞株(中国生物制品检定所)。
1.2 试剂
限制酶EcoRI、BamHI及Taq酶、dNTP、DNA连接试剂盒、Dig标记与检测试剂盒和NBT/BCIP显色液均购自德国宝灵曼公司；质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒(美国Promega公司)；鼠源性抗hbFGF单克隆抗体、IPTG(Sigma)；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG/IgM(TAGO公司)；hbFGF生物活性检测标准品(中国生物制品检定所)；其余均为国产分析纯试剂。PCR扩增在PE9600扩增仪上进行。引物合成由美国赛百盛生物工程公司完成。
1.3 斑点杂交
Dig标记探针的制备与斑点杂交操作过程均按宝灵曼公司的Dig标记与检测试剂盒说明书进行。
, 百拇医药
1.4 分泌型表达载体的构建
酶切、连接、转化等基本操作均参照文献[1，2]的方法略作修改。用斑点杂交法和酶切鉴别阳性克隆。
1.5 重组菌的诱导表达
培养至对数的重组菌中加入IPTG诱导培养4～6 h。
1.6 SDS-PAGE电泳
按Laemmli的方法进行[2]。
1.7 免疫印迹鉴定实验
参照文献[2]的方法。
1.8 生物活性检测
, 百拇医药
用MTT法检测样品刺激3T3细胞增生的活性。
2 结果
2.1 引物的设计
pSE分泌型表达载体部分前导肽及多克隆位点处的序列分别为：
根据文献[3]报道的hbFGF cDNA序列，选择EcoRI和BamHI作为插入位点，设计合成了以下一对引物。
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载体与hbFGF片段连接部位的核苷酸和氨基酸序列如下：
保留了EcoRI酶切位点，成熟蛋白跨膜时将有1、2、3三个可能的信号肽识别切割位点。如果跨膜时从1位切割，成熟蛋白N端将多出Ala-Glu-Phe三个氨基酸；而从2、3位切割将得到N端少2或3个氨基酸的hbFGF。从文献[4]报道看，N端少几个到十几个氨基酸对hbFGF的生物活性无影响。实验结果已证明。
2.2 分泌型表达载体pSE-hbFGF的构建
采用上述设计合成的引物，以含hbFGF cDNA的质粒pBluescript-hbFGF为模板进行PCR扩增。扩增时的复性温度为55℃。得到了约500 bp的扩增条带(图1)。利用两种酶EcoRI和BamHI分别消化载体pSE和PCR扩增产物，经0.7%琼脂糖凝胶电泳分离后分别回收线状质粒和PCR产物胶条，过柱纯化后用宝灵曼公司的Rapid DNA ligation kit连接，然后转化E.coli DH5α，用Dig标记探针杂交筛选阳性重组子，经EcoRI和BamHI双酶切证实插入片段大小正确(图2)。构建过程如图3。
, 百拇医药
Fig 1 Detection of PCR products
1 500 bp ladder dsDNA marker 2 480 bp PCR products
3 Negative template control
Fig 2 Electrophoresis pattern of restrictive fragments of recombinants plasmids
1,2 Plasmids containing insert fragments 3 250 bp ladder dsDNA marker 4,5 Plasmids without inserts
, 百拇医药
Fig 3 Construction of recombinant secretion plasmid pSE-hbFGF
2.3 重组菌的诱导表达与鉴定
根据表达载体的特点，hbFGF cDNA位于Lac操纵子片段下游，因此，只有在Lac诱导剂存在时才能表达。将构建好的重组菌pSE-hbFGF/DH5α接种于LB培养基中活化过夜后接种于HD培养基中培养到OD600为0.5时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，6 h后搜集菌液作SDS-PAGE和Western-blot鉴定。SDS-PAGE结果表明，在分子量约17 kD处的条带明显加深(图4)。Western-blot鉴定确证在约17 kD处有特异表达产物(图5)。
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Fig 4 SDS-PAGE analysis of expressed product
1 pSE,IPTG induction for 6 h 2-3 pSE-hbFGF,IPTG induction for 5,6 h 4 Protein low molecular standard
Fig 5 Western-blot analysis of expressed product
1 pSE,IPTG induction for 6 h 2 pSE-hbFGF,IPTG indution for 6 h 3 Protein low molecular weight standard
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2.4 hbFGF基因表达产物的定位
将发酵培养诱导菌液6 000 g离心10 min，分别收集上清和菌体。菌体加入新配制的高渗缓冲液，内含溶菌酶(1 mg/ml)、20%(w/v)蔗糖、30 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、1 mmol/L EDTA(pH8.0)，冰浴振摇10 min，6 000 g离心20 min，收集上清为周质组分；沉淀重悬于0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，反复冻融使细胞裂解，再以12 000 g离心5 min，上清为细胞质蛋白，沉淀部分为细胞膜组分和包涵体。对上述培养基上清、细胞周质、细胞质和膜碎片几部份分别作SDS-PAGE电泳、免疫印迹和生物活性检测，结果证明有活性的表达产物存在于细菌细胞周质和培养基中。SDS-PAGE检测到的周质目的蛋白与我们预计的在前导肽2或3位切割的产物大小一致，约为17 kd。SDS-PAGE扫描结果表明分泌至周质的rhbFGF约占周质总蛋白的15%。
, 百拇医药 3 讨论
文献报道[5]及我们以前构建的表达rhbFGF的工程菌多为大肠杆菌胞质型表达，表达量都不高，加之rhbFGF水溶性较好，在胞质中表达时主要以可溶性形式存在，不形成包涵体，容易被胞内蛋白酶降解，活性不够稳定，因此分离纯化比较困难。分泌型载体表达外源蛋白具有以下优点。胞浆中的还原环境不利于形成二硫键，而在周质的氧化环境很容易形成，故表达产物能够正确折叠；由于周质空间的蛋白酶水解活性较低，因此，分泌到此的蛋白更加稳定；通过渗透休克法[7]很容易将周质蛋白释放出来，分离纯化工艺相对简单。OmpA是大肠杆菌的一种主要外膜蛋白[6]，实验所用的pSE分泌型表达载体中带有一段编码其信号肽的核苷酸序列，插入的外源基因能与之形成融合蛋白前体，移位跨膜时伴随前导肽的切割，因此，只要插入的外源蛋白结构与信号肽匹配就可以将完整的外源蛋白分泌到细胞周质中和培养基中。利用带OmpA信号肽序列的表达载体分泌表达外源蛋白时，目的蛋白最终分泌到什么位置，与目的蛋白的结构有关联。有的分泌到培养上清和周质中，有的仅分泌到周质中，而水溶性不好的蛋白则会镶嵌于细菌细胞膜上[8～10]。实验结果表明有活性的hbFGF基因表达产物分泌到了细菌细胞周质和培养基中，说明hbFGF基因适合用该分泌表达系统进行表达，这为下游纯化工作奠定了良好的基础。
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pSE载体上含有表达Lac抑制因子的LacI基因，因此Lac操纵子被封闭，当Lac诱导剂如IPTG加入培养基中才能使抑制因子失活，从而诱导克隆的目的基因表达。有效利用pSE载体上的LacI基因可以很好地控制目的基因的表达。我们在实验中发现，在某些培养基如LB中诱导时，在未加诱导剂的情况下，已有rhbFGF的表达，这可能是因为这些培养基中的某些成分如酵母粉中含有Lac激活剂，可以在没有IPTG的情况下就诱导克隆基因表达。为避免这种情况，可采取发酵过程中菌体培养阶段用基础培养基加酪蛋白水解物。
参考文献
1 (美)J.萨姆布鲁克，EF佛里奇，T曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫译，侯云德校.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社出版，1992
2 Frederick M Ausubel, Roger Brent, Robert E Kingston, et al.Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons Inc,1995
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3 Abraham JA, Wang JL.Tumolo A, et al.Human basic fibroblast growth factor:nucleotide sequence and genomic organization. EMBO(Eur.Mol.Biol.Organ.)J,1986,5∶2523
4 Ueno N, A Baird, Esch F,et al.Isolation of an amino terminal extended form of basic fibroblast growth factor. Biochem Biophys Res Commun,1986,138∶580
5 赵爱平，徐林，钱林法等.人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的克隆与表达.中国生化药物杂志，1996，17(3)∶93
6 Masayasu T, David WH, Philip JB,et al.The ompA signal peptide directed secretion of staphylococcal nuclease A by Escherichia coli.The Journal of Biological Chemistry,1985,260(5)∶2670
, http://www.100md.com
7 Neu HC, Heppel LA. The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J Bio Chem,1965,240∶3685
8 Hansen MH. Use of bacteriocin release protein in E.Coli for excretion of human growth hormone into the culture medium. Biotechnology,1989,7∶267
9 葛永红，何黔川.人粒细胞集落刺激因子与白细胞介素-6在大肠杆菌中分泌表达的比较研究.四川大学学报(自然科学版)细胞生物人类遗传学论文集，1998，35∶271
10 谭树华，吴梧桐，刘景晶.在大肠杆菌中分泌表达水蛭素Ⅲ基因的初步研究.药物生物技术，1998，5(4)∶197, 百拇医药