三黄片对大肠杆菌耐药质粒消除作用的研究*
作者：康 梅 陈知行 许秀成** 潘培根
单位：华西医科大学附一院检验科 医学分子生物学实验室** 成都 610041
关键词：三黄片；医院内感染；大肠杆菌；质粒消除
华西药学杂志990543 提要 用三黄片作为质粒消除剂，对48株院内感染大肠杆菌多重耐药株采用连续稀释培养法进行质粒消除试验，并与传统SDS法进行了比较。经试验前后药敏试验及质粒指纹图谱分析，结果前法质粒消除率为31%(15/48)，其耐药性也随之部分消失；后法质粒消除率为27%(13/48；经X2检验，两法无显著性差异(P>0.05)；研究表明，三黄片对耐药质粒有较强的消除作用。
STUDY ON PLASMID ELIMINATION OF SAN HUANG
, 百拇医药
TABLETS TO NOSOCOMIAL E.coli*
Kang Mei Chen Zhixing Xu Xiucheng Pan Peigen
(The First University Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT San Huang Tablet, which is a kind of traditional Chinese medicine, was chosen as a curing agent to eliminate plasmid of 48 multiply antibiotic-resistant nosocomial E.coli strains by series dilution,and was compared with another traditional curing agent-SDS. The result demonstrated that the curing percentage of San Huang tablet is 31%(15/48) and 27% of SDS(13/48).No significant difference was found between San Huang tablet and SDS in effect on plasmid elimination (P>0.05). It suggested that San Huang tablet is a effective plasmid curing agent to E. coli in hospital infection and has important significance for therapying and controlling hospital infection.
, 百拇医药
Key Words San Huang tablet Nosocomial Infection E.coli Curing of plasmid Multiply antibiotic-resistance
用消除质粒的方法解决细菌耐药问题，国外采用的消质剂多为对人体有害的化学物质或方法本身不适用于人体[1～3]，而有关临床药物的质粒消除作用，国内外文献中多为单一化学抗菌药物，草药和中成药仅偶有报道，并且消除率均很低。现选用临床常用价廉易得的复方中成药——三黄片作为消质剂与传统消质剂SDS作对比研究。
1 材料、方法和结果
1.1 材料
1.1.1 菌株 大肠杆菌多重耐药株(来源于1997年4月～1998年11月本院检验科细菌室分离鉴定的临床菌株，耐两种或两种以上作用机制不同的抗生素)；药敏质控对照菌株ATCC 25922大肠杆菌(卫生部临床检验中心)；标准分子量质粒菌株[V517[4]分子量54.2,7.3,5.6,5.2,3.9,3.0,2.7,2.1 kb(华西医科大学公共卫生学院卫生检验教研室)。
, 百拇医药
1.1.2 培养基 Mueller-Hinton(MH)琼脂平板(浙江军区后勤部，批号960109)；Luria-Bertani(L-B)肉汤(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母浸汁，1.0%NaCl,pH7.4～7.6);0.015%SDS-LB肉汤[1000 ml LB肉汤中加入5 ml 3%SDS(十二烷基磺酸钠)]；三黄片LB肉汤[LB肉汤中加入三黄片粉末使其终浓度为三黄片的亚抑菌药浓度(120 mg/ml)]。
1.1.3 抗生素纸片 青霉素(P)、氨苄青霉素(AMP)、庆大霉素(GTM)、头孢唑啉(CZL)、头孢哌酮(CPZ)、丁胺卡那霉素(AMK)、氟哌酸(FOX)、头孢噻甲羧肟(CAZ)、头孢呋新(CXM)、氧哌嗪青霉素(PIP)等药敏纸片由北京天坛药物生物技术开发部提供，批号9612。
1.1.4 试剂与试药 质粒提取用试剂按文献[5]。三黄片(河南省百泉制药厂批号970521)主要成份为大黄、黄芩总苷、盐酸黄连素，其比例为0.3∶0.3∶0.005。
, 百拇医药
1.2 方法
质粒消除前后，48株多重耐药株药敏试验采用K-B法[6]；从48株菌中小量提取质粒DNA，采用Takahhashi改良法操作[5]。
1.2.1 消质剂亚抑菌浓度的选择 传统消质剂SDS亚抑菌浓度的确定见文献[8]，经计算得0.015%SDS-LB肉汤；中药消质剂三黄片亚抑菌浓度的确定见文献[7，8]，结合文献[3]方法计算得120 mg/ml三黄片LB肉汤。
1.2.2 质粒消除试验 参照文献[1]方法，将试验菌株转种MH平板复苏后，转种2 ml LB肉汤，37℃振摇培养16～18 h，取5 μl加入2 ml含亚抑菌浓度消质剂的LB肉汤中，37℃振摇培养18 h后取5 μl加入2 ml消质剂LB肉汤中重复操作，作用48～54 h后，用营养肉汤作质粒提取和药敏试验。
, 百拇医药
1.3 结果
1.3.1 用三黄片作为消质剂进行质粒消除前后质粒图谱的比较见图1，消除试验后，有15株大肠杆菌丢失了一至数条质粒带，质粒消除率为31%(15/48)；用SDS作为消质剂进行质粒消除前后质粒图谱的比较见图2，消除试验后，有13株大肠杆菌丢失了一至数条质粒带，质粒消除率为27%(13/48)。
Fig 1 Plasmid profiles of some strains before and after curing plasmid by San Huang tablet
A-E Plasmid profiles of E.coli V517 and strain No.2298， No.2202 No.2314 No.2410 before curing plasmid
, 百拇医药
A′-E′ Plasmid profiles of E.coli V 517 and strain No.2298 No.2202 No.2314 No.2410 after curing plasmid
Fig 2 Plasmid profiles of some strains before and afer curing plasmid by SDS
A-E Plasmid profiles of E.coli V517 and strain No.2193 No.2337 No.2201 No.2410 before curing plasmid
A′-E′ Plasmid profiles of E.coli V517 and strain No.2193 No.2337 No.2201 No.2410 after curing plasmid
, 百拇医药
1.3.2 两种消质剂对质粒进行消除的结果比较见表1，经X2检验P>0.05，两法无显著性差异；消除质粒前后受试菌药敏结果比较见表2、表3。
Table 1 Comparison of antibiotics resistance before and after two curing methods Method for
curing plasmid
After curing plasmid
Total
No. of strains
lost plasmid
No. of strains
, 百拇医药
lost no palsmid
San Huang tablet
35
13
48
SDS
33
15
48
χ2 test P>0.05
Table 2 Antibiotics resistance before and after curing plasmids in some E.coli strains Strain
, 百拇医药
No.
Antibiotic resistant profile
before curing plasmid
curing plasmid by San Huang
curing plasmid by SDS
143
P.AMP.PIP.NOR.CXM
P.NOR
P.AMP.CXM.NOR
156
, http://www.100md.com P.AMP.PIP.GM.NOR.CXM
P.AMP
P.AMP
267
P.AMP.PIP.GM.NOR.CZL
P.AMP.PIP.GM.CZL
P.AMP.PIP.GM.CZL.NOR
A1011
P.AMP.PIP.GM.CZL.CPZ.NOR.CXM
P.AMP.PIP.GM.CFP.NOR
P.AMP.PIP.GM.CFP.NOR
, 百拇医药
2190
P.AMP.PIP.GM.CZL
P.AMP.PIP.GM
P.AMP.PIP.GM.CZL
2193
P.AMP.PIP.CZL.NOR.CXM
P.AMP.PIP.NOR
P.AMP.PIP.NOR
2201
P.AMP.PIP.GM
P.AMP.GM
, 百拇医药
P.AMP.PIP.CXM
2206
P.AMP.PIP.GM.CZL.CPZ.AMK.NOR
P.AMP.CFP.NOR
P.AMP.CFP.NOR
2258
P.AMP.PIP.GM.CZL.CPZ.NOR.CXM
P.AMP.PIP.NOR
P.AMP.PIP.GM.NOR.CXM
2260
, 百拇医药 P.PIP
P
P.PIP
2410
P.AMP.CZL
P
P
5152
P.AMP.PIP.GM.NOR
P.AMP.GM.NOR
P.AMP.GM.NOR
5167
, http://www.100md.com P.AMP.PIP.NOR.CXM
P.AMP.NOR
P.AMP.NOR
Table 3 Comparison of antibiotics resistance before and afer two curing methods Method for
curing plasmid
After curing plasmid
No. of strains*
No. of strains**
San Huang tablet
, 百拇医药
38
11
SDS
35
13
* Become susceptible to at least one kind of antibiotics after curing plasmid；** No change in antibiotics resistant profile after curing plasmid ；χ2 test P>0.05
2 讨论
以上实验选用价廉易得，毒副作用小的大黄、黄芩、黄连三种中药的复方制剂三黄片与传统消质剂SDS进行对比研究，三黄片中的三种主要成分不仅有一定的抑菌作用[9]，而且有一定的质粒消除作用[10～12]。研究结果表明，三黄片对耐药菌株有明显的消质作用，提示临床抗感染治疗中三黄片与抗生素联合用药可防止菌株产生耐药性。而三黄片的消质作用是否比单一用药的文献报道的质粒消除使用更强，尚待进一步的对比研究。在实验中还发现部分菌株经三黄片与SDS作用后，药敏变化很明显，但质粒谱却无改变，推测三黄片或SDS作用后并未真正消除质粒但可能灭活该耐药质粒或抑制了质粒介导的耐药性表达；这部分菌株的耐药系染色体介导而非质粒介导，消质剂可能部分改变了染色体的结构，造成染色体上耐药基因的失治或丢失等。此推测是否确证待进一步实验。以上三黄片与SDS两种方法消质效果相当。这为探讨中药抗菌机理；采用中西医结合的治疗方法来对付难治性感染以控制院内感染；对开发中医药资源具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
, 百拇医药
* 美国中华医学基金会CMB92-558资助课题
参考文献
1 刘正友，王其南，杜继昭等.革兰氏阴性杆菌院内感染株菌的质粒分析.中国抗生素杂志，1991，16(5)∶344
2 Asheshov EH. Loss of antibiotic Resistance in staphylococcus aureas resulting from growth at high temperature. J Gen microbiol, 1996, 42(3)∶403
3 Bouanchand DH, Scavizzi MR, Chabbert YA. Elimination by ethidium bromide of antibiotic resistance in enterobaoteria and stanhyldocci. J Gen microbiol, 1969,54(12)∶417
, http://www.100md.com
4 Macrina FL. A multiple plasmid-containing escherich coli strain:Convenient source of size reference plasmid moleculars. Plasmid, 1978, 1(1)∶417
5 Takahashi,Nagano. Rapid procedure for isolation of plasmid DNA and application to epidemioligical analysis. J Clin microliol, 1984, 20(4)∶608
6 WHO Guidelines for antimicrobiol susceptibility testing Lab.1979.3
7 周帮靖主编.常用中药的抗菌作用及其测定方法.重庆：重庆科学技术出版社，1987.302
, 百拇医药
8 徐淑云主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991.1096
9 郭力弓主编.中药现代研究与临床应用[Ⅰ].北京：学苑出版社，1992.68
10 陈小英.大黄素对金黄色葡萄球菌抗生系耐药质粒的消除作用.南京药学院学报，1985，16(2)∶48
11 陈群，关显智，朱玉兰等.黄芩对去污染小鼠体内痢疾杆菌R质粒消除试验研究.中国微生态杂志，1992，4(1)∶10
12 徐建国，刘秉阳.去污染的小白鼠体内痢疾杆菌R因子消除试验的探讨.中华微生物学和免疫学杂志，1983，3(5)∶328, 百拇医药(康 梅 陈知行 许秀成** 潘培根)
单位：华西医科大学附一院检验科 医学分子生物学实验室** 成都 610041
关键词：三黄片；医院内感染；大肠杆菌；质粒消除
华西药学杂志990543 提要 用三黄片作为质粒消除剂，对48株院内感染大肠杆菌多重耐药株采用连续稀释培养法进行质粒消除试验，并与传统SDS法进行了比较。经试验前后药敏试验及质粒指纹图谱分析，结果前法质粒消除率为31%(15/48)，其耐药性也随之部分消失；后法质粒消除率为27%(13/48；经X2检验，两法无显著性差异(P>0.05)；研究表明，三黄片对耐药质粒有较强的消除作用。
STUDY ON PLASMID ELIMINATION OF SAN HUANG
, 百拇医药
TABLETS TO NOSOCOMIAL E.coli*
Kang Mei Chen Zhixing Xu Xiucheng Pan Peigen
(The First University Hospital, West China University of Medical Sciences Chengdu 610041)
ABSTRACT San Huang Tablet, which is a kind of traditional Chinese medicine, was chosen as a curing agent to eliminate plasmid of 48 multiply antibiotic-resistant nosocomial E.coli strains by series dilution,and was compared with another traditional curing agent-SDS. The result demonstrated that the curing percentage of San Huang tablet is 31%(15/48) and 27% of SDS(13/48).No significant difference was found between San Huang tablet and SDS in effect on plasmid elimination (P>0.05). It suggested that San Huang tablet is a effective plasmid curing agent to E. coli in hospital infection and has important significance for therapying and controlling hospital infection.
, 百拇医药
Key Words San Huang tablet Nosocomial Infection E.coli Curing of plasmid Multiply antibiotic-resistance
用消除质粒的方法解决细菌耐药问题，国外采用的消质剂多为对人体有害的化学物质或方法本身不适用于人体[1～3]，而有关临床药物的质粒消除作用，国内外文献中多为单一化学抗菌药物，草药和中成药仅偶有报道，并且消除率均很低。现选用临床常用价廉易得的复方中成药——三黄片作为消质剂与传统消质剂SDS作对比研究。
1 材料、方法和结果
1.1 材料
1.1.1 菌株 大肠杆菌多重耐药株(来源于1997年4月～1998年11月本院检验科细菌室分离鉴定的临床菌株，耐两种或两种以上作用机制不同的抗生素)；药敏质控对照菌株ATCC 25922大肠杆菌(卫生部临床检验中心)；标准分子量质粒菌株[V517[4]分子量54.2,7.3,5.6,5.2,3.9,3.0,2.7,2.1 kb(华西医科大学公共卫生学院卫生检验教研室)。
, 百拇医药
1.1.2 培养基 Mueller-Hinton(MH)琼脂平板(浙江军区后勤部，批号960109)；Luria-Bertani(L-B)肉汤(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母浸汁，1.0%NaCl,pH7.4～7.6);0.015%SDS-LB肉汤[1000 ml LB肉汤中加入5 ml 3%SDS(十二烷基磺酸钠)]；三黄片LB肉汤[LB肉汤中加入三黄片粉末使其终浓度为三黄片的亚抑菌药浓度(120 mg/ml)]。
1.1.3 抗生素纸片 青霉素(P)、氨苄青霉素(AMP)、庆大霉素(GTM)、头孢唑啉(CZL)、头孢哌酮(CPZ)、丁胺卡那霉素(AMK)、氟哌酸(FOX)、头孢噻甲羧肟(CAZ)、头孢呋新(CXM)、氧哌嗪青霉素(PIP)等药敏纸片由北京天坛药物生物技术开发部提供，批号9612。
1.1.4 试剂与试药 质粒提取用试剂按文献[5]。三黄片(河南省百泉制药厂批号970521)主要成份为大黄、黄芩总苷、盐酸黄连素，其比例为0.3∶0.3∶0.005。
, 百拇医药
1.2 方法
质粒消除前后，48株多重耐药株药敏试验采用K-B法[6]；从48株菌中小量提取质粒DNA，采用Takahhashi改良法操作[5]。
1.2.1 消质剂亚抑菌浓度的选择 传统消质剂SDS亚抑菌浓度的确定见文献[8]，经计算得0.015%SDS-LB肉汤；中药消质剂三黄片亚抑菌浓度的确定见文献[7，8]，结合文献[3]方法计算得120 mg/ml三黄片LB肉汤。
1.2.2 质粒消除试验 参照文献[1]方法，将试验菌株转种MH平板复苏后，转种2 ml LB肉汤，37℃振摇培养16～18 h，取5 μl加入2 ml含亚抑菌浓度消质剂的LB肉汤中，37℃振摇培养18 h后取5 μl加入2 ml消质剂LB肉汤中重复操作，作用48～54 h后，用营养肉汤作质粒提取和药敏试验。
, 百拇医药
1.3 结果
1.3.1 用三黄片作为消质剂进行质粒消除前后质粒图谱的比较见图1，消除试验后，有15株大肠杆菌丢失了一至数条质粒带，质粒消除率为31%(15/48)；用SDS作为消质剂进行质粒消除前后质粒图谱的比较见图2，消除试验后，有13株大肠杆菌丢失了一至数条质粒带，质粒消除率为27%(13/48)。
Fig 1 Plasmid profiles of some strains before and after curing plasmid by San Huang tablet
A-E Plasmid profiles of E.coli V517 and strain No.2298， No.2202 No.2314 No.2410 before curing plasmid
, 百拇医药
A′-E′ Plasmid profiles of E.coli V 517 and strain No.2298 No.2202 No.2314 No.2410 after curing plasmid
Fig 2 Plasmid profiles of some strains before and afer curing plasmid by SDS
A-E Plasmid profiles of E.coli V517 and strain No.2193 No.2337 No.2201 No.2410 before curing plasmid
A′-E′ Plasmid profiles of E.coli V517 and strain No.2193 No.2337 No.2201 No.2410 after curing plasmid
, 百拇医药
1.3.2 两种消质剂对质粒进行消除的结果比较见表1，经X2检验P>0.05，两法无显著性差异；消除质粒前后受试菌药敏结果比较见表2、表3。
Table 1 Comparison of antibiotics resistance before and after two curing methods Method for
curing plasmid
After curing plasmid
Total
No. of strains
lost plasmid
No. of strains
, 百拇医药
lost no palsmid
San Huang tablet
35
13
48
SDS
33
15
48
χ2 test P>0.05
Table 2 Antibiotics resistance before and after curing plasmids in some E.coli strains Strain
, 百拇医药
No.
Antibiotic resistant profile
before curing plasmid
curing plasmid by San Huang
curing plasmid by SDS
143
P.AMP.PIP.NOR.CXM
P.NOR
P.AMP.CXM.NOR
156
, http://www.100md.com P.AMP.PIP.GM.NOR.CXM
P.AMP
P.AMP
267
P.AMP.PIP.GM.NOR.CZL
P.AMP.PIP.GM.CZL
P.AMP.PIP.GM.CZL.NOR
A1011
P.AMP.PIP.GM.CZL.CPZ.NOR.CXM
P.AMP.PIP.GM.CFP.NOR
P.AMP.PIP.GM.CFP.NOR
, 百拇医药
2190
P.AMP.PIP.GM.CZL
P.AMP.PIP.GM
P.AMP.PIP.GM.CZL
2193
P.AMP.PIP.CZL.NOR.CXM
P.AMP.PIP.NOR
P.AMP.PIP.NOR
2201
P.AMP.PIP.GM
P.AMP.GM
, 百拇医药
P.AMP.PIP.CXM
2206
P.AMP.PIP.GM.CZL.CPZ.AMK.NOR
P.AMP.CFP.NOR
P.AMP.CFP.NOR
2258
P.AMP.PIP.GM.CZL.CPZ.NOR.CXM
P.AMP.PIP.NOR
P.AMP.PIP.GM.NOR.CXM
2260
, 百拇医药 P.PIP
P
P.PIP
2410
P.AMP.CZL
P
P
5152
P.AMP.PIP.GM.NOR
P.AMP.GM.NOR
P.AMP.GM.NOR
5167
, http://www.100md.com P.AMP.PIP.NOR.CXM
P.AMP.NOR
P.AMP.NOR
Table 3 Comparison of antibiotics resistance before and afer two curing methods Method for
curing plasmid
After curing plasmid
No. of strains*
No. of strains**
San Huang tablet
, 百拇医药
38
11
SDS
35
13
* Become susceptible to at least one kind of antibiotics after curing plasmid；** No change in antibiotics resistant profile after curing plasmid ；χ2 test P>0.05
2 讨论
以上实验选用价廉易得，毒副作用小的大黄、黄芩、黄连三种中药的复方制剂三黄片与传统消质剂SDS进行对比研究，三黄片中的三种主要成分不仅有一定的抑菌作用[9]，而且有一定的质粒消除作用[10～12]。研究结果表明，三黄片对耐药菌株有明显的消质作用，提示临床抗感染治疗中三黄片与抗生素联合用药可防止菌株产生耐药性。而三黄片的消质作用是否比单一用药的文献报道的质粒消除使用更强，尚待进一步的对比研究。在实验中还发现部分菌株经三黄片与SDS作用后，药敏变化很明显，但质粒谱却无改变，推测三黄片或SDS作用后并未真正消除质粒但可能灭活该耐药质粒或抑制了质粒介导的耐药性表达；这部分菌株的耐药系染色体介导而非质粒介导，消质剂可能部分改变了染色体的结构，造成染色体上耐药基因的失治或丢失等。此推测是否确证待进一步实验。以上三黄片与SDS两种方法消质效果相当。这为探讨中药抗菌机理；采用中西医结合的治疗方法来对付难治性感染以控制院内感染；对开发中医药资源具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
, 百拇医药
* 美国中华医学基金会CMB92-558资助课题
参考文献
1 刘正友，王其南，杜继昭等.革兰氏阴性杆菌院内感染株菌的质粒分析.中国抗生素杂志，1991，16(5)∶344
2 Asheshov EH. Loss of antibiotic Resistance in staphylococcus aureas resulting from growth at high temperature. J Gen microbiol, 1996, 42(3)∶403
3 Bouanchand DH, Scavizzi MR, Chabbert YA. Elimination by ethidium bromide of antibiotic resistance in enterobaoteria and stanhyldocci. J Gen microbiol, 1969,54(12)∶417
, http://www.100md.com
4 Macrina FL. A multiple plasmid-containing escherich coli strain:Convenient source of size reference plasmid moleculars. Plasmid, 1978, 1(1)∶417
5 Takahashi,Nagano. Rapid procedure for isolation of plasmid DNA and application to epidemioligical analysis. J Clin microliol, 1984, 20(4)∶608
6 WHO Guidelines for antimicrobiol susceptibility testing Lab.1979.3
7 周帮靖主编.常用中药的抗菌作用及其测定方法.重庆：重庆科学技术出版社，1987.302
, 百拇医药
8 徐淑云主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991.1096
9 郭力弓主编.中药现代研究与临床应用[Ⅰ].北京：学苑出版社，1992.68
10 陈小英.大黄素对金黄色葡萄球菌抗生系耐药质粒的消除作用.南京药学院学报，1985，16(2)∶48
11 陈群，关显智，朱玉兰等.黄芩对去污染小鼠体内痢疾杆菌R质粒消除试验研究.中国微生态杂志，1992，4(1)∶10
12 徐建国，刘秉阳.去污染的小白鼠体内痢疾杆菌R因子消除试验的探讨.中华微生物学和免疫学杂志，1983，3(5)∶328, 百拇医药(康 梅 陈知行 许秀成** 潘培根)