酪氨酸受体激酶B在胚胎脊髓修复成鼠损伤脊髓过程中的变化
作者：李兵仓 王正国 朱佩芳 胡建 李应玉 廖维宏
单位：李兵仓 王正国 朱佩芳 胡建 李应玉 廖维宏 400042 重庆,第三军医大学附属大坪医院、野战外科研究所
关键词：脊髓损伤；脊髓移植；酪氨酸受体激酶B
中华创伤杂志980503 【摘要】 目的 确定酪氨酸受体激酶B(trkB)在胚胎脊髓修复成鼠脊髓损伤过程中的变化。方法 将妊娠14天胚胎脊髓植入急性损伤的成体脊髓后1,3,5,7,10,15和30天,用原位杂交、斑点杂交和免疫组化技术对trkB mRNA与蛋白作定性和定量观察。结果 定性观察表明,在正常大鼠脊髓内,trkB mRNA杂交产物主要分布在神经元和胶质细胞,神经纤维杂交反应不明显;脊髓损伤后阳性神经元和胶质细胞都有所增加,但阳性神经纤维增加的数目略为突出;胚胎脊髓植入损伤脊髓后,上述各阳性反应成分进一步增加,尤其是阳性神经纤维的增加更为显著。定量观察显示的trkB mRNA的分子杂交反应与定性观察结果大体一致。免疫组化显色的trkB蛋白,无论分布还是反应强度都与其mRNA的变化大致相符。结论 损伤脊髓在移植修复过程中能够以调整受体合成的方式来适应营养环境的变化,但胶质细胞受体合成增加可能起了与神经成分争夺神经营养因子的副作用。
, http://www.100md.com
Changes of trkB During Embryonic Spinal Cord Repairing Spinal Cord Injury in Adult Rats LI Bing-cang, WANG Zheng-guo, ZHU Pei-fang, et al. Research Institute of Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400042
【Abstract】 Aim To determine the changes of tyrosine receptor kinase B (trkB) during embryonic spinal cord repairing spinal cord injury in adult rats. Methods With the technique of molecular hybridization and immunohistochemistry, the changes of trkB mRNA and its protein were demonstrated qualitatively and quantitatively at days 1, 3, 5, 7, 10, 15 and 30 after embryonic spinal cord was transplanted into the acutely injured spinal cord of adult rats. Meanwhile, the normal rats and the rats with spinal cord injury but with no repair were used as the controls. Results It was shown qualitatively by in situ hybridization that the reaction products distributed mainly in the cytoplasm of neurons and gliocytes in the normal spinal cord, but the nerve fibres without distinctive products. Following spinal cord injury, the number of positively reacting elements mentioned above increased, but among them the nerve fibres increased even a little more. After the transplantation, all the positively hybridizing elements further increased in number, and the nerve fibers increased prominently, too. The quantitative determination on the intensity of in situ hybridization and dot hybridization showed similar changes as that of the qualitative observation. Not only intenseness but also distribution of trkB protein revealed by immunohistochemistry was basically coincident with that of trkB mRNA. Conclusion During the course of embryonic spinal cord repairing injured spinal cord, the host tissue can modulate synthesis of neurotrophine receptor and in this way make itself to be adapted to the changes of trophic enviroment. However, the increase of the receptor in gliocyte may result in a side effect of grabing neurotrophine with neurons and nerve fibres.
, 百拇医药
【Key words】 Spinal cord injury Spinal cord transplantation Tyrosine receptor kinase B
神经生长因子家族的成员都是通过一类称为酪氨酸受体激酶(tyrosine receptor kinase, trkB)的膜蛋白发挥其生物学效应的。在trk类受体中,脑源性神经营养因子(brian-derived neurotrophic facotr, BDNF)的特异受体是trkB[1～5]。为了较为全面地探讨脊髓损伤的移植修复机制,笔者采用分子杂交和免疫组织化学技术观察trkB mRNA及其蛋白在胚胎脊髓修复成鼠损伤脊髓过程中的变化。
材料与方法
将妊娠14天胎鼠脊髓植入成鼠损伤脊髓后1,3,5,7,10,15,30天,采用文献[6]相同的方法进行trkB mRNA的原位杂交和斑点杂交,所用定性和定量观察方法也与文献[6]相同。但大鼠trkB cDNA探针由德国Dechant等[3]赠送,片段长1.47kb,连接于Bluescript KS+质粒多克隆位点EcoRI与XbaI位点之间。
, http://www.100md.com
免疫组化所用trkB多肽抗体(兔抗小鼠)由澳大利亚周新富等[4]赠送,采用ABC(Vector公司)法进行免疫组化反应。主要操作步骤为50μm冰冻切片经消化、漂洗等处理后,加入正常血清室温下孵育20分钟;之后再入1∶500稀释的trkB抗体工作液37℃10分钟,0.01mol/L pH7.2PBS浸洗3×5分钟;加入ABC复合物反应液37℃ 60分钟,再用0.01mol/L pH 7.2PBS浸洗10分钟,DAB-H2O2显色液显色15分钟。显色结束后蒸馏水冲洗10分钟,铺切片于载玻片,1%甲基绿复染15分钟。此后脱水、透明及封片。免疫组化的切片对照采用PBS代替trkB抗体进行。
本实验共用大鼠163只,其中移植组77只(每时相点11只),单纯损伤组70只(每时相点10只),正常对照组16只(原位杂交6只,斑点杂交5只,免疫组化5只)。
统计学处理方法:所有数据均进行t检验分析,数据以
±s表示。
, 百拇医药
结 果
一、原位分子杂交
1.定性观察:trkB mRNA的杂交颗粒除分布于神经元和胶质细胞外,神经纤维上也可观察到反应产物。从对比情况来看,胚胎脊髓移植组阳性杂交成分,尤其是阳性神经纤维的数量比单纯脊髓损伤组的多,杂交颗粒也更为密集(图1,2);而损伤组与正常组相比,各种阳性成分的数量和反应强度又以损伤组为多而强(图3);正常脊髓内神经纤维上无明显的杂交产物。
图1 移植后15天移植物(G)和宿主脊髓(H)内均有很多强阳性杂交成分:
宿主神经元和胚胎神经元(→) 原位杂交 ×40
, http://www.100md.com
图2 移植后15天宿主脊髓阳性杂交神经纤维(→) 原位杂交 ×200
图3 损伤后7天阳性杂交宿主神经元(→),但神经纤维(
)
的杂交反应较弱 原位杂交 ×200
2.定量观察:各组大鼠trkB mRNA杂交阳性反应神经元的数量变化和反应强度见表1,2。
表1 各组脊髓trkB mRNA原位杂交阳性神经元数量
变化(±s,基线值=8.47±0.56,个/100平方微米) 组别
, http://www.100md.com
术后时间(d)
1
3
5
7
10
15
30
损伤组
9.22±0.45
14.58±1.56△
23.56±2.9△△
, 百拇医药
31.32±2.54△△
22.22±3.21△△
16.52±2.58△
8.93±1.67
移植组
11.25±0.93△
16.93±1.65△
25.86±2.13△△
33.36±3.50△△
40.60±2.68**△△
, 百拇医药
45.08±3.26**△△
15.84±2.10△*
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01表2 各组脊髓神经元trkB mRNA原位杂交反应灰度变化(±s,基线值=62.71±2.89) 组别
术后时间(d)
1
3
5
, 百拇医药 7
10
15
30
损伤组
73.21±5.10
97.48±3.46△△
119.84±4.60△△
141.11±55.51△△
116.24±7.68△△
88.81±77.71△
, 百拇医药
62.92±6.92
移植组
95.56±3.88△△*
112.63±4.21△△*
122.9±4.14△△
139.82±3.84△△
142.53±6.07△△*
152.2±9.59△△**
76.72±4.69
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01
, http://www.100md.com
二、免疫组织化学
1.定性观察:在正常脊髓内,trkB免疫组化反应产物主要分布在各种类型的神经元、也可观察到阳性反应的少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经纤维。脊髓损伤后,免疫反应产物的分布并没发生变化,但各种阳性反应成分的数量随时间而增加,其中阳性神经纤维增加略为突出,术后7天各种阳性结构的数量达到顶峰。此后开始逐渐减少,至术后15天阳性结构的数目和正常脊髓已相差无几。在阳性结构增多和降低的同时,反应产物也经历了一个由疏到密,然后又变得稀疏的过程。胚胎脊髓移植后,各种阳性结构的数量比单纯损伤动物的略多,反应颗粒也略为密集(图4,5)。移植后免疫组化阳性结构数目和反应颗粒密集程度同样经历了由低到高,然后由高到低的过程,不过这个高低转折点不是术后7天,而是术后15天。
图4 移植后15天阳性反应宿主神经元(→),右上小插图为阳性
, 百拇医药
反应胶质细胞 免疫组化 ×200
图5 移植后15天宿主脊髓阳性反应神经纤维(→)免疫组化 ×400
2.定量观察:各组trkB免疫组化反应阳性神经元数目和反应强度随时间的变化情况与原位杂交的基本相同。见表3,4。
表3 各组脊髓trkB免疫组化反应阳性神经元数量
变化(±s,基线值=8.92±1.41,个/100平方微米) 组别
术后时间(d)
1
, http://www.100md.com
3
5
7
10
15
30
损伤组
11.18±2.93
16.97±2.06△
19.85±2.96△△
24.51±2.58△△
20.85±2.45△△
, 百拇医药
19.51±2.60△
13.22±2.90
移植组
14.68±3.09
20.50±3.09△
21.03±2.46△△
22.60±2.05△△
25.95±2.6△△
27.68±2.72△△*
17.71±3.85△
, http://www.100md.com
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01表4 各组脊髓神经元trkB免疫组化反应灰度变化(±s,基线值=33.12±3.2) 组别
术后时间(d)
1
3
5
7
10
15
30
, 百拇医药
损伤组
43.08±5.89
59.60±3.68△△
69.12±4.09△△
87.19±3.49△△
78.62±5.70△△
66.50±3.07△△
46.92±4.66△
移植组
49.39±4.66
, http://www.100md.com
70.66±4.09△△
81.45±5.39△△
92.14±5.47△△
105.70±7.71△△*
124.17±5.55△△**
70.59±4.28△△**
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01
三、斑点杂交
, http://www.100md.com
图6是trkB mRNA斑点杂交的反应图谱。据此计算的每微克总RNA中mRNA的拷贝数在正常组为0.05±0.01。单纯脊髓损伤后1天为0.06±0.01;术后5天与正常组相比开始出现非常显著性差异(P<0.01);术后7天拷贝数最高,为0.26±0.02;以后逐步由术后10天时的0.20±0.03降至术后30天的0.04±0.02。脊髓移植后1天,mRNA的拷贝数为0.10±0.04;移植后3天与正常组相比开始出现非常显著性差异(P<0.01);术后5天与损伤组相比则开始出现显著性差异(P<0.05);移植后10天和15天mRNA的拷贝数分别为0.52±0.04和0.51±0.02,与其他两组相比均有显著性差异(P<0.05)和非常显著性差异(P<0.01);移植后30天为0.09±0.02,与其他两组相比仍有显著性差异(P<0.05)。
图6 各组大鼠脊髓trkB mRNA斑点杂交图
, 百拇医药
讨 论
文献[1～5]证明,BDNF必须通过trkB的特异介导才能发挥其维持神经发育、挽救损伤神经元等生物学效应。笔者除观察BDNF mRNA的表达变化外[6],又用原位杂交和免疫组化技术观察trkB mRNA与其蛋白的改变。定性观察表明,在正常大鼠脊髓内,trkB mRNA和trkB蛋白以神经元内分布为主。脊髓损伤后,神经元的杂交和组化反应都明显增强,特别是神经纤维内的反应,不但反应颗粒堆积得越来越致密,反应纤维的数量也越来越多。这种现象提示,在损伤刺激下,脊髓神经元和神经纤维不但增强了mRNA的转录,同时蛋白的合成也增加,以结合更多的神经营养因子来保护自身和维持再生。胚胎脊髓移植后,参加反应的神经元和神经纤维的数目进一步增加,反应程度也进一步增强,这似乎说明中枢神经组织有自我调整以适应环境的本能。至于笔者观察到胶质细胞呈trkB杂交和免疫组化反应阳性的现象,尚不能从移植修复机制角度做出满意解释,只能和Zhou等[4]用免疫组织化学技术观察到相同现象的看法一样,那就是神经系统内的胶质细胞也是一个利用BDNF来营养自身的细胞成分。由此笔者推想:脊髓损伤后胶质细胞的大量增生不仅仅是形成阻挡中枢神经再生的屏障,它们也以增加受体的形式与神经细胞争夺神经营养因子,从而形成中枢神经纤维再生很难成功的又一原因。
, 百拇医药
在定性观察基础上,也对原位分子杂交、斑点杂交和免疫细胞化学反应的trkB mRNA和trkB蛋白作了定量描述。结果显示,它们的反应强度及其变化情况与定性观察基本一致,与其配体BDNF mRNA的变化情况[6]也大致相符。这说明当成体哺乳动物脊髓遭受损伤后,不但神经营养因子的表达增强,受体的合成也增加。这种恰到好处的有机协调使得损伤脊髓的神经成分能够更有效的利用周围环境中,以及自身表达的神经营养因子,从而对损伤做出以再生为主的修复反应;当将胚胎脊髓植入损伤脊髓后,宿主神经成分又会从配体和受体两个方面来调整自身反应强度,以配合胚胎脊髓共同完成修复损伤脊髓的“任务”。
本课题受国家自然科学基金资助(No.39470715)
参考文献
[1]Philo J, Talvenheimo J, Wen J, et al. Interactions of neurotrophin-3 (NT-3), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and the NT-3. BDNF heterodimer with the extracelluarl domains of the trkB and trkC receptors. J Biol Chem, 1994, 26∶27806-27846.
, 百拇医药
[2]Wetmore C, Olson L. Neuronal and nonneuronal expression of neurotrophins and their receptors in sensory and sympathetic ganglia suggest new intercellular trophic interactions. J Comp Neurl, 1995, 353∶143-159.
[3]Dechant G, Biffo S, Okazawa H, et al. Expression and binding characteristic of the BDNF receptor chick trkB. Development, 1993, 119∶545-558.
[4]Zhou XF, Parada L, Soppet D, et al. Distribution of trkB tyrosine kinase immunoreactivity in the rat central nervous system. Brain Res, 1993, 622∶63-70.
[5]Middlemas DS, Lindberg RA, Hunter T. trkB, a neural receptor protein-tyrosine kinase: Evidence for a full-length and two truncated receptors. Mol Cell Biol, 1991, 11∶143-153.
[6]李兵仓,王正国,朱佩芳,等.BDNF mRNA在胚胎脊髓修复成鼠损伤脊髓过程中的表达变化.中华医学杂志, 1997, 77∶516-520.
(收稿:1997-12-18 修回:1998-06-15), 百拇医药
单位：李兵仓 王正国 朱佩芳 胡建 李应玉 廖维宏 400042 重庆,第三军医大学附属大坪医院、野战外科研究所
关键词：脊髓损伤；脊髓移植；酪氨酸受体激酶B
中华创伤杂志980503 【摘要】 目的 确定酪氨酸受体激酶B(trkB)在胚胎脊髓修复成鼠脊髓损伤过程中的变化。方法 将妊娠14天胚胎脊髓植入急性损伤的成体脊髓后1,3,5,7,10,15和30天,用原位杂交、斑点杂交和免疫组化技术对trkB mRNA与蛋白作定性和定量观察。结果 定性观察表明,在正常大鼠脊髓内,trkB mRNA杂交产物主要分布在神经元和胶质细胞,神经纤维杂交反应不明显;脊髓损伤后阳性神经元和胶质细胞都有所增加,但阳性神经纤维增加的数目略为突出;胚胎脊髓植入损伤脊髓后,上述各阳性反应成分进一步增加,尤其是阳性神经纤维的增加更为显著。定量观察显示的trkB mRNA的分子杂交反应与定性观察结果大体一致。免疫组化显色的trkB蛋白,无论分布还是反应强度都与其mRNA的变化大致相符。结论 损伤脊髓在移植修复过程中能够以调整受体合成的方式来适应营养环境的变化,但胶质细胞受体合成增加可能起了与神经成分争夺神经营养因子的副作用。
, http://www.100md.com
Changes of trkB During Embryonic Spinal Cord Repairing Spinal Cord Injury in Adult Rats LI Bing-cang, WANG Zheng-guo, ZHU Pei-fang, et al. Research Institute of Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400042
【Abstract】 Aim To determine the changes of tyrosine receptor kinase B (trkB) during embryonic spinal cord repairing spinal cord injury in adult rats. Methods With the technique of molecular hybridization and immunohistochemistry, the changes of trkB mRNA and its protein were demonstrated qualitatively and quantitatively at days 1, 3, 5, 7, 10, 15 and 30 after embryonic spinal cord was transplanted into the acutely injured spinal cord of adult rats. Meanwhile, the normal rats and the rats with spinal cord injury but with no repair were used as the controls. Results It was shown qualitatively by in situ hybridization that the reaction products distributed mainly in the cytoplasm of neurons and gliocytes in the normal spinal cord, but the nerve fibres without distinctive products. Following spinal cord injury, the number of positively reacting elements mentioned above increased, but among them the nerve fibres increased even a little more. After the transplantation, all the positively hybridizing elements further increased in number, and the nerve fibers increased prominently, too. The quantitative determination on the intensity of in situ hybridization and dot hybridization showed similar changes as that of the qualitative observation. Not only intenseness but also distribution of trkB protein revealed by immunohistochemistry was basically coincident with that of trkB mRNA. Conclusion During the course of embryonic spinal cord repairing injured spinal cord, the host tissue can modulate synthesis of neurotrophine receptor and in this way make itself to be adapted to the changes of trophic enviroment. However, the increase of the receptor in gliocyte may result in a side effect of grabing neurotrophine with neurons and nerve fibres.
, 百拇医药
【Key words】 Spinal cord injury Spinal cord transplantation Tyrosine receptor kinase B
神经生长因子家族的成员都是通过一类称为酪氨酸受体激酶(tyrosine receptor kinase, trkB)的膜蛋白发挥其生物学效应的。在trk类受体中,脑源性神经营养因子(brian-derived neurotrophic facotr, BDNF)的特异受体是trkB[1～5]。为了较为全面地探讨脊髓损伤的移植修复机制,笔者采用分子杂交和免疫组织化学技术观察trkB mRNA及其蛋白在胚胎脊髓修复成鼠损伤脊髓过程中的变化。
材料与方法
将妊娠14天胎鼠脊髓植入成鼠损伤脊髓后1,3,5,7,10,15,30天,采用文献[6]相同的方法进行trkB mRNA的原位杂交和斑点杂交,所用定性和定量观察方法也与文献[6]相同。但大鼠trkB cDNA探针由德国Dechant等[3]赠送,片段长1.47kb,连接于Bluescript KS+质粒多克隆位点EcoRI与XbaI位点之间。
, http://www.100md.com
免疫组化所用trkB多肽抗体(兔抗小鼠)由澳大利亚周新富等[4]赠送,采用ABC(Vector公司)法进行免疫组化反应。主要操作步骤为50μm冰冻切片经消化、漂洗等处理后,加入正常血清室温下孵育20分钟;之后再入1∶500稀释的trkB抗体工作液37℃10分钟,0.01mol/L pH7.2PBS浸洗3×5分钟;加入ABC复合物反应液37℃ 60分钟,再用0.01mol/L pH 7.2PBS浸洗10分钟,DAB-H2O2显色液显色15分钟。显色结束后蒸馏水冲洗10分钟,铺切片于载玻片,1%甲基绿复染15分钟。此后脱水、透明及封片。免疫组化的切片对照采用PBS代替trkB抗体进行。
本实验共用大鼠163只,其中移植组77只(每时相点11只),单纯损伤组70只(每时相点10只),正常对照组16只(原位杂交6只,斑点杂交5只,免疫组化5只)。
统计学处理方法:所有数据均进行t检验分析,数据以
±s表示。, 百拇医药
结 果
一、原位分子杂交
1.定性观察:trkB mRNA的杂交颗粒除分布于神经元和胶质细胞外,神经纤维上也可观察到反应产物。从对比情况来看,胚胎脊髓移植组阳性杂交成分,尤其是阳性神经纤维的数量比单纯脊髓损伤组的多,杂交颗粒也更为密集(图1,2);而损伤组与正常组相比,各种阳性成分的数量和反应强度又以损伤组为多而强(图3);正常脊髓内神经纤维上无明显的杂交产物。
图1 移植后15天移植物(G)和宿主脊髓(H)内均有很多强阳性杂交成分:
宿主神经元和胚胎神经元(→) 原位杂交 ×40
, http://www.100md.com
图2 移植后15天宿主脊髓阳性杂交神经纤维(→) 原位杂交 ×200
图3 损伤后7天阳性杂交宿主神经元(→),但神经纤维(
)的杂交反应较弱 原位杂交 ×200
2.定量观察:各组大鼠trkB mRNA杂交阳性反应神经元的数量变化和反应强度见表1,2。
表1 各组脊髓trkB mRNA原位杂交阳性神经元数量
变化(
±s,基线值=8.47±0.56,个/100平方微米) 组别, http://www.100md.com
术后时间(d)
1
3
5
7
10
15
30
损伤组
9.22±0.45
14.58±1.56△
23.56±2.9△△
, 百拇医药
31.32±2.54△△
22.22±3.21△△
16.52±2.58△
8.93±1.67
移植组
11.25±0.93△
16.93±1.65△
25.86±2.13△△
33.36±3.50△△
40.60±2.68**△△
, 百拇医药
45.08±3.26**△△
15.84±2.10△*
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01表2 各组脊髓神经元trkB mRNA原位杂交反应灰度变化(
±s,基线值=62.71±2.89) 组别术后时间(d)
1
3
5
, 百拇医药 7
10
15
30
损伤组
73.21±5.10
97.48±3.46△△
119.84±4.60△△
141.11±55.51△△
116.24±7.68△△
88.81±77.71△
, 百拇医药
62.92±6.92
移植组
95.56±3.88△△*
112.63±4.21△△*
122.9±4.14△△
139.82±3.84△△
142.53±6.07△△*
152.2±9.59△△**
76.72±4.69
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01
, http://www.100md.com
二、免疫组织化学
1.定性观察:在正常脊髓内,trkB免疫组化反应产物主要分布在各种类型的神经元、也可观察到阳性反应的少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经纤维。脊髓损伤后,免疫反应产物的分布并没发生变化,但各种阳性反应成分的数量随时间而增加,其中阳性神经纤维增加略为突出,术后7天各种阳性结构的数量达到顶峰。此后开始逐渐减少,至术后15天阳性结构的数目和正常脊髓已相差无几。在阳性结构增多和降低的同时,反应产物也经历了一个由疏到密,然后又变得稀疏的过程。胚胎脊髓移植后,各种阳性结构的数量比单纯损伤动物的略多,反应颗粒也略为密集(图4,5)。移植后免疫组化阳性结构数目和反应颗粒密集程度同样经历了由低到高,然后由高到低的过程,不过这个高低转折点不是术后7天,而是术后15天。
图4 移植后15天阳性反应宿主神经元(→),右上小插图为阳性
, 百拇医药
反应胶质细胞 免疫组化 ×200
图5 移植后15天宿主脊髓阳性反应神经纤维(→)免疫组化 ×400
2.定量观察:各组trkB免疫组化反应阳性神经元数目和反应强度随时间的变化情况与原位杂交的基本相同。见表3,4。
表3 各组脊髓trkB免疫组化反应阳性神经元数量
变化(
±s,基线值=8.92±1.41,个/100平方微米) 组别术后时间(d)
1
, http://www.100md.com
3
5
7
10
15
30
损伤组
11.18±2.93
16.97±2.06△
19.85±2.96△△
24.51±2.58△△
20.85±2.45△△
, 百拇医药
19.51±2.60△
13.22±2.90
移植组
14.68±3.09
20.50±3.09△
21.03±2.46△△
22.60±2.05△△
25.95±2.6△△
27.68±2.72△△*
17.71±3.85△
, http://www.100md.com
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01表4 各组脊髓神经元trkB免疫组化反应灰度变化(
±s,基线值=33.12±3.2) 组别术后时间(d)
1
3
5
7
10
15
30
, 百拇医药
损伤组
43.08±5.89
59.60±3.68△△
69.12±4.09△△
87.19±3.49△△
78.62±5.70△△
66.50±3.07△△
46.92±4.66△
移植组
49.39±4.66
, http://www.100md.com
70.66±4.09△△
81.45±5.39△△
92.14±5.47△△
105.70±7.71△△*
124.17±5.55△△**
70.59±4.28△△**
与正常组比较 △P<0.05 △△P<0.01; 与损伤组比较 *P<0.05 **P<0.01
三、斑点杂交
, http://www.100md.com
图6是trkB mRNA斑点杂交的反应图谱。据此计算的每微克总RNA中mRNA的拷贝数在正常组为0.05±0.01。单纯脊髓损伤后1天为0.06±0.01;术后5天与正常组相比开始出现非常显著性差异(P<0.01);术后7天拷贝数最高,为0.26±0.02;以后逐步由术后10天时的0.20±0.03降至术后30天的0.04±0.02。脊髓移植后1天,mRNA的拷贝数为0.10±0.04;移植后3天与正常组相比开始出现非常显著性差异(P<0.01);术后5天与损伤组相比则开始出现显著性差异(P<0.05);移植后10天和15天mRNA的拷贝数分别为0.52±0.04和0.51±0.02,与其他两组相比均有显著性差异(P<0.05)和非常显著性差异(P<0.01);移植后30天为0.09±0.02,与其他两组相比仍有显著性差异(P<0.05)。
图6 各组大鼠脊髓trkB mRNA斑点杂交图
, 百拇医药
讨 论
文献[1～5]证明,BDNF必须通过trkB的特异介导才能发挥其维持神经发育、挽救损伤神经元等生物学效应。笔者除观察BDNF mRNA的表达变化外[6],又用原位杂交和免疫组化技术观察trkB mRNA与其蛋白的改变。定性观察表明,在正常大鼠脊髓内,trkB mRNA和trkB蛋白以神经元内分布为主。脊髓损伤后,神经元的杂交和组化反应都明显增强,特别是神经纤维内的反应,不但反应颗粒堆积得越来越致密,反应纤维的数量也越来越多。这种现象提示,在损伤刺激下,脊髓神经元和神经纤维不但增强了mRNA的转录,同时蛋白的合成也增加,以结合更多的神经营养因子来保护自身和维持再生。胚胎脊髓移植后,参加反应的神经元和神经纤维的数目进一步增加,反应程度也进一步增强,这似乎说明中枢神经组织有自我调整以适应环境的本能。至于笔者观察到胶质细胞呈trkB杂交和免疫组化反应阳性的现象,尚不能从移植修复机制角度做出满意解释,只能和Zhou等[4]用免疫组织化学技术观察到相同现象的看法一样,那就是神经系统内的胶质细胞也是一个利用BDNF来营养自身的细胞成分。由此笔者推想:脊髓损伤后胶质细胞的大量增生不仅仅是形成阻挡中枢神经再生的屏障,它们也以增加受体的形式与神经细胞争夺神经营养因子,从而形成中枢神经纤维再生很难成功的又一原因。
, 百拇医药
在定性观察基础上,也对原位分子杂交、斑点杂交和免疫细胞化学反应的trkB mRNA和trkB蛋白作了定量描述。结果显示,它们的反应强度及其变化情况与定性观察基本一致,与其配体BDNF mRNA的变化情况[6]也大致相符。这说明当成体哺乳动物脊髓遭受损伤后,不但神经营养因子的表达增强,受体的合成也增加。这种恰到好处的有机协调使得损伤脊髓的神经成分能够更有效的利用周围环境中,以及自身表达的神经营养因子,从而对损伤做出以再生为主的修复反应;当将胚胎脊髓植入损伤脊髓后,宿主神经成分又会从配体和受体两个方面来调整自身反应强度,以配合胚胎脊髓共同完成修复损伤脊髓的“任务”。
本课题受国家自然科学基金资助(No.39470715)
参考文献
[1]Philo J, Talvenheimo J, Wen J, et al. Interactions of neurotrophin-3 (NT-3), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and the NT-3. BDNF heterodimer with the extracelluarl domains of the trkB and trkC receptors. J Biol Chem, 1994, 26∶27806-27846.
, 百拇医药
[2]Wetmore C, Olson L. Neuronal and nonneuronal expression of neurotrophins and their receptors in sensory and sympathetic ganglia suggest new intercellular trophic interactions. J Comp Neurl, 1995, 353∶143-159.
[3]Dechant G, Biffo S, Okazawa H, et al. Expression and binding characteristic of the BDNF receptor chick trkB. Development, 1993, 119∶545-558.
[4]Zhou XF, Parada L, Soppet D, et al. Distribution of trkB tyrosine kinase immunoreactivity in the rat central nervous system. Brain Res, 1993, 622∶63-70.
[5]Middlemas DS, Lindberg RA, Hunter T. trkB, a neural receptor protein-tyrosine kinase: Evidence for a full-length and two truncated receptors. Mol Cell Biol, 1991, 11∶143-153.
[6]李兵仓,王正国,朱佩芳,等.BDNF mRNA在胚胎脊髓修复成鼠损伤脊髓过程中的表达变化.中华医学杂志, 1997, 77∶516-520.
(收稿:1997-12-18 修回:1998-06-15), 百拇医药