食管癌贲门癌组织中多药耐药基因表达的初步研究
作者：张敏 丛娟 李建民 马炎炎 王春利 张少云
单位：山西省肿瘤医院(030013) 张敏 丛娟 李建民 马炎炎 王春利 张少云
关键词：
临床研究
化疗是食管癌、贲门癌综合治疗中的重要组成部分。但是，食管癌和贲门癌一般对化疗药物相对不敏感，化疗只起一定的辅助作用，单纯化疗很难达到完全缓解， 更难根治〔1，2〕。是否是由于食管癌贲门癌的肿瘤细胞具有耐药性?因为肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗难以取得预期效果的重要因素之一〔3〕。 因此，对食管癌贲门癌的耐药性进行检测对指导临床判断治疗效果有重要的临床价值。本文对未行化疗的食管癌和贲门癌新鲜组织中多药耐药基因(MDR-1)的表达情况及其与临床病理指标的关系进行了研究， 现将结果报告如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 检测对象42例食管鳞癌， 58例贲门腺癌为我院胸外科1997年5月-1998年5月手术切除的新鲜标本，术前均未行其他治疗。其中男性68例，女性32例，年龄45岁～74岁，平均64.2岁。食管癌病例按1987年UICCTNM标准分期，贲门癌按1985年UICC胃癌TNM标准分期。
1.2 方法
1.2.1 仪器：USAMJResearch公司产PTC-150型扩增仪， TGL高速离心机、IF紫外线透射观察分析仪，(上海康化生物仪器厂)， RT-PCR检测试剂盒购自北京天象人生物工程公司。
1.2.2 总RNA的提取：取3mg癌组织匀浆加100μl生理盐水悬浮，取25μl加100μl裂解液A，充分振荡，再加入裂解液B100μl与50μl氯仿，充分混匀。15000r/min离心10min，小心吸取上清50μl，加60μl预冷-20℃的异丙醇混合10s，15000r/min，5min，弃上清，80%乙醇离心洗涤一次弃上清，室温干燥。
, 百拇医药
1.2.3 扩增反应：向处理好的样本管中加入20μlMDRRTmix和1μlEmix混合均匀，离心数秒，加两滴石腊油，42℃保温30min，按94℃45s， 55℃45s，72℃45s，扩增35个循环。
1.2.4 电泳鉴定：5ml50×TAE稀释至250ml，0.4g琼脂糖加20mll×TAE熔化制胶， 取10μl扩增产物加于2%的琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 结果记录及判断：紫外线透射分析仪下观察， 阳性结果为同时出现两条带，分别为548bp(内标带)和167bp(MDR-1基因扩增带)。 拍照后，将底片置密扫描仪下分析，以两条带的积分光密度比值反映MDR-1基因的相对表达，即MDR-1/内标<0.1时为阴性。
1.2.6 计算全部MDR1基因的阳性表达率：以临床TNM指标分组记录各组表达情况，比较各组组内表达的差异。
, 百拇医药
1.2.7 统计学处理：采用χ2检验。
2 结果
2.1 由表1可以看出，食管鳞癌组织中MDR-1基因阳性表达为35.71%， 贲门腺癌组织中MDR-1基因阳性表达为31.03%，均表现为内在性耐药。
表1 MDR-1基因在食管癌、贲门癌中的表达
组别
例数
MDR-1
阳性例数%
食管癌
42
, 百拇医药
15
35.71
贲门癌
58
18
31.03
2.2 由表2可以看出，食管鳞癌原发肿瘤(T)不同分级间、区域淋巴结(N)不同分级间和食管癌TNM分期间MDR-1基因的阳性表达率，经统计学处理，各组间的差异无显著性意义(χ2值分别为0.3906，0.079，0.32，P值均大于0.05)。
表2 MDR-1基因在食管癌中的表达
临床病理指标
例数
, 百拇医药
MDR-1
阳性例数%
肿瘤大小T1
4
1
25
T2
16
6
37.5
T3
20
7
, http://www.100md.com
35
T4
2
1
50
淋巴结转移N0
8
3
37.5
N1
34
12
35.3
, 百拇医药
病期Ⅱa
12
4
33.3
Ⅲb
20
8
40
Ⅲ
10
3
30
2.3 由表3可以看出，贲门腺癌原发肿瘤(T)不同分级间、区域淋巴结(N)不同分级间和贲门癌的TNM病期间MDR-1基因的阳性表达率，经统计学处理，各组间的差异无显著性意义(χ2值分别为4.88，0.672，0.08，P值均大于0.05)。
, 百拇医药
表3 MDR-1基因在贲门癌中的表达
临床病理指标
例数
MDR-1
阳性例数%
肿瘤大小T2
18
5
27.77
T3
30
10
, http://www.100md.com
33.33
T4
10
3
30
淋巴结转移N0
8
2
25
N1
28
10
35.37
, 百拇医药
N2
22
6
27.27
病期Ⅰb
3
1
33
Ⅱ
11
4
36.36
Ⅲ
, http://www.100md.com
35
11
31.43
Ⅳ
7
2
28.57
3 讨论
多药耐药(multidrugresistance，MDR)的产生是导致肿瘤产生耐药和化疗失败的原因之一。现认为MDR发生的机制比较复杂，其中MDR-1基因及其编码的跨膜转运糖蛋白(p-gp)的过度表达是主要机制之一。p-gp是一个依赖能量的跨膜药物外排泵〔4〕，可降低细胞毒药物在细胞的积累，从而解除药物对其本身的杀伤。 目前研究MDR的手段常在蛋白与mRNA两个水平。检测方法主要有免疫组化法、分子杂交技术和RT-PCR法，多种方法比较，RT-PCR具有样品量少、专一性强、灵敏度高，可定量检测并重复性好的特点，因此，临床上应用广泛。
, 百拇医药
肿瘤细胞的耐药性可以存在于化疗之前，即内在性耐药，也可以在化疗中产生，即获得性耐药〔5〕。过去认为MDR是一种获得性耐药， 是多次反复化疗后药物诱发的结果。随着对MDR的深入研究，有学者对此观点提出疑问〔6〕。 我们对未行化疗药物治疗的食管癌贲门癌患者的MDR-1基因进行检测，发现其MDR-1基因阳性表达分别为35.71%和31.03%，表明食管癌和贲门癌患者中有部分存在内在性耐药。 这与临床上食管癌贲门癌化疗效果欠佳，化疗只起一定辅助作用〔1，2〕的表现是一致的。 因此，在食管癌和贲门癌的综合治疗中仍应强调手术的作用，同时合理制定化疗方案，包括选择化疗药物的种类、剂量和应用时机。 可能的话，还应选用合适的已被临床证明有效的MDR-1基因逆转剂或p-gp阻断剂进行联合应用，使化疗发挥更有效的作用。
许多学者认为，肿瘤细胞MDR-1的过度表达是癌细胞生物学行为恶化标志， 常伴随病情的发展或肿瘤的复发转移导致预后不良〔7，8〕。 本研究通过对食管癌和贲门癌临床病理指标与MDR-1基因阳性表达的对比， 发现原发肿瘤的大小、淋巴结转移程度和不同病期间的MDR-1基因阳性表达各组间无显著性差异。 肿瘤的复发转移病情的发展，可能是由于肿瘤细胞的耐药性使化疗药物对肿瘤不起作用导致化疗失败而引起的。因此，合理化疗并配合中医药和免疫治疗很有必要。 MDR-1能否作为食管癌、贲门癌肿瘤细胞生物学行为恶化的指标判断预后，需要作进一步的随访和临床研究。
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参考文献
1 李振主编恶性肿瘤的化学治疗与免疫治疗北京：人民卫生出版社，1990.295～296
2 李善启，张秀荣主编胃癌的化学治疗北京：中国医药科技出版社，1995.2～4
3 NooterK,HerweijerH.BrJCancer，1991,63:663～665
4 AwqatiQAScience,1995,269(1):805～806
5孙晓东，钟雪云，陈运贤肿瘤防治研究，1997，24(4)：255～258
6 高秀华，张晓辉，鹿育晋等白血病，1997，6(2)：77～78
7 MarieJP，LittounR,SikJBlood，1991,78:586～588
8 GottesmanMM.CancerRes,1993,53:747～751
收稿日期：(1998-10-12)
作者简介：张敏，男，1963年12月生，主治医师，山西省肿瘤医院，030013, 百拇医药
单位：山西省肿瘤医院(030013) 张敏 丛娟 李建民 马炎炎 王春利 张少云
关键词：
临床研究
化疗是食管癌、贲门癌综合治疗中的重要组成部分。但是，食管癌和贲门癌一般对化疗药物相对不敏感，化疗只起一定的辅助作用，单纯化疗很难达到完全缓解， 更难根治〔1，2〕。是否是由于食管癌贲门癌的肿瘤细胞具有耐药性?因为肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗难以取得预期效果的重要因素之一〔3〕。 因此，对食管癌贲门癌的耐药性进行检测对指导临床判断治疗效果有重要的临床价值。本文对未行化疗的食管癌和贲门癌新鲜组织中多药耐药基因(MDR-1)的表达情况及其与临床病理指标的关系进行了研究， 现将结果报告如下。
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1 资料与方法
1.1 检测对象42例食管鳞癌， 58例贲门腺癌为我院胸外科1997年5月-1998年5月手术切除的新鲜标本，术前均未行其他治疗。其中男性68例，女性32例，年龄45岁～74岁，平均64.2岁。食管癌病例按1987年UICCTNM标准分期，贲门癌按1985年UICC胃癌TNM标准分期。
1.2 方法
1.2.1 仪器：USAMJResearch公司产PTC-150型扩增仪， TGL高速离心机、IF紫外线透射观察分析仪，(上海康化生物仪器厂)， RT-PCR检测试剂盒购自北京天象人生物工程公司。
1.2.2 总RNA的提取：取3mg癌组织匀浆加100μl生理盐水悬浮，取25μl加100μl裂解液A，充分振荡，再加入裂解液B100μl与50μl氯仿，充分混匀。15000r/min离心10min，小心吸取上清50μl，加60μl预冷-20℃的异丙醇混合10s，15000r/min，5min，弃上清，80%乙醇离心洗涤一次弃上清，室温干燥。
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1.2.3 扩增反应：向处理好的样本管中加入20μlMDRRTmix和1μlEmix混合均匀，离心数秒，加两滴石腊油，42℃保温30min，按94℃45s， 55℃45s，72℃45s，扩增35个循环。
1.2.4 电泳鉴定：5ml50×TAE稀释至250ml，0.4g琼脂糖加20mll×TAE熔化制胶， 取10μl扩增产物加于2%的琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 结果记录及判断：紫外线透射分析仪下观察， 阳性结果为同时出现两条带，分别为548bp(内标带)和167bp(MDR-1基因扩增带)。 拍照后，将底片置密扫描仪下分析，以两条带的积分光密度比值反映MDR-1基因的相对表达，即MDR-1/内标<0.1时为阴性。
1.2.6 计算全部MDR1基因的阳性表达率：以临床TNM指标分组记录各组表达情况，比较各组组内表达的差异。
, 百拇医药
1.2.7 统计学处理：采用χ2检验。
2 结果
2.1 由表1可以看出，食管鳞癌组织中MDR-1基因阳性表达为35.71%， 贲门腺癌组织中MDR-1基因阳性表达为31.03%，均表现为内在性耐药。
表1 MDR-1基因在食管癌、贲门癌中的表达
组别
例数
MDR-1
阳性例数%
食管癌
42
, 百拇医药
15
35.71
贲门癌
58
18
31.03
2.2 由表2可以看出，食管鳞癌原发肿瘤(T)不同分级间、区域淋巴结(N)不同分级间和食管癌TNM分期间MDR-1基因的阳性表达率，经统计学处理，各组间的差异无显著性意义(χ2值分别为0.3906，0.079，0.32，P值均大于0.05)。
表2 MDR-1基因在食管癌中的表达
临床病理指标
例数
, 百拇医药
MDR-1
阳性例数%
肿瘤大小T1
4
1
25
T2
16
6
37.5
T3
20
7
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35
T4
2
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50
淋巴结转移N0
8
3
37.5
N1
34
12
35.3
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病期Ⅱa
12
4
33.3
Ⅲb
20
8
40
Ⅲ
10
3
30
2.3 由表3可以看出，贲门腺癌原发肿瘤(T)不同分级间、区域淋巴结(N)不同分级间和贲门癌的TNM病期间MDR-1基因的阳性表达率，经统计学处理，各组间的差异无显著性意义(χ2值分别为4.88，0.672，0.08，P值均大于0.05)。
, 百拇医药
表3 MDR-1基因在贲门癌中的表达
临床病理指标
例数
MDR-1
阳性例数%
肿瘤大小T2
18
5
27.77
T3
30
10
, http://www.100md.com
33.33
T4
10
3
30
淋巴结转移N0
8
2
25
N1
28
10
35.37
, 百拇医药
N2
22
6
27.27
病期Ⅰb
3
1
33
Ⅱ
11
4
36.36
Ⅲ
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35
11
31.43
Ⅳ
7
2
28.57
3 讨论
多药耐药(multidrugresistance，MDR)的产生是导致肿瘤产生耐药和化疗失败的原因之一。现认为MDR发生的机制比较复杂，其中MDR-1基因及其编码的跨膜转运糖蛋白(p-gp)的过度表达是主要机制之一。p-gp是一个依赖能量的跨膜药物外排泵〔4〕，可降低细胞毒药物在细胞的积累，从而解除药物对其本身的杀伤。 目前研究MDR的手段常在蛋白与mRNA两个水平。检测方法主要有免疫组化法、分子杂交技术和RT-PCR法，多种方法比较，RT-PCR具有样品量少、专一性强、灵敏度高，可定量检测并重复性好的特点，因此，临床上应用广泛。
, 百拇医药
肿瘤细胞的耐药性可以存在于化疗之前，即内在性耐药，也可以在化疗中产生，即获得性耐药〔5〕。过去认为MDR是一种获得性耐药， 是多次反复化疗后药物诱发的结果。随着对MDR的深入研究，有学者对此观点提出疑问〔6〕。 我们对未行化疗药物治疗的食管癌贲门癌患者的MDR-1基因进行检测，发现其MDR-1基因阳性表达分别为35.71%和31.03%，表明食管癌和贲门癌患者中有部分存在内在性耐药。 这与临床上食管癌贲门癌化疗效果欠佳，化疗只起一定辅助作用〔1，2〕的表现是一致的。 因此，在食管癌和贲门癌的综合治疗中仍应强调手术的作用，同时合理制定化疗方案，包括选择化疗药物的种类、剂量和应用时机。 可能的话，还应选用合适的已被临床证明有效的MDR-1基因逆转剂或p-gp阻断剂进行联合应用，使化疗发挥更有效的作用。
许多学者认为，肿瘤细胞MDR-1的过度表达是癌细胞生物学行为恶化标志， 常伴随病情的发展或肿瘤的复发转移导致预后不良〔7，8〕。 本研究通过对食管癌和贲门癌临床病理指标与MDR-1基因阳性表达的对比， 发现原发肿瘤的大小、淋巴结转移程度和不同病期间的MDR-1基因阳性表达各组间无显著性差异。 肿瘤的复发转移病情的发展，可能是由于肿瘤细胞的耐药性使化疗药物对肿瘤不起作用导致化疗失败而引起的。因此，合理化疗并配合中医药和免疫治疗很有必要。 MDR-1能否作为食管癌、贲门癌肿瘤细胞生物学行为恶化的指标判断预后，需要作进一步的随访和临床研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 李振主编恶性肿瘤的化学治疗与免疫治疗北京：人民卫生出版社，1990.295～296
2 李善启，张秀荣主编胃癌的化学治疗北京：中国医药科技出版社，1995.2～4
3 NooterK,HerweijerH.BrJCancer，1991,63:663～665
4 AwqatiQAScience,1995,269(1):805～806
5孙晓东，钟雪云，陈运贤肿瘤防治研究，1997，24(4)：255～258
6 高秀华，张晓辉，鹿育晋等白血病，1997，6(2)：77～78
7 MarieJP，LittounR,SikJBlood，1991,78:586～588
8 GottesmanMM.CancerRes,1993,53:747～751
收稿日期：(1998-10-12)
作者简介：张敏，男，1963年12月生，主治医师，山西省肿瘤医院，030013, 百拇医药