胃癌p53蛋白与PCNA的免疫组织化学研究
作者：常红霞 李亮成
单位：常红霞(山西省肿瘤医院 030013)；李亮成(山西省肿瘤医院 030013)
关键词：胃癌；p53蛋白；免疫组织化学；增殖细胞核抗原
山西医药杂志000105 摘 要：目的 探讨p53蛋白及PCNA与胃癌发生、发展的关系。方法 对39例进展期胃癌手术标本的肉眼可见的肿瘤组织、癌旁2 cm处及切缘“正常” 组织进行p53蛋白及PCNA免疫组化检则。结果 切缘“正常”组织、癌旁及 胃癌组织均有不同程度p53蛋白和PCNA的表达，p53阳性率逐渐升高，分别为10.3%(4/39)、 28.2%(11/39)及59.0%(23/39)，PCNA分级也逐渐升高，与p53呈正相关(P<0.05 )。p53蛋白表达与肿瘤的浸润深度、血管和淋巴管浸润及淋巴结转移有关，p 53蛋白阳性的胃癌，其细胞增殖活性明显高于阴性者。结论 p53蛋白检测 有助于胃粘膜癌变倾向的判断和胃癌的早期诊断，对癌前病变的研究和手术切缘的评估有一 定意义。联合检测p53和PCNA对胃癌恶性程度的判断有较高的价值。
, 百拇医药
Immunohistochemical study of p53 protein and PCNA in gastric carcinoma
Chang Hongxia,Li Liangcheng
(Shanxi Tumor Hospital,Tai yuan,030013,China)
Abstract：Objective To evaluate the significance of p53 p rotein and PCNA in occurrence and development of gastric cancer.Methods [ WTBZ]The expression of p53 and PCNA was detected immunohistochemically in 39 sur gically resected specimens including gastric carcinoma paired with its nearby pe riphery and “normal”gastric tissues.Results The positive rate of p53 immunoreactivity was 10.3%(4/39),28.2%(11/39) and 59.0%(23/39) respectively in “normal”gastric tissues,n earby periphery and gastric carcinoma.The expression of PCNA was correlated with p53 (P<0.05).The lever of p53 was correlated with the dep th of invasion and lymphnode metastasis.Conclusion Determination of p53 immunohistochemically might be useful in early diagnosis,precarcinomatous s tudy and estimating surgically resected range of gastric cancer.p53 protein assa y combined with PCNA is significant for predicting vicious extent of gastric can cer.
, 百拇医药
Key words：Gastric carcinoma； p53 protein； Immunohisto chemistry； Proliferating cell nuclear antigen
野生型p53(wild type p53,WT p53)基因是肿瘤的抑制基因之一，当发生缺失或突变后可促使细胞无限制地生长，是肿瘤增生异常活跃的因素之一，对肿瘤的发生发展起重要的作用。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为一个内源性增殖细胞的标志物，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用，与胃癌组织的增长活性、胃癌的转移及预后关系密切。我们采用免疫组化法对胃癌p53蛋白的表达水平进行了分析，并同时检测了PCNA，以探讨p53蛋白和PCNA与胃癌发生、发展的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 标本：41例胃癌组织材料取自我院1997年5月至12月之手术标本。每一标本同时在肉眼可见的肿瘤组织、癌旁2 cm处及切缘“正常”组织取材三块，常规10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片5张，1张HE染色，4张免疫组化备染。根据全国胃癌协作组所制定的规范和TNM国际分期法进行详细病理学检查。
1.1.2 临床资料：41例中，除2例病理证实一侧切缘有残癌剔除外，39例用于研究。其中男性32例，女性7例，年龄40～73岁，平均58.4岁，所有病例术前均未进行化疗及放疗，全部为进展期胃癌。TNM分期：Ⅱ期14例，Ⅲa期12例，Ⅲb期8例，Ⅳ期5例。肿瘤与周围组织粘连14例，腹膜种植4例，淋巴结转移26例，肝转移1例。
1.2 主要试剂
鼠抗人p53单克隆抗体DO-7、鼠抗PCNA单克隆抗体OC-10及LSAB试剂盒均为DAKO公司产品， 购于上海基因有限公司。
, 百拇医药
1.3 方法
p53和PCNA表达的检测用LSAB免疫组化法。Ⅰ抗的工作浓度均为1∶100，Ⅱ抗、Ⅲ抗的工作浓度均为1∶400。
1.3.1 步骤：将每例标本的连续切片4张分别贴附在粘附剂处理的玻片上，2张用做p53和 PCNA免疫组化染色，2张用做空白对照。将切片置于盛有加热沸腾的0.4%柠檬酸缓冲液的高 压锅中，加阀煮沸2 min，以去除因甲醛固定和石蜡包埋对细胞核内p53抗原及PCNA造成的封 闭作用，从而提高检出率。在3%过氧化氢中孵育5 min，以消除内源性过氧化物酶活性。两 张切片分别滴加p53和PCNAⅠ抗，另两张滴加TBS液，室温下孵育30 min，然后滴加生物素标 记的兔抗鼠免疫球蛋白，室温下孵育30 min。再滴加结合有过氧化物酶的链球菌卵白素，室 温下孵育30 min。以上各步骤均以TBS液冲洗。最后滴加DAB显色液，镜下控制显色时间。蒸 馏水冲洗，终止反应。苏木素复染，逐级脱水，透明封片。
, 百拇医药
1.3.2 对照：以TBS置换Ⅰ抗作空白对照，已知阳性p53和PCNA胃癌切片作阳性对照。
1.3.3 结果判定：p53以细胞核呈清晰棕色为阳性，单纯细胞质着色或细胞核细胞质均无 着色为阴性。阳性病例又按切片中阳性细胞所占的百分比分为：(+)<25%，(
)25%～50%， (
)>50%。细胞增殖活性PCNA的定级：PCNA阳性着色表现为细胞核染成棕褐色，着色分布 不均，观察5个有代表性的高倍视野，计数每个高倍视野内100个肿瘤细胞中阳性细胞数，取 其平均值。分为Ⅰ～Ⅳ级，0～25%为Ⅰ级，26%～50%为Ⅱ级，51%～75%为Ⅲ级，>76%为Ⅳ 级。
1.4 统计学处理
采用χ2检验、非独立分割χ2检验和Spearman等级相关分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 p53、PCNA在胃癌组织中的表达
p53和PCNA在胃癌组织的表达明显高于癌旁组织和“正常”组(P<0.01)，在癌旁 组的表达高于“正常”组(P<0.05)，但在癌旁的轻、中度异型增生组间及“ 正常”组的正常粘膜与炎症上皮组间的表达无明显差异，见表1。p53染色局限于细胞核内， 细胞膜、细胞质不着色。PCNA也局限于细胞核内。在正常胃粘膜中，PCNA阳性细胞局限在腺 体下2/3区域，上部及上皮表面无PCNA表达，而在胃癌中，PCNA阳性细胞弥散分布。
表1 p53、PCNA在胃癌组织中的表达 组别
例
数
p53表达
, 百拇医药
PCNA
-
+
阳性率
(%)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
%1)
胃癌组
, http://www.100md.com
39
16
14
9
0
59.02)
6
8
12
13
64.12)
癌旁组
39
, 百拇医药
28
9
2
0
28.23)
20
8
8
3
28.23)
轻度异型增生
11
10
, http://www.100md.com
1
0
0
9.1
7
3
1
0
9.1
中度异型增生
28
18
6
4
, 百拇医药
0
35.7
13
5
7
3
35.7
“正常组”
39
35
4
0
0
10.33)
, http://www.100md.com
29
6
4
0
10.33)
正常粘膜
5
5
0
0
0
0.0
5
, 百拇医药 0
0
0
0.0
炎症上皮
34
30
2
2
0
11.8
24
6
4
, 百拇医药
0
11.8
1) PCNAⅢ+Ⅳ的百分率。
2) 癌与癌旁及正常P<0.01。
3) 正常组与癌旁组P<0.05。
2.2 p53表达与临床病理特征的关系
从第13页表2～3中可见，p53表达与胃癌患者的性别、年龄、胃癌的部位、大体病理分型及 组织学分型无关。但与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移有关。第13页表4表明，1例肝转移以及 4例腹膜种植中的3例均有p53表达，但统计学上无差异。从第13页表5可见，有淋巴管及血管 内癌栓组p53表达明显高于无癌栓组。
表2 p53表达与临床病理特征关系 病理临床因素
, 百拇医药
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
性别
男
32
13
11
, 百拇医药
8
0
59.4
>0.0 5
女
7
3
3
1
0
57.1
年龄(岁)
<60
21
, http://www.100md.com
10
8
3
0
52.4
>0.05
≥60
18
6
6
6
0
66.7
部位
, 百拇医药
贲门
23
10
8
5
0
56.5
>0.05
胃体
5
2
2
1
0
, 百拇医药
60.0
胃窦
11
4
4
3
0
63.6
大体分型
溃疡型
28
12
11
5
, 百拇医药
0
57.1
> 0.05
浸润型
7
2
2
3
0
71.4
蕈伞型
4
2
1
, http://www.100md.com
1
0
50.0
Borrman分型
Ⅰ型
3
2
1
0
0
33.3
>0 .05
Ⅱ型
, 百拇医药 28
13
11
4
0
53.6
Ⅲ型
4
1
1
2
0
75.0
Ⅳ型
, http://www.100md.com
4
0
1
3
0
100.0
Ming′s分型
膨胀型
5
2
2
1
0
60.0
, http://www.100md.com
>0.05
浸润型
20
6
8
6
0
70.0
混合型
14
8
4
2
0
, 百拇医药
42.9
浸润深度
pT1
0
0
0
0
0
0.0
pT2
6
5
1
, http://www.100md.com
0
0
16.7
pT3
17
8
7
2
0
52.9
<0.051)
pT4
16
, 百拇医药
3
6
7
0
81.3
<0.011)
淋巴结转移
N0
13
9
3
1
0
, 百拇医药
30.8
N1
21
7
9
5
0
66.7
<0.052)
N2
3
0
1
, 百拇医药
2
0
100.0
<0.05 2)
N3
2
0
1
1
0
100.0
1) pT2分别与pT3、pT4之间的比较。
, http://www.100md.com
2) N0分别与N1、N2之间的比较。
表3 p53表达与组织学的关系 组织学分型
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
管状腺癌
, 百拇医药
17
8
6
3
0
52.9
乳头状腺癌
2
2
0
0
0
0.0
低分化腺癌
, 百拇医药
12
3
5
4
0
75.0
>0.05
粘液腺癌
5
2
2
1
0
60.0
, http://www.100md.com
印戒细胞癌
2
0
1
1
0
100.0
鳞腺癌
1
1
0
0
0
0.0
, 百拇医药
表4 p53表达与腹膜种植及肝转移的关系 播散情况
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
腹膜种植 P0
35
15
13
, 百拇医药
7
0
57.1
P1
3
1
1
1
0
66.7
>0.05
P2
1
, http://www.100md.com
0
0
1
0
100.0
肝转移H0
38
16
14
8
0
37.9
H1
, 百拇医药
0
0
0
0
0
0.0
>0.05
H2
1
0
0
1
0
100.0
, http://www.100md.com
表5 p53表达与癌栓的关系 癌栓部位
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
淋巴管内癌栓
有
26
, 百拇医药 7
11
8
0
73.1
<0.05
无
13
9
3
1
0
30.8
血管内癌栓
, 百拇医药
有
22
5
11
6
0
77.3
<0.05
无
17
11
3
3
0
, 百拇医药
35.3
2.3 p53表达与PCNA的关系
由第13页表6可见，p53阳性表达组，细胞增殖极为活跃，p53与PCNA呈明显正相关( P<0.05)。
表6 p53表达与PCNA分级的关系 p53
例数
PCNA分级
r′s
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
, 百拇医药
-
16
5
5
5
1
+
14
1
2
6
5
0.392 01)
, 百拇医药
9
0
1
1
7
1) 等级相关分析 P<0.05。
3 讨 论
肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，有多个癌基因和抑癌基因的变异参与了过程的不同阶段。而p53基因突变被认为是各类肿瘤中最常 见的基因事件，是多种恶性肿瘤发生和进展的原因之一。
p53基因由11个外显子和10个内含子组成，定位于人的17P染色体，全长16～20 kb，编码分子量为53 000的核磷酸蛋白。正常的p53基因为野生型(wild type)，而发生变异者为突变型(mutant type)。在正常细胞中，野生型p53基因一方面参与细胞周期的调控，阻止细胞从G 1期进入S期，对细胞分裂和增殖起负调节作用，另一方面能够诱导细胞出现凋亡(apoptos is)，可与多种癌基因和生长因子协同调节细胞凋亡，被认为是一种抑癌基因。已发现p53象 一个“分子警察”那样监督着细胞DNA的完整性。当DNA受损时，野生型p53诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直到DNA修复。如果损伤不能被修复，p53就诱化那些诱导凋亡的基因转录，使细胞进入凋亡状态，阻止其向恶性转化。当p53基因发生缺失或异常时，p53失去对细胞的监视作用，带着损伤的DNA进入S期，其结果是细胞因遗传不稳定性而产生突变和染色体畸变。突变型p53基因不但丧失了抑癌活性，反而具有促进恶性转化的功能，因此，由抑癌基因转为原癌基因。由于正常细胞中野生型p53蛋白半衰期短，约3 h，代谢不稳定以及含量低，故应用常规的免疫组化方法一般难以测出。当p53基因突变后，蛋白的构象发生了改变，同时也可和野生型p53蛋白结合，半衰期明显延长，在恶性细胞中堆积并能够被检测出来[1]。因此认为，应用免疫组化法检测出的p53蛋白均为突变型，检测阳性即提示 突变型p53基因存在。
, 百拇医药
关于p53基因在胃癌中的意义，Rugge等 [2]研究发现，胃癌轻、中、重度异型增生中皆有阳性表达，重度异型增生时，p53 阳性率等同于胃癌。Joypaul等[3]不仅发现异型增生组织中有p53突变和表达，还进一步以PCR-SSCP及DNA测序方法，显示出55.3%癌旁肠化已有p53基因突变，本研究对39例胃癌、癌旁及切缘“正常组织”p53蛋白进行了检测，其阳性率分别为59.0%(23/39)、28.2%(11/39)和10.3%(4/39)，其中癌旁组织中轻度、中度异型增生阳性率分别为9.1%和35.7%。本研究结果与这些报道表明，p53突变及其表达发生于胃癌形成的早期阶段，对胃癌的发生，即胃粘膜癌变可能起关键作用。因此，p53表达的检测，有助于对胃粘膜癌变倾向的判断和胃癌的早期诊断。此外，本研究中p53蛋白在癌旁组织和切缘“正常组织”的阳性表达，也说明这些可能已进入异常增生的恶性转化阶段，这对癌前病变的研究和手术切缘的评估有一定意义。
本研究发现，p53蛋白表达与胃癌浸润程度和淋巴结转移有相关关系，与Martin等[4] 报道一致，还发现有血管内癌栓和淋巴管癌栓组p53表达阳性明显高于无癌栓组，表明p5 3基因突变与胃癌浸润、转移密切相关，是肿瘤具有较强浸润性的标志之一。Vogelstein等 [5]认为p53基因失活可能是肿瘤进展期的标志，是一种晚期突变，这种晚期事件主 要与转移、不良预后有关。
, 百拇医药
增殖细胞核抗原(PCNA)是一种相对分子量为36 000的非组蛋白核内多肽，是DNA多聚酶delta 的辅助蛋白，合成于晚G1期和S期，对DNA复制起重要作用[6]，其含量反映了细 胞的增殖程度。目前已把它视为“S”期细胞的一个标记物。近年来的研究已揭示，野生型p 53蛋白序列特异地与DNA结合，诱导WAF1(wild type p53 activated fragment-1)基因产 物p21蛋白的生成，而p21蛋白则与PCNA结合，阻抑DNA多聚酶delta的功能，从而抑制DNA复制，突变型p53蛋白不具备这一生物学功能[7]。文献[8]对易感食管癌和贲门癌 的高危人群同时进行p53和PCNA的免疫组化研究表明，p53的表达从正常上皮到不典型增生、到胃癌呈明显上升趋势。这些变化与PCNA标记指数(PCNA labeling index,PCNA LI)的变化相平行，两者相关显著。PCNA LI是指计数1 000个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比。
, http://www.100md.com
本研究发现，p53蛋白表达阳性的胃癌其细胞增殖活性明显高于阴性者，表明突变型p53基因 缺乏野生型p53基因具有的对细胞增殖的负调控作用。已公认肿瘤细胞的增殖状态是反应肿 瘤恶性程度的重要指标之一。有资料表明[8]，PCNA LI显著增高与肿瘤的增长速度 、肝转移、腹膜转移以及淋巴结转移有关，与血管浸润有关。肿瘤细胞增殖活性的增加可能 导致肿瘤中多克隆亚群的发展，其中一些亚群有可能获得侵袭和转移能力[9]。因此，可以认为，p53蛋白表达阳性肿瘤PCNA的高表达，表明该肿瘤恶性程度较高。
总结本研究结果，得出如下结论：①突变型p53的检测有助于胃癌的早期诊断。②p53蛋白对癌前病变的研究和手术切缘的评估有一定意义。③联合检测p53和PCNA对胃癌恶性程度的判断有较高的价值。
参考文献：
[1] Leving AJ.The p53 tumor suppressor gene and products.Cancer Su rv,1992,12:59
, 百拇医药
[2] Rugge M,Shiao YH,Comrrea P,et al.Immunohistochemical evidence of p53 overexpression in gastric epithelial dysplasia.Cancer Epidemic Biomarkers Prev,1992,1:551
[3] Joypaul BV,Newman EL.Expression of p53 protein in normal,dypla stic，and malignant gastric mucosa:an immunohistochemical study.J Pathol,1993,17 0:279
[4] Martin HM,Flipe MI,Morris RW,et al.p53 expression and prognosi s in gastric carcinoma.Int J Cancer,1992,50:8
, http://www.100md.com
[5] Vogelstein B,Fearon ER,Hamilten SR,et al.Genetic alterations d uring colorectal-tumour development.N Engl J Med,1988,319:525
[6] Waseem NM,Lane DP.Monoclonal antibody analysis of the prolifer ating cell nuclear antigen (PCNA):structural conservation and the detection of a nucleolar form.J Cell Sci,1990,96:121
[7] Waga S,Hannon GJ,Beach D,et al.The p53 inhibitor of cyclin E d ependent kinases control DNA replication by interaction with PCNA.Nature,1994,57 :623
[8] 戴林.增殖细胞核抗原与胃癌.国外医学消化系疾病分册，1996，16： 3
[9] Ng IOI,Srivastava G,Chung LP,et al.Overexpression and point mu tation of p53 tumor suppressor gene in hepatocellular carcinomas in Hong Kong Ch inese people.Cancer,1994,74:30
收稿日期：1999-09-22, 百拇医药
单位：常红霞(山西省肿瘤医院 030013)；李亮成(山西省肿瘤医院 030013)
关键词：胃癌；p53蛋白；免疫组织化学；增殖细胞核抗原
山西医药杂志000105 摘 要：目的 探讨p53蛋白及PCNA与胃癌发生、发展的关系。方法 对39例进展期胃癌手术标本的肉眼可见的肿瘤组织、癌旁2 cm处及切缘“正常” 组织进行p53蛋白及PCNA免疫组化检则。结果 切缘“正常”组织、癌旁及 胃癌组织均有不同程度p53蛋白和PCNA的表达，p53阳性率逐渐升高，分别为10.3%(4/39)、 28.2%(11/39)及59.0%(23/39)，PCNA分级也逐渐升高，与p53呈正相关(P<0.05 )。p53蛋白表达与肿瘤的浸润深度、血管和淋巴管浸润及淋巴结转移有关，p 53蛋白阳性的胃癌，其细胞增殖活性明显高于阴性者。结论 p53蛋白检测 有助于胃粘膜癌变倾向的判断和胃癌的早期诊断，对癌前病变的研究和手术切缘的评估有一 定意义。联合检测p53和PCNA对胃癌恶性程度的判断有较高的价值。
, 百拇医药
Immunohistochemical study of p53 protein and PCNA in gastric carcinoma
Chang Hongxia,Li Liangcheng
(Shanxi Tumor Hospital,Tai yuan,030013,China)
Abstract：Objective To evaluate the significance of p53 p rotein and PCNA in occurrence and development of gastric cancer.Methods [ WTBZ]The expression of p53 and PCNA was detected immunohistochemically in 39 sur gically resected specimens including gastric carcinoma paired with its nearby pe riphery and “normal”gastric tissues.Results The positive rate of p53 immunoreactivity was 10.3%(4/39),28.2%(11/39) and 59.0%(23/39) respectively in “normal”gastric tissues,n earby periphery and gastric carcinoma.The expression of PCNA was correlated with p53 (P<0.05).The lever of p53 was correlated with the dep th of invasion and lymphnode metastasis.Conclusion Determination of p53 immunohistochemically might be useful in early diagnosis,precarcinomatous s tudy and estimating surgically resected range of gastric cancer.p53 protein assa y combined with PCNA is significant for predicting vicious extent of gastric can cer.
, 百拇医药
Key words：Gastric carcinoma； p53 protein； Immunohisto chemistry； Proliferating cell nuclear antigen
野生型p53(wild type p53,WT p53)基因是肿瘤的抑制基因之一，当发生缺失或突变后可促使细胞无限制地生长，是肿瘤增生异常活跃的因素之一，对肿瘤的发生发展起重要的作用。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为一个内源性增殖细胞的标志物，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用，与胃癌组织的增长活性、胃癌的转移及预后关系密切。我们采用免疫组化法对胃癌p53蛋白的表达水平进行了分析，并同时检测了PCNA，以探讨p53蛋白和PCNA与胃癌发生、发展的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 标本：41例胃癌组织材料取自我院1997年5月至12月之手术标本。每一标本同时在肉眼可见的肿瘤组织、癌旁2 cm处及切缘“正常”组织取材三块，常规10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片5张，1张HE染色，4张免疫组化备染。根据全国胃癌协作组所制定的规范和TNM国际分期法进行详细病理学检查。
1.1.2 临床资料：41例中，除2例病理证实一侧切缘有残癌剔除外，39例用于研究。其中男性32例，女性7例，年龄40～73岁，平均58.4岁，所有病例术前均未进行化疗及放疗，全部为进展期胃癌。TNM分期：Ⅱ期14例，Ⅲa期12例，Ⅲb期8例，Ⅳ期5例。肿瘤与周围组织粘连14例，腹膜种植4例，淋巴结转移26例，肝转移1例。
1.2 主要试剂
鼠抗人p53单克隆抗体DO-7、鼠抗PCNA单克隆抗体OC-10及LSAB试剂盒均为DAKO公司产品， 购于上海基因有限公司。
, 百拇医药
1.3 方法
p53和PCNA表达的检测用LSAB免疫组化法。Ⅰ抗的工作浓度均为1∶100，Ⅱ抗、Ⅲ抗的工作浓度均为1∶400。
1.3.1 步骤：将每例标本的连续切片4张分别贴附在粘附剂处理的玻片上，2张用做p53和 PCNA免疫组化染色，2张用做空白对照。将切片置于盛有加热沸腾的0.4%柠檬酸缓冲液的高 压锅中，加阀煮沸2 min，以去除因甲醛固定和石蜡包埋对细胞核内p53抗原及PCNA造成的封 闭作用，从而提高检出率。在3%过氧化氢中孵育5 min，以消除内源性过氧化物酶活性。两 张切片分别滴加p53和PCNAⅠ抗，另两张滴加TBS液，室温下孵育30 min，然后滴加生物素标 记的兔抗鼠免疫球蛋白，室温下孵育30 min。再滴加结合有过氧化物酶的链球菌卵白素，室 温下孵育30 min。以上各步骤均以TBS液冲洗。最后滴加DAB显色液，镜下控制显色时间。蒸 馏水冲洗，终止反应。苏木素复染，逐级脱水，透明封片。
, 百拇医药
1.3.2 对照：以TBS置换Ⅰ抗作空白对照，已知阳性p53和PCNA胃癌切片作阳性对照。
1.3.3 结果判定：p53以细胞核呈清晰棕色为阳性，单纯细胞质着色或细胞核细胞质均无 着色为阴性。阳性病例又按切片中阳性细胞所占的百分比分为：(+)<25%，(
)25%～50%， ()>50%。细胞增殖活性PCNA的定级：PCNA阳性着色表现为细胞核染成棕褐色，着色分布 不均，观察5个有代表性的高倍视野，计数每个高倍视野内100个肿瘤细胞中阳性细胞数，取 其平均值。分为Ⅰ～Ⅳ级，0～25%为Ⅰ级，26%～50%为Ⅱ级，51%～75%为Ⅲ级，>76%为Ⅳ 级。1.4 统计学处理
采用χ2检验、非独立分割χ2检验和Spearman等级相关分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 p53、PCNA在胃癌组织中的表达
p53和PCNA在胃癌组织的表达明显高于癌旁组织和“正常”组(P<0.01)，在癌旁 组的表达高于“正常”组(P<0.05)，但在癌旁的轻、中度异型增生组间及“ 正常”组的正常粘膜与炎症上皮组间的表达无明显差异，见表1。p53染色局限于细胞核内， 细胞膜、细胞质不着色。PCNA也局限于细胞核内。在正常胃粘膜中，PCNA阳性细胞局限在腺 体下2/3区域，上部及上皮表面无PCNA表达，而在胃癌中，PCNA阳性细胞弥散分布。
表1 p53、PCNA在胃癌组织中的表达 组别
例
数
p53表达
, 百拇医药
PCNA
-
+
阳性率
(%)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
%1)
胃癌组
, http://www.100md.com
39
16
14
9
0
59.02)
6
8
12
13
64.12)
癌旁组
39
, 百拇医药
28
9
2
0
28.23)
20
8
8
3
28.23)
轻度异型增生
11
10
, http://www.100md.com
1
0
0
9.1
7
3
1
0
9.1
中度异型增生
28
18
6
4
, 百拇医药
0
35.7
13
5
7
3
35.7
“正常组”
39
35
4
0
0
10.33)
, http://www.100md.com
29
6
4
0
10.33)
正常粘膜
5
5
0
0
0
0.0
5
, 百拇医药 0
0
0
0.0
炎症上皮
34
30
2
2
0
11.8
24
6
4
, 百拇医药
0
11.8
1) PCNAⅢ+Ⅳ的百分率。
2) 癌与癌旁及正常P<0.01。
3) 正常组与癌旁组P<0.05。
2.2 p53表达与临床病理特征的关系
从第13页表2～3中可见，p53表达与胃癌患者的性别、年龄、胃癌的部位、大体病理分型及 组织学分型无关。但与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移有关。第13页表4表明，1例肝转移以及 4例腹膜种植中的3例均有p53表达，但统计学上无差异。从第13页表5可见，有淋巴管及血管 内癌栓组p53表达明显高于无癌栓组。
表2 p53表达与临床病理特征关系 病理临床因素
, 百拇医药
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
性别
男
32
13
11
, 百拇医药
8
0
59.4
>0.0 5
女
7
3
3
1
0
57.1
年龄(岁)
<60
21
, http://www.100md.com
10
8
3
0
52.4
>0.05
≥60
18
6
6
6
0
66.7
部位
, 百拇医药
贲门
23
10
8
5
0
56.5
>0.05
胃体
5
2
2
1
0
, 百拇医药
60.0
胃窦
11
4
4
3
0
63.6
大体分型
溃疡型
28
12
11
5
, 百拇医药
0
57.1
> 0.05
浸润型
7
2
2
3
0
71.4
蕈伞型
4
2
1
, http://www.100md.com
1
0
50.0
Borrman分型
Ⅰ型
3
2
1
0
0
33.3
>0 .05
Ⅱ型
, 百拇医药 28
13
11
4
0
53.6
Ⅲ型
4
1
1
2
0
75.0
Ⅳ型
, http://www.100md.com
4
0
1
3
0
100.0
Ming′s分型
膨胀型
5
2
2
1
0
60.0
, http://www.100md.com
>0.05
浸润型
20
6
8
6
0
70.0
混合型
14
8
4
2
0
, 百拇医药
42.9
浸润深度
pT1
0
0
0
0
0
0.0
pT2
6
5
1
, http://www.100md.com
0
0
16.7
pT3
17
8
7
2
0
52.9
<0.051)
pT4
16
, 百拇医药
3
6
7
0
81.3
<0.011)
淋巴结转移
N0
13
9
3
1
0
, 百拇医药
30.8
N1
21
7
9
5
0
66.7
<0.052)
N2
3
0
1
, 百拇医药
2
0
100.0
<0.05 2)
N3
2
0
1
1
0
100.0
1) pT2分别与pT3、pT4之间的比较。
, http://www.100md.com
2) N0分别与N1、N2之间的比较。
表3 p53表达与组织学的关系 组织学分型
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
管状腺癌
, 百拇医药
17
8
6
3
0
52.9
乳头状腺癌
2
2
0
0
0
0.0
低分化腺癌
, 百拇医药
12
3
5
4
0
75.0
>0.05
粘液腺癌
5
2
2
1
0
60.0
, http://www.100md.com
印戒细胞癌
2
0
1
1
0
100.0
鳞腺癌
1
1
0
0
0
0.0
, 百拇医药
表4 p53表达与腹膜种植及肝转移的关系 播散情况
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
腹膜种植 P0
35
15
13
, 百拇医药
7
0
57.1
P1
3
1
1
1
0
66.7
>0.05
P2
1
, http://www.100md.com
0
0
1
0
100.0
肝转移H0
38
16
14
8
0
37.9
H1
, 百拇医药
0
0
0
0
0
0.0
>0.05
H2
1
0
0
1
0
100.0
, http://www.100md.com
表5 p53表达与癌栓的关系 癌栓部位
例数
p53表达
P值
-
+
阳性率(%)
淋巴管内癌栓
有
26
, 百拇医药 7
11
8
0
73.1
<0.05
无
13
9
3
1
0
30.8
血管内癌栓
, 百拇医药
有
22
5
11
6
0
77.3
<0.05
无
17
11
3
3
0
, 百拇医药
35.3
2.3 p53表达与PCNA的关系
由第13页表6可见，p53阳性表达组，细胞增殖极为活跃，p53与PCNA呈明显正相关( P<0.05)。
表6 p53表达与PCNA分级的关系 p53
例数
PCNA分级
r′s
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
, 百拇医药
-
16
5
5
5
1
+
14
1
2
6
5
0.392 01)
, 百拇医药
9
0
1
1
7
1) 等级相关分析 P<0.05。
3 讨 论
肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，有多个癌基因和抑癌基因的变异参与了过程的不同阶段。而p53基因突变被认为是各类肿瘤中最常 见的基因事件，是多种恶性肿瘤发生和进展的原因之一。
p53基因由11个外显子和10个内含子组成，定位于人的17P染色体，全长16～20 kb，编码分子量为53 000的核磷酸蛋白。正常的p53基因为野生型(wild type)，而发生变异者为突变型(mutant type)。在正常细胞中，野生型p53基因一方面参与细胞周期的调控，阻止细胞从G 1期进入S期，对细胞分裂和增殖起负调节作用，另一方面能够诱导细胞出现凋亡(apoptos is)，可与多种癌基因和生长因子协同调节细胞凋亡，被认为是一种抑癌基因。已发现p53象 一个“分子警察”那样监督着细胞DNA的完整性。当DNA受损时，野生型p53诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直到DNA修复。如果损伤不能被修复，p53就诱化那些诱导凋亡的基因转录，使细胞进入凋亡状态，阻止其向恶性转化。当p53基因发生缺失或异常时，p53失去对细胞的监视作用，带着损伤的DNA进入S期，其结果是细胞因遗传不稳定性而产生突变和染色体畸变。突变型p53基因不但丧失了抑癌活性，反而具有促进恶性转化的功能，因此，由抑癌基因转为原癌基因。由于正常细胞中野生型p53蛋白半衰期短，约3 h，代谢不稳定以及含量低，故应用常规的免疫组化方法一般难以测出。当p53基因突变后，蛋白的构象发生了改变，同时也可和野生型p53蛋白结合，半衰期明显延长，在恶性细胞中堆积并能够被检测出来[1]。因此认为，应用免疫组化法检测出的p53蛋白均为突变型，检测阳性即提示 突变型p53基因存在。
, 百拇医药
关于p53基因在胃癌中的意义，Rugge等 [2]研究发现，胃癌轻、中、重度异型增生中皆有阳性表达，重度异型增生时，p53 阳性率等同于胃癌。Joypaul等[3]不仅发现异型增生组织中有p53突变和表达，还进一步以PCR-SSCP及DNA测序方法，显示出55.3%癌旁肠化已有p53基因突变，本研究对39例胃癌、癌旁及切缘“正常组织”p53蛋白进行了检测，其阳性率分别为59.0%(23/39)、28.2%(11/39)和10.3%(4/39)，其中癌旁组织中轻度、中度异型增生阳性率分别为9.1%和35.7%。本研究结果与这些报道表明，p53突变及其表达发生于胃癌形成的早期阶段，对胃癌的发生，即胃粘膜癌变可能起关键作用。因此，p53表达的检测，有助于对胃粘膜癌变倾向的判断和胃癌的早期诊断。此外，本研究中p53蛋白在癌旁组织和切缘“正常组织”的阳性表达，也说明这些可能已进入异常增生的恶性转化阶段，这对癌前病变的研究和手术切缘的评估有一定意义。
本研究发现，p53蛋白表达与胃癌浸润程度和淋巴结转移有相关关系，与Martin等[4] 报道一致，还发现有血管内癌栓和淋巴管癌栓组p53表达阳性明显高于无癌栓组，表明p5 3基因突变与胃癌浸润、转移密切相关，是肿瘤具有较强浸润性的标志之一。Vogelstein等 [5]认为p53基因失活可能是肿瘤进展期的标志，是一种晚期突变，这种晚期事件主 要与转移、不良预后有关。
, 百拇医药
增殖细胞核抗原(PCNA)是一种相对分子量为36 000的非组蛋白核内多肽，是DNA多聚酶delta 的辅助蛋白，合成于晚G1期和S期，对DNA复制起重要作用[6]，其含量反映了细 胞的增殖程度。目前已把它视为“S”期细胞的一个标记物。近年来的研究已揭示，野生型p 53蛋白序列特异地与DNA结合，诱导WAF1(wild type p53 activated fragment-1)基因产 物p21蛋白的生成，而p21蛋白则与PCNA结合，阻抑DNA多聚酶delta的功能，从而抑制DNA复制，突变型p53蛋白不具备这一生物学功能[7]。文献[8]对易感食管癌和贲门癌 的高危人群同时进行p53和PCNA的免疫组化研究表明，p53的表达从正常上皮到不典型增生、到胃癌呈明显上升趋势。这些变化与PCNA标记指数(PCNA labeling index,PCNA LI)的变化相平行，两者相关显著。PCNA LI是指计数1 000个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比。
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本研究发现，p53蛋白表达阳性的胃癌其细胞增殖活性明显高于阴性者，表明突变型p53基因 缺乏野生型p53基因具有的对细胞增殖的负调控作用。已公认肿瘤细胞的增殖状态是反应肿 瘤恶性程度的重要指标之一。有资料表明[8]，PCNA LI显著增高与肿瘤的增长速度 、肝转移、腹膜转移以及淋巴结转移有关，与血管浸润有关。肿瘤细胞增殖活性的增加可能 导致肿瘤中多克隆亚群的发展，其中一些亚群有可能获得侵袭和转移能力[9]。因此，可以认为，p53蛋白表达阳性肿瘤PCNA的高表达，表明该肿瘤恶性程度较高。
总结本研究结果，得出如下结论：①突变型p53的检测有助于胃癌的早期诊断。②p53蛋白对癌前病变的研究和手术切缘的评估有一定意义。③联合检测p53和PCNA对胃癌恶性程度的判断有较高的价值。
参考文献：
[1] Leving AJ.The p53 tumor suppressor gene and products.Cancer Su rv,1992,12:59
, 百拇医药
[2] Rugge M,Shiao YH,Comrrea P,et al.Immunohistochemical evidence of p53 overexpression in gastric epithelial dysplasia.Cancer Epidemic Biomarkers Prev,1992,1:551
[3] Joypaul BV,Newman EL.Expression of p53 protein in normal,dypla stic，and malignant gastric mucosa:an immunohistochemical study.J Pathol,1993,17 0:279
[4] Martin HM,Flipe MI,Morris RW,et al.p53 expression and prognosi s in gastric carcinoma.Int J Cancer,1992,50:8
, http://www.100md.com
[5] Vogelstein B,Fearon ER,Hamilten SR,et al.Genetic alterations d uring colorectal-tumour development.N Engl J Med,1988,319:525
[6] Waseem NM,Lane DP.Monoclonal antibody analysis of the prolifer ating cell nuclear antigen (PCNA):structural conservation and the detection of a nucleolar form.J Cell Sci,1990,96:121
[7] Waga S,Hannon GJ,Beach D,et al.The p53 inhibitor of cyclin E d ependent kinases control DNA replication by interaction with PCNA.Nature,1994,57 :623
[8] 戴林.增殖细胞核抗原与胃癌.国外医学消化系疾病分册，1996，16： 3
[9] Ng IOI,Srivastava G,Chung LP,et al.Overexpression and point mu tation of p53 tumor suppressor gene in hepatocellular carcinomas in Hong Kong Ch inese people.Cancer,1994,74:30
收稿日期：1999-09-22, 百拇医药