甲状腺肿瘤cyclin E蛋白与PCNA免疫组化的定量研究
作者：李瑶琛 李士瑛 程素珍
单位：
李瑶琛(山西医科大学(030001))；李士瑛(山西医科大学(030001))；程素珍(山西医科大学第一医院)
关键词：
山西医药杂志000121 近年来，随着人们对细胞周期的研究深入，人们逐渐认识到细胞周期的调控异常与细胞癌变密切相关，细胞周期蛋白(cyclin)及其依赖性激酶(CDKs)形成的复合物是细胞周期的核心调控装置[1]，在cyclin家族中，cyclin E是其中较重要的一种[2]，其含量异常不仅将导致细胞周期的调控失常，也与肿瘤细胞的增殖、发展相关。Wang以Western Blot法研究38例结直肠癌，发现35例癌组织的cyclin E水平显著高于癌旁粘膜，并同时平行应用增殖细胞核抗原(PCNA)测定增殖指数，发现41%的病例中增殖指数也同时增高，提示cyclin E可作为结直肠癌组织的又一细胞增殖指标。我们利用免疫组化和图像定量分析研究cyclin E在甲状腺“正常”与良恶性病变中的表达情况，并同时平行检测PCNA的表达，将两者对比分析，旨在探讨cyclin E与PCNA在甲状腺肿瘤中的相关性及cyclin E的异常表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料：收集山西医科大学第一医院及山西省人民医院病理科自1995年至今的存档资料，均为手术切除后诊断明确的甲状腺良、恶性肿瘤，组织经10%的甲醛固定，石蜡包埋。复习HE切片，再次光镜诊断后，选定63例进行免疫组化SABC法染色，另取癌旁甲状腺组织5例作为“正常”组织进行研究。
1.2 免疫组化方法：采用SABC法分别检测组织中cyclin E蛋白及PCNA的表达情况。cyclin E多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)，PCNA为单克隆抗体(Zymed公司产品)。组织切片脱蜡至水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶10 min，微波炉抗原修复10 min，血清封闭后，加一抗4℃过夜，一抗的浓度均按1∶100稀释，其余按试剂盒说明书操作。DAB显色，苏木素复染，PBS替代一抗作为阴性对照，乳腺癌标本作为阳性对照片。阳性标准：形态完整，结构清晰，棕黄色颗粒，特异性地位于细胞核内为阳性，单纯胞浆着色为阴性。
, 百拇医药
1.3 图像分析及定量分析：采用Sp98病理图文分析系统1.0版分析仪，切片在光镜下按统一放大倍数(10×40倍)进行测量。每例1张切片，按等距抽样原则随机摄取5个视野，输入计算机作为测定视场，严格设定阳性标准。参数设定阳性表达面积%。
1.4 统计学处理：方差齐性检验，t检验，直线相关分析。
2 结 果
cyclin E蛋白和PCNA的异常表达，在良恶性肿瘤有非常显著差异(t=5.87，P<0.01)但在良恶性肿瘤与“正常”甲状腺组织间有显著差异(t=2.671，P<0.05)见表1。
表1 甲状腺肿瘤cyclin E蛋白及PCNA的定量分析(
±s) 组别
, http://www.100md.com
例数
cyclin 面积%
PCNA面积%
“正常”甲状腺组织
5
5.9±1.8
7±4
甲状腺腺瘤
16
27.1±17.4
32±27
甲状腺癌
47
, 百拇医药
60.8±19.2
54±29
注
1 面积单位为μm2
进一步平行分析68例cyclin E与PCNA的阳性表达面积，其中r=0.457，P<0.01所以看出两者显著的正相关。
3 讨 论
真核生物的细胞周期进程是由一系列调控因子有序的聚合和激活来调节控制的，参与细胞周期调控的主要分子有：细胞周期蛋白(cyclin S)，细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependant kinases CDKs)和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinases inhibitors CDKIs)三者构成细胞周期网络即cyclin-CDKs-CDKIs网络，此网络的正常与否和细胞以及个体的生长、 分化、衰老及癌变密切相关。其中CDKs与cyclins结合促进细胞增殖周期的进展，而当它与CDKIs结合时则抑制细胞周期[3]。目前对人类健康危害极大的恶性肿瘤被认为是细胞周期疾病。近年的研究已表明，在cyclins家族中共有8个成员(cyclin A～H)，cyclin E是其中较重要的成员[4]，虽然其染色体的位置尚不明确，但cyclin E是最直接涉及DNA复制的一种。首先，它与细胞中CDK2结合构成cyclin E-CDK2复合物，并激活复制DNA所必需的蛋白质[4]。其次，最新的研究表明[5]，cyclin E以短暂的调节方式同转录因子E2F结合，形成cyclin E-E2F复合物，此复合物在G1期可被检测，而在S期则降低，其中E2F是众所周知的S期所表达的特殊蛋白成员之一，是关键的转录因子。因此，据cyclin E的表达情况，可将它作为组织细胞增殖的又一指标。PCNA是近年来逐渐被公认的反映细胞增殖活性的指标[6，7]，它作为DNA聚合酶δ的必须因子直接参与了细胞增殖过程中的DNA复制，我们利用免疫组化法及图象分析仪测定了68例甲状腺“正常”与病变组织的cyclin E及PCNA异常表达，减少了人为因素的影响，有利于阳性标准的统一，分析准确、可信。定量分析中看到cyclin E的异常表达与PCNA在甲状腺良恶性肿瘤呈显著的正相关(r=0.457，P<0.01)，我们的结论与某些作者的观点是一致的[1]，提出cyclin E可做为甲状腺肿瘤的又一细胞增殖指标，且cyclin E异常表达是甲状腺肿瘤发生过程中的早期事件。
, 百拇医药
通过上述结果，可以看出，cyclin E蛋白与PCNA的异常表达，均可反映细胞增殖情况，在临床上，若将两者结合起来并利用图像分析系统定量分析，可以更准确地反映细胞增殖活性与否，恶性度高低，以便作出正确的治疗方案及对预后的准确评估。
作者简介：李瑶琛，女，1962年12月生，讲师，山西医科大学，030001
参考文献：
[1] 陈德玉，陈意生.细胞周期调控与细胞癌变.国外医学生理病理科学与临床分册，1997，17(1)：1-4
[2] 黎家庆，吴菲.Cyclin E在肿瘤中的表达及其意义.医学综述，1998， 11：603-604
[3] Kamb A,Grws NA,Weaver-Feldhaws J,et al.A cell cycle regulato r potentially involved in genes of many tumour types.Science,1994,264:436-441[ ZK)〗
, http://www.100md.com
[4] Koff A,Cross F，Fisher A, et al.Human cyclin E.a new cyclin th at interacts with low members of the CDC2 gene family.Cell,1991,66:1217-1228
[5] Lees E,Faha B,Dulic V,et al.Cyclin E/cdk2 and cyclin A/cdk2 ki nases associated with P107 and E2F in a temporally distinct manner.Genes Dev,19 92,6:1874-1885
[6] Kurkip,Vander Lan M,Dolbearo F,et al,Expression of proliferati on cell nuclear antigen(PCNA)/cyclin during the cell cycle.Exp Cell Res,1986,166 (1):209-214
[7] Bravoo R. Synthesis of the nuclear protein cyclin (PCNA)and it s relationship with DNA replication.Exp Cell Res,1986,163(2):287-294
收稿日期：1999-10-28, 百拇医药
单位：
李瑶琛(山西医科大学(030001))；李士瑛(山西医科大学(030001))；程素珍(山西医科大学第一医院)
关键词：
山西医药杂志000121 近年来，随着人们对细胞周期的研究深入，人们逐渐认识到细胞周期的调控异常与细胞癌变密切相关，细胞周期蛋白(cyclin)及其依赖性激酶(CDKs)形成的复合物是细胞周期的核心调控装置[1]，在cyclin家族中，cyclin E是其中较重要的一种[2]，其含量异常不仅将导致细胞周期的调控失常，也与肿瘤细胞的增殖、发展相关。Wang以Western Blot法研究38例结直肠癌，发现35例癌组织的cyclin E水平显著高于癌旁粘膜，并同时平行应用增殖细胞核抗原(PCNA)测定增殖指数，发现41%的病例中增殖指数也同时增高，提示cyclin E可作为结直肠癌组织的又一细胞增殖指标。我们利用免疫组化和图像定量分析研究cyclin E在甲状腺“正常”与良恶性病变中的表达情况，并同时平行检测PCNA的表达，将两者对比分析，旨在探讨cyclin E与PCNA在甲状腺肿瘤中的相关性及cyclin E的异常表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料：收集山西医科大学第一医院及山西省人民医院病理科自1995年至今的存档资料，均为手术切除后诊断明确的甲状腺良、恶性肿瘤，组织经10%的甲醛固定，石蜡包埋。复习HE切片，再次光镜诊断后，选定63例进行免疫组化SABC法染色，另取癌旁甲状腺组织5例作为“正常”组织进行研究。
1.2 免疫组化方法：采用SABC法分别检测组织中cyclin E蛋白及PCNA的表达情况。cyclin E多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)，PCNA为单克隆抗体(Zymed公司产品)。组织切片脱蜡至水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶10 min，微波炉抗原修复10 min，血清封闭后，加一抗4℃过夜，一抗的浓度均按1∶100稀释，其余按试剂盒说明书操作。DAB显色，苏木素复染，PBS替代一抗作为阴性对照，乳腺癌标本作为阳性对照片。阳性标准：形态完整，结构清晰，棕黄色颗粒，特异性地位于细胞核内为阳性，单纯胞浆着色为阴性。
, 百拇医药
1.3 图像分析及定量分析：采用Sp98病理图文分析系统1.0版分析仪，切片在光镜下按统一放大倍数(10×40倍)进行测量。每例1张切片，按等距抽样原则随机摄取5个视野，输入计算机作为测定视场，严格设定阳性标准。参数设定阳性表达面积%。
1.4 统计学处理：方差齐性检验，t检验，直线相关分析。
2 结 果
cyclin E蛋白和PCNA的异常表达，在良恶性肿瘤有非常显著差异(t=5.87，P<0.01)但在良恶性肿瘤与“正常”甲状腺组织间有显著差异(t=2.671，P<0.05)见表1。
表1 甲状腺肿瘤cyclin E蛋白及PCNA的定量分析(
±s) 组别, http://www.100md.com
例数
cyclin 面积%
PCNA面积%
“正常”甲状腺组织
5
5.9±1.8
7±4
甲状腺腺瘤
16
27.1±17.4
32±27
甲状腺癌
47
, 百拇医药
60.8±19.2
54±29
注
1 面积单位为μm2
进一步平行分析68例cyclin E与PCNA的阳性表达面积，其中r=0.457，P<0.01所以看出两者显著的正相关。
3 讨 论
真核生物的细胞周期进程是由一系列调控因子有序的聚合和激活来调节控制的，参与细胞周期调控的主要分子有：细胞周期蛋白(cyclin S)，细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependant kinases CDKs)和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinases inhibitors CDKIs)三者构成细胞周期网络即cyclin-CDKs-CDKIs网络，此网络的正常与否和细胞以及个体的生长、 分化、衰老及癌变密切相关。其中CDKs与cyclins结合促进细胞增殖周期的进展，而当它与CDKIs结合时则抑制细胞周期[3]。目前对人类健康危害极大的恶性肿瘤被认为是细胞周期疾病。近年的研究已表明，在cyclins家族中共有8个成员(cyclin A～H)，cyclin E是其中较重要的成员[4]，虽然其染色体的位置尚不明确，但cyclin E是最直接涉及DNA复制的一种。首先，它与细胞中CDK2结合构成cyclin E-CDK2复合物，并激活复制DNA所必需的蛋白质[4]。其次，最新的研究表明[5]，cyclin E以短暂的调节方式同转录因子E2F结合，形成cyclin E-E2F复合物，此复合物在G1期可被检测，而在S期则降低，其中E2F是众所周知的S期所表达的特殊蛋白成员之一，是关键的转录因子。因此，据cyclin E的表达情况，可将它作为组织细胞增殖的又一指标。PCNA是近年来逐渐被公认的反映细胞增殖活性的指标[6，7]，它作为DNA聚合酶δ的必须因子直接参与了细胞增殖过程中的DNA复制，我们利用免疫组化法及图象分析仪测定了68例甲状腺“正常”与病变组织的cyclin E及PCNA异常表达，减少了人为因素的影响，有利于阳性标准的统一，分析准确、可信。定量分析中看到cyclin E的异常表达与PCNA在甲状腺良恶性肿瘤呈显著的正相关(r=0.457，P<0.01)，我们的结论与某些作者的观点是一致的[1]，提出cyclin E可做为甲状腺肿瘤的又一细胞增殖指标，且cyclin E异常表达是甲状腺肿瘤发生过程中的早期事件。
, 百拇医药
通过上述结果，可以看出，cyclin E蛋白与PCNA的异常表达，均可反映细胞增殖情况，在临床上，若将两者结合起来并利用图像分析系统定量分析，可以更准确地反映细胞增殖活性与否，恶性度高低，以便作出正确的治疗方案及对预后的准确评估。
作者简介：李瑶琛，女，1962年12月生，讲师，山西医科大学，030001
参考文献：
[1] 陈德玉，陈意生.细胞周期调控与细胞癌变.国外医学生理病理科学与临床分册，1997，17(1)：1-4
[2] 黎家庆，吴菲.Cyclin E在肿瘤中的表达及其意义.医学综述，1998， 11：603-604
[3] Kamb A,Grws NA,Weaver-Feldhaws J,et al.A cell cycle regulato r potentially involved in genes of many tumour types.Science,1994,264:436-441[ ZK)〗
, http://www.100md.com
[4] Koff A,Cross F，Fisher A, et al.Human cyclin E.a new cyclin th at interacts with low members of the CDC2 gene family.Cell,1991,66:1217-1228
[5] Lees E,Faha B,Dulic V,et al.Cyclin E/cdk2 and cyclin A/cdk2 ki nases associated with P107 and E2F in a temporally distinct manner.Genes Dev,19 92,6:1874-1885
[6] Kurkip,Vander Lan M,Dolbearo F,et al,Expression of proliferati on cell nuclear antigen(PCNA)/cyclin during the cell cycle.Exp Cell Res,1986,166 (1):209-214
[7] Bravoo R. Synthesis of the nuclear protein cyclin (PCNA)and it s relationship with DNA replication.Exp Cell Res,1986,163(2):287-294
收稿日期：1999-10-28, 百拇医药