一氧化氮合成酶在周围神经中的表达
作者：俞志明 冀春萱 Lin Charles
单位：俞志明(山西医科大学 030001)；冀春萱(山西医科大学 030001)；Lin Charles(Department of Cardiology Duke University Medical Center)
关键词：一氧化氮合成酶；周围神经
山西医药杂志000414 【摘要】目的 研究一氧化氮合成酶在大鼠坐骨神经中的表达。方法 选用SD大鼠20只，其中10只的坐骨神经用于RT-PCR和Western Blot的测定，另外10只的坐骨神经用于免疫组织化学染色，通过这三种方法来观察一氧化氮合成酶是否在坐骨神经中存在以及它的分布状况。结果 经RT-PCR获得nNOS,eNOS和iNOS。Western Blot显示在坐骨神经中一个155 000的蛋白与大鼠脑的nNOS阳性对照一起迁移，一个140 000的蛋白与内皮细胞的eNOS阳性对照一起迁移，而iNOS未能检测。免疫组织化学染色显示在雪旺氏细胞和多数轴突中存在nNOS、eNOS只是位于坐骨神经上的血管内皮细胞中。神经中无iNOS显色。结论 一氧化氮合成酶存在于正常大鼠的坐骨神经中，可能作为一种神经递质执行着重要的生物学功能。
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Expression of nitric oxide synthase in peripheral nerve
Yu Zhiming Ji Chunxuan Lin Charles
(Shanxi Medical University,Taiyuan,030001,China)
【Abstract】Objective To study the expression of nitric oxide synthase (NOS) in rat sciatic nerve.Methods Twenty SD rats,10 for RT-PCR and Western blot and 10 for immunohistochemistry,were used to determine the presence and distribution of NOS in rat sciatic nerve.Results The RT-PCR exhibited the predicted size bands for nNOS,eNOS and iNOS.A 155 000 protein which comigrated with nNOS positive control from rat brain,and 140 000 protein which comigrated with eNOS positive control from endothelial cells were found by Western blot.iNOS was not detected.In the immunohistochemistry,nNOS was found in Schwann cells and most of axons.eNOS was only localized in endothelial cells of vasculatures in rat sciatic nerve.There was no iNOS stain in the nerve.Conclusion NOS is present in normal rat sciatic nerve,and may play an important role as a neurotransmitter in peripheral nerve.
, 百拇医药
【Key words】Nitric oxide synthase; Peripheral nerve
大量研究证明一氧化氮(NO)是一个神经信使因子，在中枢和周围神经传递重要的信息。由于NO是一个半衰期很短的分子，对于NO的研究大多集中在NO合成酶(nitric oxide synthase，NOS)上。在脑组织、脊髓，感觉和植物神经节中已证实有NOS的存在[1，2]，但在大的周围神经如坐骨神经中目前尚未见报道。本实验是在大鼠坐骨神经模型上用RT-PCR，Western Blot，免疫组织化学的方法对NOS的表达和分布进行研究。
1 材料与方法
选用20只体重为250～300 g的雄性SD大鼠，戊巴比妥腹腔注射麻醉(50 mg/kg)。10只用于作RT-PCR和Western Blot，10只用于作免疫组织化学染色。将大鼠的臀股部剃毛消毒，沿股骨走行方向做一4 cm长的纵行切口，分离臀肌，暴露坐骨神经，切取2 cm长的神经段。用于RT-PCR和Western Blot的神经需用液氮冷冻，并储存于-70 ℃冰箱内备用。用于免疫组织化学染色的神经于4 ℃下在20%蔗糖中低温保存4 h，然而用OCT处理，储存于-70 ℃冰箱内备用。
, 百拇医药
1.1 RT-PCR：用Dynabeads从神经标本中直接提取mRNA。依次用16Ga针，19Ga针及21Ga针加压溶解数次破碎组织，离心除去碎屑，然后将溶解液与Dynabeads结合。用10 mmol Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol LiCl，0.1% LiDS,1 mmol EDTA冲洗2次，再用10 mmol Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol LiCl，1 mmol EDTA冲洗1次。用盐水在67 ℃下将mRNA从Beads中洗脱并立即进行反转录。首先，分别在25 ℃10 min，42 ℃15 min，99 ℃ 5 min的条件下合成Strand cDNA。利用基因库中现有的RNA序列设计NO合成酶的寡核苷酸引物。PCR扩增在含有1.5 mmol MgCl，0.4 mmol引物，200 mmol dNTP PCR底物，0.002 mmol TaqDNA聚合酶的50 mL溶液中进行。在95 ℃ 65 s初变性之后，周期条件定为95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循环35次。完成前在72 ℃下孵育8 min。在电泳胶中得到所需产物大小的单带。毛地黄毒苷标记的PCR产物在3∶1 Nu-Sieve琼脂胶上做电泳，在10xSSC溶液中转移在尼龙膜上，空气干燥，并用CSPD试剂盒检测化学发光物，胶片曝光5 h显现化学发光信号。
, 百拇医药
1.2 Western Blot：液氮破碎坐骨神经，用缓冲溶解液(50 mmol Tris pH 7.4，15 mmol NaCl，0.1% SDS，1% NP-40，0.5% Sodium deoxycholate,0.02% Sodium azide,1 mmol PMSF,10 μmol; leupeptin)匀浆。4 ℃下100 000 g离心1 h，取上清液，BCA法测量。70 μg蛋白加样于8% SDS-PAGE，然后转至nitrocellulose膜上，用5%TBST-T无脂奶粉室温下阻滞1 h，再用1∶2 000 nNOS或1∶1 000 eNOS或1∶2 500 iNOS单克隆抗体孵育1 h。4 ℃下过夜，用TBST-T液冲洗3次，每次10 min。室温下用HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶4 000)孵育1 h，用TBST-T液冲洗3次，每次10 min，最后用ECL试剂盒显示印迹。
1.3 免疫组织化学染色：用切片机切取5 μm厚的样品，室温下干燥30 min。4%多聚甲醛固定10 min，并用0.3%H2O2甲醛液室温下阻滞内源性过氧化物酶活性。PBS液冲洗3次×2 min。5%马血清孵育20 min。鼠抗-nNOS(1∶800)，抗-eNOS(1∶800)或抗-iNOS(1∶50)4 ℃下孵育过夜，冲洗3次×2 min。在室温下用马生物素标记的二抗孵育30 min。样品用VICTOR ABC试剂盒检测，苏木素复染。用鼠同位素相应的IgG代替一抗作阴性对照。
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2 结 果
RT-PCR扩增产物用nNOS，iNOS，eNOS特异引物在预见的240 bp、578bp、360 bp处显示清晰条带。一个155 000蛋白和140 000蛋白分别在神经匀浆中用nNOS单克隆抗体，eNOS单克隆抗体，iNOS单克隆抗体鉴定，并同时有大鼠脑nNOS阳性对照及人内皮细胞eNOS阳性对照。在eNOS阳性对照与nNOS单克隆抗体间，nNOS阳性对照与eNOS单克隆抗体间无交叉反应。Western Blot显示155 000的蛋白与大鼠脑的nNOS阳性对照一起迁移，140 000的蛋白与内皮细胞的eNOS阳性对照一起迁移。iNOS单克隆抗体未见条带。免疫组织化学染色nNOS在雪旺细胞细胞质显示nNOS强染色性，同时在绝大部分轴突也显示阳性。而eNOS只有在神经的微血管内皮细胞着色，轴突和雪旺细胞不着色。iNOS单克隆抗体无任何反应。
3 讨 论
NO被认为是一个重要的细胞内信使分子，参与了体内许多生理和病理过程[3]。NO是由L-精氨酸在NOS的作用下生成。NOS在许多不同类型的细胞中存在。根据其分子量大小，所在细胞位置及钙离子依赖性，NOS可有三种不同的同功酶；神经源性NOS (nNOS)，存在于中枢和周围神经系统的神经元和表皮细胞中；诱导性NOS (iNOS)，在绝大部分细胞中由内毒素和细胞素诱导产生；内皮细胞源性NOS(eNOS)，存在于血管内皮细胞中。
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许多以往的研究显示NOSmRNA酶及其蛋白存在于脑、脊髓、神经节中。选择性地抑制NO合成酶可以阻止由神经因素引起的脑动脉扩张等。NO在中枢神经系统中可能充当一个神经递质的角色[4]，然而在大的周围神经中是否有NO还未见有报道。本实验通过RT-PCR，Western blot和免疫组织化学在周围神经中证实了NOS的存在。RT-PCR测定发现在大鼠有三种不类型的NOS存在于坐骨神经中。Western blot和免疫组织化学显现坐骨神经中有nNOS、eNOS。而iNOS未检出，它在RT-PCR中的出现可能是由于实验中手术创伤的刺激产生。
有研究表明周围神经损伤可在脊髓神经元，脑组织和脊神经节中上调NOS的表达[5，6]。而nNOS在周围神经的雪旺细胞和轴突中的定位，为研究NO在周围神经损伤和再生过程中的调节作用提供了基础。
作者简介：俞志明，女，1966年2月生，讲师，山西医科大学，030001
, 百拇医药
参考文献
1，Doone GV,Pelissier N,Manchester T,et al.Distribution of NADPH-d and nNOS-IR in the thoracolumbar and sacrococcygeal spinal cord of the guinea pig.J Auton Nerv Syst.1999,77:98-113
2，Riemann R,Reuss S.Nitric oxide synthase in trigeminal ganglion cells projecting to the cochlea of rat and guinea pig.Neuroreport.1999,10:2641-2645
3，Radomski MW.Nitric oxide:biological mediator,modulator and effector.Ann Med,1995,27:321-329
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4，Reuss S.Nitric oxide synthase in the auditory brain stem.Neuroreport,1998,9:3643-3646
5，Gordh T,Sharma HS,Alm P,et al.Spinal nerve lesion induces upregulation of neuronal nitric oxide synthase in the spinal cord:an immunohistochemical investigation in the rat.Amino Acids,1998,14:105-112
6，Bergman E,Carlsson K,Liljeborg A,et al.Neuropeptides.nitric oxide synthase and GAP-43 in B4-binding and RT97 immunoreactive primary sensory neurons:normal distribution pattern and changes after peripheral nerve transection and aging .Brain Res,1999,832:63-83
收稿日期：2000-04-23, http://www.100md.com
单位：俞志明(山西医科大学 030001)；冀春萱(山西医科大学 030001)；Lin Charles(Department of Cardiology Duke University Medical Center)
关键词：一氧化氮合成酶；周围神经
山西医药杂志000414 【摘要】目的 研究一氧化氮合成酶在大鼠坐骨神经中的表达。方法 选用SD大鼠20只，其中10只的坐骨神经用于RT-PCR和Western Blot的测定，另外10只的坐骨神经用于免疫组织化学染色，通过这三种方法来观察一氧化氮合成酶是否在坐骨神经中存在以及它的分布状况。结果 经RT-PCR获得nNOS,eNOS和iNOS。Western Blot显示在坐骨神经中一个155 000的蛋白与大鼠脑的nNOS阳性对照一起迁移，一个140 000的蛋白与内皮细胞的eNOS阳性对照一起迁移，而iNOS未能检测。免疫组织化学染色显示在雪旺氏细胞和多数轴突中存在nNOS、eNOS只是位于坐骨神经上的血管内皮细胞中。神经中无iNOS显色。结论 一氧化氮合成酶存在于正常大鼠的坐骨神经中，可能作为一种神经递质执行着重要的生物学功能。
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Expression of nitric oxide synthase in peripheral nerve
Yu Zhiming Ji Chunxuan Lin Charles
(Shanxi Medical University,Taiyuan,030001,China)
【Abstract】Objective To study the expression of nitric oxide synthase (NOS) in rat sciatic nerve.Methods Twenty SD rats,10 for RT-PCR and Western blot and 10 for immunohistochemistry,were used to determine the presence and distribution of NOS in rat sciatic nerve.Results The RT-PCR exhibited the predicted size bands for nNOS,eNOS and iNOS.A 155 000 protein which comigrated with nNOS positive control from rat brain,and 140 000 protein which comigrated with eNOS positive control from endothelial cells were found by Western blot.iNOS was not detected.In the immunohistochemistry,nNOS was found in Schwann cells and most of axons.eNOS was only localized in endothelial cells of vasculatures in rat sciatic nerve.There was no iNOS stain in the nerve.Conclusion NOS is present in normal rat sciatic nerve,and may play an important role as a neurotransmitter in peripheral nerve.
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【Key words】Nitric oxide synthase; Peripheral nerve
大量研究证明一氧化氮(NO)是一个神经信使因子，在中枢和周围神经传递重要的信息。由于NO是一个半衰期很短的分子，对于NO的研究大多集中在NO合成酶(nitric oxide synthase，NOS)上。在脑组织、脊髓，感觉和植物神经节中已证实有NOS的存在[1，2]，但在大的周围神经如坐骨神经中目前尚未见报道。本实验是在大鼠坐骨神经模型上用RT-PCR，Western Blot，免疫组织化学的方法对NOS的表达和分布进行研究。
1 材料与方法
选用20只体重为250～300 g的雄性SD大鼠，戊巴比妥腹腔注射麻醉(50 mg/kg)。10只用于作RT-PCR和Western Blot，10只用于作免疫组织化学染色。将大鼠的臀股部剃毛消毒，沿股骨走行方向做一4 cm长的纵行切口，分离臀肌，暴露坐骨神经，切取2 cm长的神经段。用于RT-PCR和Western Blot的神经需用液氮冷冻，并储存于-70 ℃冰箱内备用。用于免疫组织化学染色的神经于4 ℃下在20%蔗糖中低温保存4 h，然而用OCT处理，储存于-70 ℃冰箱内备用。
, 百拇医药
1.1 RT-PCR：用Dynabeads从神经标本中直接提取mRNA。依次用16Ga针，19Ga针及21Ga针加压溶解数次破碎组织，离心除去碎屑，然后将溶解液与Dynabeads结合。用10 mmol Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol LiCl，0.1% LiDS,1 mmol EDTA冲洗2次，再用10 mmol Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol LiCl，1 mmol EDTA冲洗1次。用盐水在67 ℃下将mRNA从Beads中洗脱并立即进行反转录。首先，分别在25 ℃10 min，42 ℃15 min，99 ℃ 5 min的条件下合成Strand cDNA。利用基因库中现有的RNA序列设计NO合成酶的寡核苷酸引物。PCR扩增在含有1.5 mmol MgCl，0.4 mmol引物，200 mmol dNTP PCR底物，0.002 mmol TaqDNA聚合酶的50 mL溶液中进行。在95 ℃ 65 s初变性之后，周期条件定为95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循环35次。完成前在72 ℃下孵育8 min。在电泳胶中得到所需产物大小的单带。毛地黄毒苷标记的PCR产物在3∶1 Nu-Sieve琼脂胶上做电泳，在10xSSC溶液中转移在尼龙膜上，空气干燥，并用CSPD试剂盒检测化学发光物，胶片曝光5 h显现化学发光信号。
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1.2 Western Blot：液氮破碎坐骨神经，用缓冲溶解液(50 mmol Tris pH 7.4，15 mmol NaCl，0.1% SDS，1% NP-40，0.5% Sodium deoxycholate,0.02% Sodium azide,1 mmol PMSF,10 μmol; leupeptin)匀浆。4 ℃下100 000 g离心1 h，取上清液，BCA法测量。70 μg蛋白加样于8% SDS-PAGE，然后转至nitrocellulose膜上，用5%TBST-T无脂奶粉室温下阻滞1 h，再用1∶2 000 nNOS或1∶1 000 eNOS或1∶2 500 iNOS单克隆抗体孵育1 h。4 ℃下过夜，用TBST-T液冲洗3次，每次10 min。室温下用HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶4 000)孵育1 h，用TBST-T液冲洗3次，每次10 min，最后用ECL试剂盒显示印迹。
1.3 免疫组织化学染色：用切片机切取5 μm厚的样品，室温下干燥30 min。4%多聚甲醛固定10 min，并用0.3%H2O2甲醛液室温下阻滞内源性过氧化物酶活性。PBS液冲洗3次×2 min。5%马血清孵育20 min。鼠抗-nNOS(1∶800)，抗-eNOS(1∶800)或抗-iNOS(1∶50)4 ℃下孵育过夜，冲洗3次×2 min。在室温下用马生物素标记的二抗孵育30 min。样品用VICTOR ABC试剂盒检测，苏木素复染。用鼠同位素相应的IgG代替一抗作阴性对照。
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2 结 果
RT-PCR扩增产物用nNOS，iNOS，eNOS特异引物在预见的240 bp、578bp、360 bp处显示清晰条带。一个155 000蛋白和140 000蛋白分别在神经匀浆中用nNOS单克隆抗体，eNOS单克隆抗体，iNOS单克隆抗体鉴定，并同时有大鼠脑nNOS阳性对照及人内皮细胞eNOS阳性对照。在eNOS阳性对照与nNOS单克隆抗体间，nNOS阳性对照与eNOS单克隆抗体间无交叉反应。Western Blot显示155 000的蛋白与大鼠脑的nNOS阳性对照一起迁移，140 000的蛋白与内皮细胞的eNOS阳性对照一起迁移。iNOS单克隆抗体未见条带。免疫组织化学染色nNOS在雪旺细胞细胞质显示nNOS强染色性，同时在绝大部分轴突也显示阳性。而eNOS只有在神经的微血管内皮细胞着色，轴突和雪旺细胞不着色。iNOS单克隆抗体无任何反应。
3 讨 论
NO被认为是一个重要的细胞内信使分子，参与了体内许多生理和病理过程[3]。NO是由L-精氨酸在NOS的作用下生成。NOS在许多不同类型的细胞中存在。根据其分子量大小，所在细胞位置及钙离子依赖性，NOS可有三种不同的同功酶；神经源性NOS (nNOS)，存在于中枢和周围神经系统的神经元和表皮细胞中；诱导性NOS (iNOS)，在绝大部分细胞中由内毒素和细胞素诱导产生；内皮细胞源性NOS(eNOS)，存在于血管内皮细胞中。
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许多以往的研究显示NOSmRNA酶及其蛋白存在于脑、脊髓、神经节中。选择性地抑制NO合成酶可以阻止由神经因素引起的脑动脉扩张等。NO在中枢神经系统中可能充当一个神经递质的角色[4]，然而在大的周围神经中是否有NO还未见有报道。本实验通过RT-PCR，Western blot和免疫组织化学在周围神经中证实了NOS的存在。RT-PCR测定发现在大鼠有三种不类型的NOS存在于坐骨神经中。Western blot和免疫组织化学显现坐骨神经中有nNOS、eNOS。而iNOS未检出，它在RT-PCR中的出现可能是由于实验中手术创伤的刺激产生。
有研究表明周围神经损伤可在脊髓神经元，脑组织和脊神经节中上调NOS的表达[5，6]。而nNOS在周围神经的雪旺细胞和轴突中的定位，为研究NO在周围神经损伤和再生过程中的调节作用提供了基础。
作者简介：俞志明，女，1966年2月生，讲师，山西医科大学，030001
, 百拇医药
参考文献
1，Doone GV,Pelissier N,Manchester T,et al.Distribution of NADPH-d and nNOS-IR in the thoracolumbar and sacrococcygeal spinal cord of the guinea pig.J Auton Nerv Syst.1999,77:98-113
2，Riemann R,Reuss S.Nitric oxide synthase in trigeminal ganglion cells projecting to the cochlea of rat and guinea pig.Neuroreport.1999,10:2641-2645
3，Radomski MW.Nitric oxide:biological mediator,modulator and effector.Ann Med,1995,27:321-329
, http://www.100md.com
4，Reuss S.Nitric oxide synthase in the auditory brain stem.Neuroreport,1998,9:3643-3646
5，Gordh T,Sharma HS,Alm P,et al.Spinal nerve lesion induces upregulation of neuronal nitric oxide synthase in the spinal cord:an immunohistochemical investigation in the rat.Amino Acids,1998,14:105-112
6，Bergman E,Carlsson K,Liljeborg A,et al.Neuropeptides.nitric oxide synthase and GAP-43 in B4-binding and RT97 immunoreactive primary sensory neurons:normal distribution pattern and changes after peripheral nerve transection and aging .Brain Res,1999,832:63-83
收稿日期：2000-04-23, http://www.100md.com