大鼠胚胎小脑提取液对体外培养小脑神经细胞的作用
作者：章培军 吕捷 吕永利
单位：章培军(大同医学高等专科学校 037008)；吕捷(首都医科大学北京市神经科学研究所)；吕永利(中国医科大学)
关键词：靶源性神经营养因子；小脑提取液；胎龄；细胞培养；小脑
山西医药杂志000512 【 摘 要 】 目的 观察不同胎龄大鼠小脑提取液(cerebellum extracts,CE)对 体外培养小脑神经细胞的影响。方法 制备不同蛋白浓度的14、16、18、20 d胎鼠(E14、E16、E18、E20)及新生1 d鼠(P1)CE，加入原代培养的E18胎鼠小脑神经细胞中 ，24 h后以微量快速自动比色法检测细胞活性。结果 实验组各胎龄CE均能 促进培养小脑神经元的存活，并有蛋白浓度依赖关系，各胎龄都有各自不同的最适浓度，E1 6和E18CE显示了更强的神经营养活性，与对照组及其他实验组相比差异有极显著性(P<0.001)。结论 CE对培养小脑细胞具有高度神经营养活性。
, 百拇医药
Effect of cerebellum extracts from embryonic rat on cultured cerebellar neurons
Zhang Peijun,Lü Jie,Lü Yongli
(Datong Medical College,Datong,037008,China)
【 Abstract 】 Objective The effects of cerebellum extracts (C E) from different embryonic ages on cultured rat cerebellar neurons were studied .Method CE from 14 d,16 d,18 d,20 d embryonic rats (E14～20) an d P1 newborn rat were made into different concentrations on protein,then were ad ded to cultured cerebellar neurons of E18 rats.The neuronal survival was determi ned by the autocolorimetric assay.Results The data showed that CE of all experimental ages could promote the survival of cerebellar neurons and there was a concentration-dependent relation on protein;each age had its respe ctive optimun protein concentration,E16 and E18 CE showed more prominent neurotr ophic activities,making a significant difference (P<0.001) cempared with the control and other experimental groups.Conclusion The rat cerebellum extract (CE) has a powerful trophotropic effect on th e cultured cerebellar neurons.
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【 Key words】 Target-derived neurotrophic factors; Cerebellu m extracts; Embryonic age; Cell culture; Cerebellum
神经营养因子(neruotrophic factors,NTFs)能维持发育神经元的存活和分化，促进受损伤 神经元的修复与再生。受损伤神经元的长期存活及功能恢复还有赖于这些神经元的靶细胞提 供的相对特异的靶源性神经营养因子(target-derived neurotrophic factors,TNTFs) [1]。目前已从组织提取液中提出多种特异性TNTFs[2，3]。小脑是重要的运动 中枢，已发现有多种TNTFs及其受体在表达，但以小脑为靶器官提供的特异TNTFs还未见报道 。我们设想，除了非特异性TNTFs以外，小脑神经细胞在胚胎发育中也可能合成分泌某些特 异的TNTFs，诱导自身神经元轴突的生长，从而建立特异的神经通路联系。为此，我们制备 不同胎龄小脑提取液，观察了它们对培养小脑神经细胞的作用。
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1 材料与方法
1.1 CE的制备：取相应胎龄(E14、E16、E18、E20)胚鼠及P1新生鼠小脑各20个，按每10 m g重加1 mL PBS(pH7.0)的比例，制备匀浆，经超声粉碎后，将匀浆液离心，30 000 r/min ，4 ℃，90 min，取上清液，以紫外分光光度法测定蛋白质浓度，以PBS(pH7.0)作相应稀 释，得到不同蛋白浓度的CE，经0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，-70 ℃冻存备用。
1.2 细胞培养：取出E18小脑皮质，经胰酶消化后，得到细胞悬液，稀释到1×109/L。 将细胞悬液以50 μL/孔的体积接种于96孔板。实验组每孔加入50 μL不同胎龄不同浓度的C E，对照组每孔加入50 μL PBS(pH7.0)，每孔总容量为100 μL。置培养箱内孵育24 h。各 组每次8孔，重复2～3批次。
1.3 快速微量自动比色(MTT)分析：终止培养前4 h，96孔板每孔加10 μL四唑盐衍生物MT T溶液(1.5 g/L 1640)，继续培养4 h后每孔加入100 μL 0.08 mol/L HCl-异丙醇溶液终 止反应。用吸管反复抽吸使蓝色产物充分溶解，将培养板置于微孔读数器内，采用实验波长 570 nm，参考波长630 nm测定每孔样品的光密度A值。
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1.4 统计学处理：对所得数据进行Student检验，α=0.05。
2 结 果
四唑盐衍生物MTT可被活跃的细胞摄取，并在细胞质线粒体脱氢酶的作用下转变为蓝色产物f ormazan，在一定波长下比色得到光密度A值。活跃细胞越多，蓝色产 物越多，则A值越高，说明作用性越强。终止培养前4 h加入MTT后可 见96孔板内呈现不同分部程度的深色针状辐射样结晶。终止培养后测得各孔值反映各胎龄不 同浓度CE对培养24 h E18小脑神经细胞的作用，见表1～5。
表1 不同浓度E14 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(
±s)
g/L 项目
对照组
, http://www.100md.com
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
A值
0.008±0.002
0.011±0.002
0.011±0.002
0.013±0.003
0.014±0.002
0.015±0.002
, 百拇医药
P值
<0.01
<0.01
<0.002
<0.001
< 0.001
表2 不同浓度E16 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(±s)
g/L 项目
对照组
0.05
0.1
, 百拇医药
0.15
0.2
0.25
A值
0.011±0.002
0.026±0.005
0.042±0.004
0.052±0.003
0.039±0.003
0.033±0.003
P值
<0.001
, 百拇医药
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
表3 不同浓度E18 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(±s)
g/L 项目
对照组
0.25
0.50
1.00
2.00
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3.00
4.00
A值
0.010±0.003
0.013±0.004
0.122±0.025
0.145±0.033
0.158±0.034
0.193±0.029
0.177±0.026
P值
>0.05
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<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
表4 不同浓度E20 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(±s)
g/L 项目
对照组
0.40
0.45
0.50
, 百拇医药
0.55
0.60
A值
0.010±0.001
0.019±0 .001
0.015±0.001
0.021±0.001
0.014±0.001
0.024±0.001
P值
<0.001
<0.001
, 百拇医药
<0.001
<0.001
<0.001
表5 不同浓度P1 CE对培养24 h E18小脑神经细 胞的作用(±s)
g/L 项目
对照组
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
, 百拇医药
A值
0.000±0.001
0.015±0.001
0.015±0.001
0.016±0.001
0.019±0.001
0.013±0.001
P值
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
, 百拇医药
<0.001
以上结果表明，实验的各胎龄CE均能支持培养E18小脑神经细胞的存活，并有蛋白浓度依赖 关系，各胎龄都有各自不同的最适浓度，在相同的蛋白浓度范围内，E16、E18 CE显示了更 强的神经营养活性，E18 CE活性最高。3 讨 论
神经元的正常发育及损伤后的功能修复需要有靶细胞提供的TNTFs来增加效能[1]。 制备组织提取液或条件液，从中寻找特异的TNTFs，国内外已有很多报道[2，3]， 但是，关于小脑提取液对培养神经元的作用的观察尚未见报道，本研究首次报道了小脑提取 液对培养小脑神经细胞的作用。
已有研究表明培养24 h的小脑皮质细胞神经元达97%以上[4]，所以我们认为培养24 h的细胞活性可视为神经细胞的活性。几乎所有的实验组与对照组差异都有显著性，表明CE 确实具有神经营养活性。E16、E18及P1 CE对培养小脑细胞显示了相似的效应曲线模式，即 都存在一个最适蛋白浓度取得最大A值，浓度低于或高于这个界值 ，作用就会减弱，这与已有的关于TNTFs研究的报道一致[2，5]，表明CE中的某种 或几种蛋白质具有神经营养活性，可促进培养神经元的存活。E14 CE对培养小脑细胞的效应 曲线在测定范围内呈现单方向的升区间，根据上述趋势，我们推论，它的最适浓度可能位于 该范围之外，有待进一步验证。在培养小脑细胞中，E18 CE显示了高于其他胎龄的最强神经 营养活性，可能是同期因子对同期细胞取得最大效能的结果。
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为什么一定胚胎期，一定蛋白浓度的CE具有更强的神经营养活性呢?许多研究已表明，在发 育的不同阶段，神经元对营养因子的需求不同，不同类群的神经元需要不同的TNTFs。神经 胚胎学指出神经系统的发育要经历增生基质的生长，神经元群的分化和神经环路的精确调节 三个阶段，其中神经元群的分化要经历神经发生、神经迁移、轴突形成和突触发生几个阶段 [6]，我们认为E16～E18小脑胚胎期正处于神经元群体分化期，轴突形成需要靶器 官提供特异的TNTFs，早于或迟于这一时期，该因子不再表达，这是受细胞固有的遗传信息 所调控的。Eagleson等[5]认为高浓度的营养液导致神经营养活性的降低，主要有 两种解释：其一是在营养液中神经毒性分子与神经营养分子共存，当浓度很高时，毒性分子 抵消了营养分子的作用；其二是高浓度的TNTFs导致细胞表面受体的下调。我们倾向于第二 种解释。
总之，本实验结果表明，实验的各胎龄小鼠提取液均能促进培养小脑神经元的存活，并有蛋 白浓度依赖关系，各胎龄有各自不同的最适浓度，E16和E18小脑可能提供高度营养活性的特 异TNTFs；但对于CE的神经营养成分还需进一步鉴定。
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作者简介：章培军，男，1969年6月生，讲师，大同医学高等专科学校，037008
参考文献
1.Himes BT,Goldberger ME,Tessler A.Grafts of fetal central nervo us system tissue rescue axotomized Clarke′s nucleus neurons in adult and neonat al operates.J Comp Neurol,1994,339:117
2.周明华，吴玺印，任峰，等.大鼠骨骼肌提取液22 000，25 000蛋白分 子对培养脊髓腰段前角运动神经元的影响.科学通报，1992，9：841
3.Bianchi LM,Cohan CS.Effects of the neurotrophins and CNTF on d eveloping statoacoustic neurons:comparison with an otocyst-derived factor.Dev B iol,1993,159(1):353
, http://www.100md.com
4.郭畹华，林启祥.胶质细胞成熟因子皮质原代培养的小脑皮质神经元 的生存.解剖学报，1989，20(1)：50-53
5.Eagleson KL,Haun F,Cuningham TJ.Different populatons of dorsal lateral geniculate nucleus neurons have concentration-specific requirements fo r a cortically derived neuron survival factor.Exp Neurol,1990,110:284
6.Altman,著.赵燕谷，译.神经胚胎学.见：Adelman G,著.杨雄里， 译.神经科学百科全书.上海：伯克豪萨伊尔-上海科技出版社，1992.805-809
(收稿日期：2000-08-16), 百拇医药
单位：章培军(大同医学高等专科学校 037008)；吕捷(首都医科大学北京市神经科学研究所)；吕永利(中国医科大学)
关键词：靶源性神经营养因子；小脑提取液；胎龄；细胞培养；小脑
山西医药杂志000512 【 摘 要 】 目的 观察不同胎龄大鼠小脑提取液(cerebellum extracts,CE)对 体外培养小脑神经细胞的影响。方法 制备不同蛋白浓度的14、16、18、20 d胎鼠(E14、E16、E18、E20)及新生1 d鼠(P1)CE，加入原代培养的E18胎鼠小脑神经细胞中 ，24 h后以微量快速自动比色法检测细胞活性。结果 实验组各胎龄CE均能 促进培养小脑神经元的存活，并有蛋白浓度依赖关系，各胎龄都有各自不同的最适浓度，E1 6和E18CE显示了更强的神经营养活性，与对照组及其他实验组相比差异有极显著性(P<0.001)。结论 CE对培养小脑细胞具有高度神经营养活性。
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Effect of cerebellum extracts from embryonic rat on cultured cerebellar neurons
Zhang Peijun,Lü Jie,Lü Yongli
(Datong Medical College,Datong,037008,China)
【 Abstract 】 Objective The effects of cerebellum extracts (C E) from different embryonic ages on cultured rat cerebellar neurons were studied .Method CE from 14 d,16 d,18 d,20 d embryonic rats (E14～20) an d P1 newborn rat were made into different concentrations on protein,then were ad ded to cultured cerebellar neurons of E18 rats.The neuronal survival was determi ned by the autocolorimetric assay.Results The data showed that CE of all experimental ages could promote the survival of cerebellar neurons and there was a concentration-dependent relation on protein;each age had its respe ctive optimun protein concentration,E16 and E18 CE showed more prominent neurotr ophic activities,making a significant difference (P<0.001) cempared with the control and other experimental groups.Conclusion The rat cerebellum extract (CE) has a powerful trophotropic effect on th e cultured cerebellar neurons.
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【 Key words】 Target-derived neurotrophic factors; Cerebellu m extracts; Embryonic age; Cell culture; Cerebellum
神经营养因子(neruotrophic factors,NTFs)能维持发育神经元的存活和分化，促进受损伤 神经元的修复与再生。受损伤神经元的长期存活及功能恢复还有赖于这些神经元的靶细胞提 供的相对特异的靶源性神经营养因子(target-derived neurotrophic factors,TNTFs) [1]。目前已从组织提取液中提出多种特异性TNTFs[2，3]。小脑是重要的运动 中枢，已发现有多种TNTFs及其受体在表达，但以小脑为靶器官提供的特异TNTFs还未见报道 。我们设想，除了非特异性TNTFs以外，小脑神经细胞在胚胎发育中也可能合成分泌某些特 异的TNTFs，诱导自身神经元轴突的生长，从而建立特异的神经通路联系。为此，我们制备 不同胎龄小脑提取液，观察了它们对培养小脑神经细胞的作用。
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1 材料与方法
1.1 CE的制备：取相应胎龄(E14、E16、E18、E20)胚鼠及P1新生鼠小脑各20个，按每10 m g重加1 mL PBS(pH7.0)的比例，制备匀浆，经超声粉碎后，将匀浆液离心，30 000 r/min ，4 ℃，90 min，取上清液，以紫外分光光度法测定蛋白质浓度，以PBS(pH7.0)作相应稀 释，得到不同蛋白浓度的CE，经0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，-70 ℃冻存备用。
1.2 细胞培养：取出E18小脑皮质，经胰酶消化后，得到细胞悬液，稀释到1×109/L。 将细胞悬液以50 μL/孔的体积接种于96孔板。实验组每孔加入50 μL不同胎龄不同浓度的C E，对照组每孔加入50 μL PBS(pH7.0)，每孔总容量为100 μL。置培养箱内孵育24 h。各 组每次8孔，重复2～3批次。
1.3 快速微量自动比色(MTT)分析：终止培养前4 h，96孔板每孔加10 μL四唑盐衍生物MT T溶液(1.5 g/L 1640)，继续培养4 h后每孔加入100 μL 0.08 mol/L HCl-异丙醇溶液终 止反应。用吸管反复抽吸使蓝色产物充分溶解，将培养板置于微孔读数器内，采用实验波长 570 nm，参考波长630 nm测定每孔样品的光密度A值。
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1.4 统计学处理：对所得数据进行Student检验，α=0.05。
2 结 果
四唑盐衍生物MTT可被活跃的细胞摄取，并在细胞质线粒体脱氢酶的作用下转变为蓝色产物f ormazan，在一定波长下比色得到光密度A值。活跃细胞越多，蓝色产 物越多，则A值越高，说明作用性越强。终止培养前4 h加入MTT后可 见96孔板内呈现不同分部程度的深色针状辐射样结晶。终止培养后测得各孔值反映各胎龄不 同浓度CE对培养24 h E18小脑神经细胞的作用，见表1～5。
表1 不同浓度E14 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(
±s)g/L 项目
对照组
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0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
A值
0.008±0.002
0.011±0.002
0.011±0.002
0.013±0.003
0.014±0.002
0.015±0.002
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P值
<0.01
<0.01
<0.002
<0.001
< 0.001
表2 不同浓度E16 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(
±s)g/L 项目
对照组
0.05
0.1
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0.15
0.2
0.25
A值
0.011±0.002
0.026±0.005
0.042±0.004
0.052±0.003
0.039±0.003
0.033±0.003
P值
<0.001
, 百拇医药
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
表3 不同浓度E18 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(
±s)g/L 项目
对照组
0.25
0.50
1.00
2.00
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3.00
4.00
A值
0.010±0.003
0.013±0.004
0.122±0.025
0.145±0.033
0.158±0.034
0.193±0.029
0.177±0.026
P值
>0.05
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<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
表4 不同浓度E20 CE对培养24 h E18小脑神经 细胞的作用(
±s)g/L 项目
对照组
0.40
0.45
0.50
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0.55
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A值
0.010±0.001
0.019±0 .001
0.015±0.001
0.021±0.001
0.014±0.001
0.024±0.001
P值
<0.001
<0.001
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<0.001
<0.001
<0.001
表5 不同浓度P1 CE对培养24 h E18小脑神经细 胞的作用(
±s)g/L 项目
对照组
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
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A值
0.000±0.001
0.015±0.001
0.015±0.001
0.016±0.001
0.019±0.001
0.013±0.001
P值
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
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<0.001
以上结果表明，实验的各胎龄CE均能支持培养E18小脑神经细胞的存活，并有蛋白浓度依赖 关系，各胎龄都有各自不同的最适浓度，在相同的蛋白浓度范围内，E16、E18 CE显示了更 强的神经营养活性，E18 CE活性最高。3 讨 论
神经元的正常发育及损伤后的功能修复需要有靶细胞提供的TNTFs来增加效能[1]。 制备组织提取液或条件液，从中寻找特异的TNTFs，国内外已有很多报道[2，3]， 但是，关于小脑提取液对培养神经元的作用的观察尚未见报道，本研究首次报道了小脑提取 液对培养小脑神经细胞的作用。
已有研究表明培养24 h的小脑皮质细胞神经元达97%以上[4]，所以我们认为培养24 h的细胞活性可视为神经细胞的活性。几乎所有的实验组与对照组差异都有显著性，表明CE 确实具有神经营养活性。E16、E18及P1 CE对培养小脑细胞显示了相似的效应曲线模式，即 都存在一个最适蛋白浓度取得最大A值，浓度低于或高于这个界值 ，作用就会减弱，这与已有的关于TNTFs研究的报道一致[2，5]，表明CE中的某种 或几种蛋白质具有神经营养活性，可促进培养神经元的存活。E14 CE对培养小脑细胞的效应 曲线在测定范围内呈现单方向的升区间，根据上述趋势，我们推论，它的最适浓度可能位于 该范围之外，有待进一步验证。在培养小脑细胞中，E18 CE显示了高于其他胎龄的最强神经 营养活性，可能是同期因子对同期细胞取得最大效能的结果。
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为什么一定胚胎期，一定蛋白浓度的CE具有更强的神经营养活性呢?许多研究已表明，在发 育的不同阶段，神经元对营养因子的需求不同，不同类群的神经元需要不同的TNTFs。神经 胚胎学指出神经系统的发育要经历增生基质的生长，神经元群的分化和神经环路的精确调节 三个阶段，其中神经元群的分化要经历神经发生、神经迁移、轴突形成和突触发生几个阶段 [6]，我们认为E16～E18小脑胚胎期正处于神经元群体分化期，轴突形成需要靶器 官提供特异的TNTFs，早于或迟于这一时期，该因子不再表达，这是受细胞固有的遗传信息 所调控的。Eagleson等[5]认为高浓度的营养液导致神经营养活性的降低，主要有 两种解释：其一是在营养液中神经毒性分子与神经营养分子共存，当浓度很高时，毒性分子 抵消了营养分子的作用；其二是高浓度的TNTFs导致细胞表面受体的下调。我们倾向于第二 种解释。
总之，本实验结果表明，实验的各胎龄小鼠提取液均能促进培养小脑神经元的存活，并有蛋 白浓度依赖关系，各胎龄有各自不同的最适浓度，E16和E18小脑可能提供高度营养活性的特 异TNTFs；但对于CE的神经营养成分还需进一步鉴定。
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作者简介：章培军，男，1969年6月生，讲师，大同医学高等专科学校，037008
参考文献
1.Himes BT,Goldberger ME,Tessler A.Grafts of fetal central nervo us system tissue rescue axotomized Clarke′s nucleus neurons in adult and neonat al operates.J Comp Neurol,1994,339:117
2.周明华，吴玺印，任峰，等.大鼠骨骼肌提取液22 000，25 000蛋白分 子对培养脊髓腰段前角运动神经元的影响.科学通报，1992，9：841
3.Bianchi LM,Cohan CS.Effects of the neurotrophins and CNTF on d eveloping statoacoustic neurons:comparison with an otocyst-derived factor.Dev B iol,1993,159(1):353
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4.郭畹华，林启祥.胶质细胞成熟因子皮质原代培养的小脑皮质神经元 的生存.解剖学报，1989，20(1)：50-53
5.Eagleson KL,Haun F,Cuningham TJ.Different populatons of dorsal lateral geniculate nucleus neurons have concentration-specific requirements fo r a cortically derived neuron survival factor.Exp Neurol,1990,110:284
6.Altman,著.赵燕谷，译.神经胚胎学.见：Adelman G,著.杨雄里， 译.神经科学百科全书.上海：伯克豪萨伊尔-上海科技出版社，1992.805-809
(收稿日期：2000-08-16), 百拇医药