应用荧光原位杂交技术对性染色体异常进行诊断
作者：杜梅君 化爱玲 郑梅林 丁琰
单位：杜梅君(山西医科大学第一医院 030001)；化爱玲(山西医科大学第一医院 030001)；郑梅林(山西医科大学第一医院 030001)；丁琰(山西医科大学第一医院 030001)
关键词：荧光原 位杂交；核型分析；染色体异常；间期细胞
山西医药杂志000507 【 摘 要 】 目的 评价荧光原位杂交技术(FISH)在染色体异常核型分析中的应 用价值。方法 应用X着丝粒探针、Y染色体区域特异性探针(PY3.4)对8例 外生殖器及第二性征发育不全、原(继)发闭经、无精子等病因前来就诊的患者及2例正常男 、女外周血进行G显带分析及荧光原位杂交，杂交后用Olympus BX60荧光显微镜观察玻片并 照相。结果 FISH结果与原G显带核型一致，8例患者中1例核型为45，X0；1 例为46，XX/45，X0；1例为45，X0/47，XXX；1例为46，Xi(Xq)；1例为45，X0/46,Xi(Xq)， 诊断为先天性卵巢发育不全；2例核型为47，XXY，诊断为先天性睾丸发育不全；1例生殖器 为男性的患者核型为46，XX，诊断为性反转。结论 FISH技术可用于染色体 异常的分析，能分析一些显带技术不易分辨的异常。由于FISH技术在间期细胞中显示杂交信 号，在极短的时间内可检测大量细胞，对于一些中期分裂相有限、分散不好的染色体以及那 些不易发现的嵌合体等方面，有重要的应用价值。
, 百拇医药
Application of FISH technique to the analysis of chromosome abe rration
Du Meijun,Hua Ailing,Zheng Meilin,et al
(The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan,030001,China)
【 Abstract 】 Objective In order to find the application valu e of FISH (fluorescence in situ hybridization) in chromosome abn ormalities analysis.Methods Fluorescence in situ hybridization using X alpha satellite,Y (PY3.4) probe labeled with biotin and karyotype analysis were made in two normal persons and 8 cases of dysgenitalism. Results The result of FISH was consistent with G-banding.Conclusion FISH is very useful for chromosome aberration study,especia lly for interphase cell and very small portions of chromosome aberration which t hrough G-banding can′t be found.
, 百拇医药
【 Key words 】 Fluorescence in situ hybridizatio n； Karyotypic analysis； Chromosome abnormalities; Interphase cell
染色体结构及数目异常是遗传病发生的主要原因之一，常规的细胞遗传学方法多采用中期染 色体G显带分析。荧光原位杂交技术(FISH)是近年来发展起来的一种分子细胞遗传学新技术 ，用特殊的荧光素标记DNA探针，在染色体标本上进行DNA杂交，以检测细胞内DNA特定序列 的存在与否及存在数目的多少。随着分子生物学技术的发展及制备探针技术的提高，荧光原 位杂交技术广泛应用于临床遗传病的检测、产前诊断及其他相应学科中[1]。本文 应用X着丝粒探针、PY3.4探针及常规G显带技术对8例患者及2名正常人外周血染色体间期细 胞进行分析，以探讨FISH技术在染色体异常诊断中的价值及优越性。
1 资料与方法
, 百拇医药
1.1 临床资料
8例患者全部来自于本院遗传咨询门诊，均为外生殖器发育不全、原(继)发闭经、无精子等 病因前来就诊，临床资料见第380页表1。
1.2 方法
1.2.1 中期分裂相G显带分析：外周血培养及G显带分析按常规方法进行。每例患者及正 常男女对照均分析30个分裂相，统计染色体的数目，分析其形态。
1.2.2 探针的制备：X、Y染色体特异区域探针均购自医科院基础所医学遗传室，采用缺 口平移法，按GIBLO BRL公司提供的方法，以biotin-14-dATP标记探针。
1.2.3 荧光原位杂交[2]：杂交总体系为10 μL，取杂交液10 μL加入 已标记好的探针中，混匀，将探针混合液于75 ℃变性5 min，立即冰浴10 min。将玻片于50 ℃老化至少1 h，以70%、90%、100%系列乙醇脱水，于72 ℃ 70%甲酰胺/2XSSC变性2 min， 放入上述梯度的系列冰醇各5 min，晾干。将探针滴于相应玻片，置杂交盒37 ℃过夜(15～1 7 h)。
, 百拇医药
表1 8例患者及2名正常人临床资料、染色体核型 及FISH结果 编号
年龄
社会性别
临床资料
常规G显带核型
FISH染色体类型
1
23
女
正常
46，XX
46，XX
, 百拇医药
2
27
男
正常
46，XY
46，XY
3
11
女
身高1.37 cm，智低，乳距宽，后发髻低，有蹼颈，肘外翻
45，X0
45，X0
4
, 百拇医药
25
女
继发闭经，乳房、外生殖器发育尚可
46，XX/45,X0
46，XX/45,X 0
5
17
女
原发闭经，身高1.3 m， 乳房不发育，乳距宽，外阴幼女型，后发髻低，蹼颈，肘外翻
46，Xi(X q)
46，Xi(Xq)
, 百拇医药 6
17
女
原发闭经，腭高尖，身高1 .25 cm，乳房不发育，外阴幼女
型，无阴毛，后发髻低，肘外翻
45 ，X0/46,Xi(Xq)
45，X0/46,Xi(Xq)
7
27
女
原发闭经，身高1.54 m， 乳房发育，外阴发育尚可，阴毛
, http://www.100md.com 稀少，宫体4 cm×3 cm
45，X0/47XXX
45，X0/47XXX
8
18
男
无喉结，无胡须，乳房大( 似女性)，外生殖器正常，小睾
丸
47，XXY
47，XXY
9
30
, 百拇医药
男
无精症，外生殖器正常，睾丸较小，有喉结
47，XXY
47，XXY
10
4
男
外生殖器发育异常，阴茎( 蒂)肥大，阴茎后可见尿道口
缝隙
46，XX
46，XX
1.2.4 洗脱及免疫荧光放大：将杂交后的片子去掉封胶，依次放入41～45 ℃的50%的甲 酰胺/2XSSC洗涤4次，1 XSSC中洗涤3次，每次5 min，取出后在2 XSSC中室温轻洗一下，然 后依次在亲和素-荧光素(FITC-avidin)、抗亲和素(anti-avidin)、亲和素-荧光素(FIT C-avidin)中各孵育40 min，进行杂交信号的检测与放大，每次孵育后各用洗脱剂(4XSSC/0 .1%Tween20)洗涤3次，每次5 min。PI复染，封片。
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2 结 果
8例患者及2名正常人G显带分析及FISH结果见表1和图1～6。
图1 正常男性标本，用Y探针杂交中期分裂相Y染色体显示荧光，间期细胞核发1点荧光。
图2 正常女性标本，用X探针杂交中期分裂相有2条X染色体着丝粒显示荧光，间期细胞核发2点荧光
图3 45,XO期分裂相，仅一条X染色体着丝粒显示荧光
, 百拇医药
图4 46,Xi(Xq)中期分裂相，有2个黄色染交信号
图5 46,XX/45,XO嵌合体间期细胞杂交信号,细胞均显示1或2个杂交信号
图6 45，XO/47,XXX嵌合体杂交信号，中期分裂相中有3条X染色体
显示黄色荧光，间期细胞核发1点荧光
3 讨 论
对于染色体异常的诊断，传统的细胞遗传学方法往往采用细胞培养与染色体显带分析法，该 法所得结果的可靠性取决于收获的中期分裂相的数量，染色体分散和显带的质量。90年代以 后，随着分子生物学技术的提高以及向各学科的渗透，出现了一种运用分子手段分析染色体 异常的方法，即：荧光原位杂交(FISH)技术，该技术不仅可用于中期分裂相，还可在间期细 胞显示杂交信号，尤其适用于那些常规显带难以识别的染色体微小缺失与异常，是一种非常 有用的分子细胞遗传学新技术。本文利用XY染色体特殊区域探针对8例患者及2名正常人外周 血细胞进行染色体显带及FISH技术分析，成功地诊断出45，X0；46，XX/45，X0；45，X0/47 ，XXX；46，X，i(Xq)；47，XXY等染色体异常的病例。
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FISH与常规的染色体显带分析法相比，有以下优点：不需体外培养，对非分裂细胞即可快速 诊断，可对终末分化细胞的间期核进行检测[3，4]，见图5；能分析一部分显带染 色体技术不易分辨的异常，如某些倒位缺失复杂畸变等[5，6]，在极短的时间内可 检测大量细胞，敏感性和特异性非常高。可对那些分散不好的分裂相作出明确诊断，见图6 。
传统的细胞遗传学分析至今仍是染色体异常诊断的常规手段，而利用FISH技术可用于间期细 胞中染色体异常的分析中，故可用于罕见的嵌合体类型的确定及不需要培养的非分裂细胞中 ，可辅助及确定在传统细胞遗传学中无法区别的染色体异常病例。因此，笔者认为染色体常 规G带方法和FISH技术使用各种常用DNA探针两种方法配合，可以提高对染色体异常的诊断。
(本文图1～6见插页图第2页)
作者简介：杜梅君，女，1971年10月生，助理研究员，山西医科大学第一医院，030001
, 百拇医药
参考文献
1.刘检妤.荧光原位杂交技术的应用进展.中国优生与遗传杂志，1998， 6(3)：116
2.曾宣，赵蓉，高春生，等.用人鼠杂交细胞株探针进行染色体描绘.中 华医学遗传学杂志，1995，12(5)：295
3.Klinger K,Langes G,Shook D,et al.Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using fluoresscence in situ [ WT〗hybridization (FISH).Am J Hum Genet,1992，51(1)：55
4.Bryndorf T.Rapid detection of numerical aberrations of chromos ome 13,18 and 21 in chorionic mesenchyma.Prenat Diagn,1993,13:815
5.Daniel A.Identification of marker chromosomes in thirteen pati ents using FISH probe.Am J Med Genet,1994,53：8
6.Nancy B,Spinner Jaclyn A.Biegel,et al.46,XX,15P+documented a d up (17p) by fluorescence in situ hybrization.Am J Med Genet,1993，46：77
(收稿日期：2000-06-05), 百拇医药
单位：杜梅君(山西医科大学第一医院 030001)；化爱玲(山西医科大学第一医院 030001)；郑梅林(山西医科大学第一医院 030001)；丁琰(山西医科大学第一医院 030001)
关键词：荧光原 位杂交；核型分析；染色体异常；间期细胞
山西医药杂志000507 【 摘 要 】 目的 评价荧光原位杂交技术(FISH)在染色体异常核型分析中的应 用价值。方法 应用X着丝粒探针、Y染色体区域特异性探针(PY3.4)对8例 外生殖器及第二性征发育不全、原(继)发闭经、无精子等病因前来就诊的患者及2例正常男 、女外周血进行G显带分析及荧光原位杂交，杂交后用Olympus BX60荧光显微镜观察玻片并 照相。结果 FISH结果与原G显带核型一致，8例患者中1例核型为45，X0；1 例为46，XX/45，X0；1例为45，X0/47，XXX；1例为46，Xi(Xq)；1例为45，X0/46,Xi(Xq)， 诊断为先天性卵巢发育不全；2例核型为47，XXY，诊断为先天性睾丸发育不全；1例生殖器 为男性的患者核型为46，XX，诊断为性反转。结论 FISH技术可用于染色体 异常的分析，能分析一些显带技术不易分辨的异常。由于FISH技术在间期细胞中显示杂交信 号，在极短的时间内可检测大量细胞，对于一些中期分裂相有限、分散不好的染色体以及那 些不易发现的嵌合体等方面，有重要的应用价值。
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Application of FISH technique to the analysis of chromosome abe rration
Du Meijun,Hua Ailing,Zheng Meilin,et al
(The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan,030001,China)
【 Abstract 】 Objective In order to find the application valu e of FISH (fluorescence in situ hybridization) in chromosome abn ormalities analysis.Methods Fluorescence in situ hybridization using X alpha satellite,Y (PY3.4) probe labeled with biotin and karyotype analysis were made in two normal persons and 8 cases of dysgenitalism. Results The result of FISH was consistent with G-banding.Conclusion FISH is very useful for chromosome aberration study,especia lly for interphase cell and very small portions of chromosome aberration which t hrough G-banding can′t be found.
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【 Key words 】 Fluorescence in situ hybridizatio n； Karyotypic analysis； Chromosome abnormalities; Interphase cell
染色体结构及数目异常是遗传病发生的主要原因之一，常规的细胞遗传学方法多采用中期染 色体G显带分析。荧光原位杂交技术(FISH)是近年来发展起来的一种分子细胞遗传学新技术 ，用特殊的荧光素标记DNA探针，在染色体标本上进行DNA杂交，以检测细胞内DNA特定序列 的存在与否及存在数目的多少。随着分子生物学技术的发展及制备探针技术的提高，荧光原 位杂交技术广泛应用于临床遗传病的检测、产前诊断及其他相应学科中[1]。本文 应用X着丝粒探针、PY3.4探针及常规G显带技术对8例患者及2名正常人外周血染色体间期细 胞进行分析，以探讨FISH技术在染色体异常诊断中的价值及优越性。
1 资料与方法
, 百拇医药
1.1 临床资料
8例患者全部来自于本院遗传咨询门诊，均为外生殖器发育不全、原(继)发闭经、无精子等 病因前来就诊，临床资料见第380页表1。
1.2 方法
1.2.1 中期分裂相G显带分析：外周血培养及G显带分析按常规方法进行。每例患者及正 常男女对照均分析30个分裂相，统计染色体的数目，分析其形态。
1.2.2 探针的制备：X、Y染色体特异区域探针均购自医科院基础所医学遗传室，采用缺 口平移法，按GIBLO BRL公司提供的方法，以biotin-14-dATP标记探针。
1.2.3 荧光原位杂交[2]：杂交总体系为10 μL，取杂交液10 μL加入 已标记好的探针中，混匀，将探针混合液于75 ℃变性5 min，立即冰浴10 min。将玻片于50 ℃老化至少1 h，以70%、90%、100%系列乙醇脱水，于72 ℃ 70%甲酰胺/2XSSC变性2 min， 放入上述梯度的系列冰醇各5 min，晾干。将探针滴于相应玻片，置杂交盒37 ℃过夜(15～1 7 h)。
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表1 8例患者及2名正常人临床资料、染色体核型 及FISH结果 编号
年龄
社会性别
临床资料
常规G显带核型
FISH染色体类型
1
23
女
正常
46，XX
46，XX
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2
27
男
正常
46，XY
46，XY
3
11
女
身高1.37 cm，智低，乳距宽，后发髻低，有蹼颈，肘外翻
45，X0
45，X0
4
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25
女
继发闭经，乳房、外生殖器发育尚可
46，XX/45,X0
46，XX/45,X 0
5
17
女
原发闭经，身高1.3 m， 乳房不发育，乳距宽，外阴幼女型，后发髻低，蹼颈，肘外翻
46，Xi(X q)
46，Xi(Xq)
, 百拇医药 6
17
女
原发闭经，腭高尖，身高1 .25 cm，乳房不发育，外阴幼女
型，无阴毛，后发髻低，肘外翻
45 ，X0/46,Xi(Xq)
45，X0/46,Xi(Xq)
7
27
女
原发闭经，身高1.54 m， 乳房发育，外阴发育尚可，阴毛
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45，X0/47XXX
45，X0/47XXX
8
18
男
无喉结，无胡须，乳房大( 似女性)，外生殖器正常，小睾
丸
47，XXY
47，XXY
9
30
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男
无精症，外生殖器正常，睾丸较小，有喉结
47，XXY
47，XXY
10
4
男
外生殖器发育异常，阴茎( 蒂)肥大，阴茎后可见尿道口
缝隙
46，XX
46，XX
1.2.4 洗脱及免疫荧光放大：将杂交后的片子去掉封胶，依次放入41～45 ℃的50%的甲 酰胺/2XSSC洗涤4次，1 XSSC中洗涤3次，每次5 min，取出后在2 XSSC中室温轻洗一下，然 后依次在亲和素-荧光素(FITC-avidin)、抗亲和素(anti-avidin)、亲和素-荧光素(FIT C-avidin)中各孵育40 min，进行杂交信号的检测与放大，每次孵育后各用洗脱剂(4XSSC/0 .1%Tween20)洗涤3次，每次5 min。PI复染，封片。
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2 结 果
8例患者及2名正常人G显带分析及FISH结果见表1和图1～6。
图1 正常男性标本，用Y探针杂交中期分裂相Y染色体显示荧光，间期细胞核发1点荧光。
图2 正常女性标本，用X探针杂交中期分裂相有2条X染色体着丝粒显示荧光，间期细胞核发2点荧光
图3 45,XO期分裂相，仅一条X染色体着丝粒显示荧光
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图4 46,Xi(Xq)中期分裂相，有2个黄色染交信号
图5 46,XX/45,XO嵌合体间期细胞杂交信号,细胞均显示1或2个杂交信号
图6 45，XO/47,XXX嵌合体杂交信号，中期分裂相中有3条X染色体
显示黄色荧光，间期细胞核发1点荧光
3 讨 论
对于染色体异常的诊断，传统的细胞遗传学方法往往采用细胞培养与染色体显带分析法，该 法所得结果的可靠性取决于收获的中期分裂相的数量，染色体分散和显带的质量。90年代以 后，随着分子生物学技术的提高以及向各学科的渗透，出现了一种运用分子手段分析染色体 异常的方法，即：荧光原位杂交(FISH)技术，该技术不仅可用于中期分裂相，还可在间期细 胞显示杂交信号，尤其适用于那些常规显带难以识别的染色体微小缺失与异常，是一种非常 有用的分子细胞遗传学新技术。本文利用XY染色体特殊区域探针对8例患者及2名正常人外周 血细胞进行染色体显带及FISH技术分析，成功地诊断出45，X0；46，XX/45，X0；45，X0/47 ，XXX；46，X，i(Xq)；47，XXY等染色体异常的病例。
, http://www.100md.com
FISH与常规的染色体显带分析法相比，有以下优点：不需体外培养，对非分裂细胞即可快速 诊断，可对终末分化细胞的间期核进行检测[3，4]，见图5；能分析一部分显带染 色体技术不易分辨的异常，如某些倒位缺失复杂畸变等[5，6]，在极短的时间内可 检测大量细胞，敏感性和特异性非常高。可对那些分散不好的分裂相作出明确诊断，见图6 。
传统的细胞遗传学分析至今仍是染色体异常诊断的常规手段，而利用FISH技术可用于间期细 胞中染色体异常的分析中，故可用于罕见的嵌合体类型的确定及不需要培养的非分裂细胞中 ，可辅助及确定在传统细胞遗传学中无法区别的染色体异常病例。因此，笔者认为染色体常 规G带方法和FISH技术使用各种常用DNA探针两种方法配合，可以提高对染色体异常的诊断。
(本文图1～6见插页图第2页)
作者简介：杜梅君，女，1971年10月生，助理研究员，山西医科大学第一医院，030001
, 百拇医药
参考文献
1.刘检妤.荧光原位杂交技术的应用进展.中国优生与遗传杂志，1998， 6(3)：116
2.曾宣，赵蓉，高春生，等.用人鼠杂交细胞株探针进行染色体描绘.中 华医学遗传学杂志，1995，12(5)：295
3.Klinger K,Langes G,Shook D,et al.Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using fluoresscence in situ [ WT〗hybridization (FISH).Am J Hum Genet,1992，51(1)：55
4.Bryndorf T.Rapid detection of numerical aberrations of chromos ome 13,18 and 21 in chorionic mesenchyma.Prenat Diagn,1993,13:815
5.Daniel A.Identification of marker chromosomes in thirteen pati ents using FISH probe.Am J Med Genet,1994,53：8
6.Nancy B,Spinner Jaclyn A.Biegel,et al.46,XX,15P+documented a d up (17p) by fluorescence in situ hybrization.Am J Med Genet,1993，46：77
(收稿日期：2000-06-05), 百拇医药