HPLC法对不同来源红曲中洛伐他汀的定量分析
作者：宋洪涛 宓鹤鸣** 郭 涛 吴 伟** 储文功**
单位：沈阳军医总医院药剂科(110015)；**上海第二军医大学药学院
关键词：红曲；洛伐他汀；HPLC
中草药/990209摘 要 采用硅胶柱预处理-HPLC对自制红曲H-18及市售红曲中的洛伐他汀进行了定量分析，线性范围0.65～57.2 μg/mL，r＝0.9999，加样回收率为96.4%，RSD＝3.68%。结果表明，各地产红曲商品药材中有7种洛伐他汀未测出或只有痕量，5种含量甚微(0.088～0.551 μg/g生药)，而自制红曲H-18的洛伐他汀含量最高，达5 μg/g生药。
Determination of Lovastatin in Hongqu from Various Sources by HPLC
, 百拇医药
Song Hongtao, Mi Heming, Guo Tao, et al.
(Pharmaceutical Department of Shenyang Military Region General Hospital, Shenyang 110015)
Abstract Hongqu, a well known TCM prepared by fermenting rice with Monascus purpureus Went (Monascaceae), used for the promotion of blood circulation and to resolve blood stasis, was speculated to contain some “statins”. Pretreatment-HPLC is applied to determine lovastatin in Hongqu H-18 made in our own laboratory and some other commercially available Hongqu samples. The standard curve is linear in the concentration range of 0.65～57.2 μg/mL, the correlation coefficient is 0.9999. The average recovery rate is 96.4% and relative standard deviation 3.68% (n＝5). The results showed that Hongqu from different commercial sources contain no or only a small amount of lovastatin (0.088～0.551 μg/g)，but amounted to almost 5 μg/g in Hongqu H-18
, 百拇医药
Key words Hongqu lovastatin HPLC
红曲是一味传统中药，具有活血化瘀、健脾消食之功效，中医传统用于治疗食积饱胀、瘀滞腹痛等症〔1〕。日本于80年代中期发现红曲霉属真菌中有些菌种可产生洛伐他汀类似物，此类物质为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的特异性抑制剂，被认为是当前最有前途的血脂调节药物〔2〕。我国传统中药红曲中该类成分的含量如何，至今还未见有报道，为此我们以洛伐他汀为标准对照，采用硅胶柱预处理-HPLC法对不同产地的红曲商品药材及我们诱变育种得到的红曲霉菌种制备的新红曲H-18进行了定量分析。
1 仪器与试药
Waters 6高效液相色谱仪，510泵、486UV检测器；试剂均为分析纯及色谱纯；硅胶H(青岛海洋化工厂)；洛伐他汀对照品(美国默莎东大药厂)。13种红曲样品来源和产地见表1。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱住：Nova-pak，C18(4.6 mm×250 mm，粒径6 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(60∶30∶10)；流速：1.2 mL/min；紫外检测波长：237 nm；满量程吸收度：0.01 AUFS。
2.2 标准曲线的绘制：精密称取洛伐他汀对照品5.20 mg，用流动相溶解并定容至100 mL，分别精密量取适量，用流动相逐级稀释成0.65、1.30、2.60、5.20、15.6、26.0、36.4、46.8、57.2 μg/mL的对照品溶液，分别吸取25 μg，注入色谱仪中测定。以洛伐他汀峰面积(Y)对浓度(X，μg/mL)作图，得一直线，其回归方程为：Y＝2455+70361X,r＝0.9999。洛伐他汀在0.65～57.2 μg/mL浓度范围内线性关很良好。
表1 13种红曲样品来源和产地 编号
, 百拇医药
来 源
产 地
H-01
淄博市药材公司
山东周村
H-02
武汉市药材公司
不详
H-03
长沙市药材公司
不详
H-04
江阴市药材公司
, 百拇医药
江苏江阴
H-05
永康市药材公司
浙江永康
H-06
福州市药材公司
福建古田
H-07
广州市药材公司
广东蕉岭
H-08
上海市药材公司
广东五华
, 百拇医药
H-09
石家庄市药材公司
不详
H-10
南京市长江南北货商店
不详
H-11
镇江市药材公司
不详
H-12
古田县药材公司
福建古田
H-18
, 百拇医药
本实验室诱变育种所得菌株
本实验室
经在粳米上发酵而成
2.3 灵敏度实验：当洛伐他订浓度为0.2 μg/mL、进样量为25 μL时，色谱图上信噪比大于4，故其最低检测量为5 ng。2.4 精密度实验：测定已知浓度的对照品溶液多份，计算所测浓度的相对标准差，结果见表2。
表2 洛伐他汀的日内、日间重现性(n＝3) 对照品浓度
(μg/mL)
RSD(%)
日内
日间
, 百拇医药 2.6
2.54
2.93
26.0
1.35
1.48
57.2
1.29
1.37
2.5 加样回收率实验：精密称取洛伐他汀对照品0.52 mg与红曲H-18 10 g混合均匀，按样品测定法测定，计算加样回收率，测得5次平均回收率为96.4%，RSD为3.68%。
2.6 样品测定：样品于60℃烘干24 h，粉碎过60目筛，取10 g，精密称定，置索氏提取器中用无水乙醇回流提取6 h，提取液浓缩成浸膏样，用硅胶H 2 g拌样，60℃烘干12 h，上硅胶H层析柱，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)低压洗脱，收集含有洛伐他汀区段的洗脱液，浓缩近干，用适量无水乙醇溶解，过滤，滤液置于1 mL容量瓶内，加无水乙醇至刻度，摇匀即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液25 μL，注入色谱仪中测试，记录峰面积，结果见表3和图1。表3 样品中洛伐他汀含量测定结果(n＝3) 样品编号
, http://www.100md.com
平均含量(μg/g)
RSD(%)
H-01
痕量
-
H-02
0.145
4.51
H-03
0.213
4.15
H-04
0.551
, 百拇医药
3.34
H-05
0
-
H-06
0
-
H-07
痕量
-
H-08
0.088
6.21
, http://www.100md.com H-09
痕量
-
H-10
0.382
4.27
H-11
痕量
-
H-12
0
-
H-18
, 百拇医药 4.997
2.12
A-洛伐他汀 B-红曲
图1 洛伐他汀和红曲供试品HPLC图
3 讨论
3.1 红曲置索氏提取器中依次用石油醚、氯仿、乙醇回流提取6 h，结果发现：红曲的石油醚、乙醇提取液中均含有少量洛伐他汀，可见在石油醚中，红曲中其它物质对洛伐他汀有助溶作用〔3〕；红曲中可能由于含有大量多糖、蛋白质等物质，加之氯仿对药材组织的渗透润湿作用低，致使用氯仿不能提取完全；又取红曲适量置索氏提取器中用乙醇回流提取6 h，残渣烘干12 h，再用氯仿提取6 h，未发现氯仿提取液中含有洛伐他汀，可见单用乙醇提取是比较完全的。
, 百拇医药
3.2 红曲的氯仿、乙醇提取液均含有大量杂质，又因其洛伐他汀含量甚微，提取液难以浓缩至适宜浓度，故我们采用乙醇提取物浓缩成浸膏样上硅胶H柱再洗脱的办法，以去除大量的极性极弱及强极杂质。加样回收率实验证明，此方法是可行的。
3.3 我们曾用薄层层离-紫外光谱法和薄层扫描法对红曲中洛伐他汀进行定量分析，误差大，而HPLC法灵敏、重现性较好，可适用于红曲中洛伐他汀的定量分析。
3.4 本研究采用HPLC法测定不同产地红曲中的洛伐他汀含量。结果表明，各地红曲虽然均为紫红曲霉菌接种于大米上发酵而成，但其洛伐他汀的含量差异颇大。这可能与菌株不同及发酵条件不同有关。我们通过诱变育种得到的紫红曲霉变异菌株(Monascus purpureus MS18)制备的新红曲H-18中洛伐他汀含量(4.997 μg/g生药)远高于各地产红曲商品药材。
*Address:Song Hongtao ,Department of Pharmacy,Shenyang Military Region Gegion General Hospital ,Shenyang.
, 百拇医药
作者简介：宋洪涛 男，硕士，主管药师。1989年毕业于上海第二军医大学药学系，现于沈阳药科大学攻读药剂学博士学位，主要从事于“中药复方的速释及缓释制剂研究”，已表论文20余篇，参编著作2部，获军队科技进步奖2项，辽宁省科技进步奖1项。
参 考 文 献
[1] 江苏新医学院编.中药大辞典.第一版.上海：上海人民出版社，1997：991
[2] Shigenori N, et al.J Antibiotics, 1986,64(6):509
[3] Endo A.J Antibiotics, 1979,32:852
(1998-05-04收稿), 百拇医药(宋洪涛 宓鹤鸣** 郭 涛 吴 伟** 储文功**)
单位：沈阳军医总医院药剂科(110015)；**上海第二军医大学药学院
关键词：红曲；洛伐他汀；HPLC
中草药/990209摘 要 采用硅胶柱预处理-HPLC对自制红曲H-18及市售红曲中的洛伐他汀进行了定量分析，线性范围0.65～57.2 μg/mL，r＝0.9999，加样回收率为96.4%，RSD＝3.68%。结果表明，各地产红曲商品药材中有7种洛伐他汀未测出或只有痕量，5种含量甚微(0.088～0.551 μg/g生药)，而自制红曲H-18的洛伐他汀含量最高，达5 μg/g生药。
Determination of Lovastatin in Hongqu from Various Sources by HPLC
, 百拇医药
Song Hongtao, Mi Heming, Guo Tao, et al.
(Pharmaceutical Department of Shenyang Military Region General Hospital, Shenyang 110015)
Abstract Hongqu, a well known TCM prepared by fermenting rice with Monascus purpureus Went (Monascaceae), used for the promotion of blood circulation and to resolve blood stasis, was speculated to contain some “statins”. Pretreatment-HPLC is applied to determine lovastatin in Hongqu H-18 made in our own laboratory and some other commercially available Hongqu samples. The standard curve is linear in the concentration range of 0.65～57.2 μg/mL, the correlation coefficient is 0.9999. The average recovery rate is 96.4% and relative standard deviation 3.68% (n＝5). The results showed that Hongqu from different commercial sources contain no or only a small amount of lovastatin (0.088～0.551 μg/g)，but amounted to almost 5 μg/g in Hongqu H-18
, 百拇医药
Key words Hongqu lovastatin HPLC
红曲是一味传统中药，具有活血化瘀、健脾消食之功效，中医传统用于治疗食积饱胀、瘀滞腹痛等症〔1〕。日本于80年代中期发现红曲霉属真菌中有些菌种可产生洛伐他汀类似物，此类物质为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的特异性抑制剂，被认为是当前最有前途的血脂调节药物〔2〕。我国传统中药红曲中该类成分的含量如何，至今还未见有报道，为此我们以洛伐他汀为标准对照，采用硅胶柱预处理-HPLC法对不同产地的红曲商品药材及我们诱变育种得到的红曲霉菌种制备的新红曲H-18进行了定量分析。
1 仪器与试药
Waters 6高效液相色谱仪，510泵、486UV检测器；试剂均为分析纯及色谱纯；硅胶H(青岛海洋化工厂)；洛伐他汀对照品(美国默莎东大药厂)。13种红曲样品来源和产地见表1。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱住：Nova-pak，C18(4.6 mm×250 mm，粒径6 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(60∶30∶10)；流速：1.2 mL/min；紫外检测波长：237 nm；满量程吸收度：0.01 AUFS。
2.2 标准曲线的绘制：精密称取洛伐他汀对照品5.20 mg，用流动相溶解并定容至100 mL，分别精密量取适量，用流动相逐级稀释成0.65、1.30、2.60、5.20、15.6、26.0、36.4、46.8、57.2 μg/mL的对照品溶液，分别吸取25 μg，注入色谱仪中测定。以洛伐他汀峰面积(Y)对浓度(X，μg/mL)作图，得一直线，其回归方程为：Y＝2455+70361X,r＝0.9999。洛伐他汀在0.65～57.2 μg/mL浓度范围内线性关很良好。
表1 13种红曲样品来源和产地 编号
, 百拇医药
来 源
产 地
H-01
淄博市药材公司
山东周村
H-02
武汉市药材公司
不详
H-03
长沙市药材公司
不详
H-04
江阴市药材公司
, 百拇医药
江苏江阴
H-05
永康市药材公司
浙江永康
H-06
福州市药材公司
福建古田
H-07
广州市药材公司
广东蕉岭
H-08
上海市药材公司
广东五华
, 百拇医药
H-09
石家庄市药材公司
不详
H-10
南京市长江南北货商店
不详
H-11
镇江市药材公司
不详
H-12
古田县药材公司
福建古田
H-18
, 百拇医药
本实验室诱变育种所得菌株
本实验室
经在粳米上发酵而成
2.3 灵敏度实验：当洛伐他订浓度为0.2 μg/mL、进样量为25 μL时，色谱图上信噪比大于4，故其最低检测量为5 ng。2.4 精密度实验：测定已知浓度的对照品溶液多份，计算所测浓度的相对标准差，结果见表2。
表2 洛伐他汀的日内、日间重现性(n＝3) 对照品浓度
(μg/mL)
RSD(%)
日内
日间
, 百拇医药 2.6
2.54
2.93
26.0
1.35
1.48
57.2
1.29
1.37
2.5 加样回收率实验：精密称取洛伐他汀对照品0.52 mg与红曲H-18 10 g混合均匀，按样品测定法测定，计算加样回收率，测得5次平均回收率为96.4%，RSD为3.68%。
2.6 样品测定：样品于60℃烘干24 h，粉碎过60目筛，取10 g，精密称定，置索氏提取器中用无水乙醇回流提取6 h，提取液浓缩成浸膏样，用硅胶H 2 g拌样，60℃烘干12 h，上硅胶H层析柱，以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)低压洗脱，收集含有洛伐他汀区段的洗脱液，浓缩近干，用适量无水乙醇溶解，过滤，滤液置于1 mL容量瓶内，加无水乙醇至刻度，摇匀即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液25 μL，注入色谱仪中测试，记录峰面积，结果见表3和图1。表3 样品中洛伐他汀含量测定结果(n＝3) 样品编号
, http://www.100md.com
平均含量(μg/g)
RSD(%)
H-01
痕量
-
H-02
0.145
4.51
H-03
0.213
4.15
H-04
0.551
, 百拇医药
3.34
H-05
0
-
H-06
0
-
H-07
痕量
-
H-08
0.088
6.21
, http://www.100md.com H-09
痕量
-
H-10
0.382
4.27
H-11
痕量
-
H-12
0
-
H-18
, 百拇医药 4.997
2.12
A-洛伐他汀 B-红曲
图1 洛伐他汀和红曲供试品HPLC图
3 讨论
3.1 红曲置索氏提取器中依次用石油醚、氯仿、乙醇回流提取6 h，结果发现：红曲的石油醚、乙醇提取液中均含有少量洛伐他汀，可见在石油醚中，红曲中其它物质对洛伐他汀有助溶作用〔3〕；红曲中可能由于含有大量多糖、蛋白质等物质，加之氯仿对药材组织的渗透润湿作用低，致使用氯仿不能提取完全；又取红曲适量置索氏提取器中用乙醇回流提取6 h，残渣烘干12 h，再用氯仿提取6 h，未发现氯仿提取液中含有洛伐他汀，可见单用乙醇提取是比较完全的。
, 百拇医药
3.2 红曲的氯仿、乙醇提取液均含有大量杂质，又因其洛伐他汀含量甚微，提取液难以浓缩至适宜浓度，故我们采用乙醇提取物浓缩成浸膏样上硅胶H柱再洗脱的办法，以去除大量的极性极弱及强极杂质。加样回收率实验证明，此方法是可行的。
3.3 我们曾用薄层层离-紫外光谱法和薄层扫描法对红曲中洛伐他汀进行定量分析，误差大，而HPLC法灵敏、重现性较好，可适用于红曲中洛伐他汀的定量分析。
3.4 本研究采用HPLC法测定不同产地红曲中的洛伐他汀含量。结果表明，各地红曲虽然均为紫红曲霉菌接种于大米上发酵而成，但其洛伐他汀的含量差异颇大。这可能与菌株不同及发酵条件不同有关。我们通过诱变育种得到的紫红曲霉变异菌株(Monascus purpureus MS18)制备的新红曲H-18中洛伐他汀含量(4.997 μg/g生药)远高于各地产红曲商品药材。
*Address:Song Hongtao ,Department of Pharmacy,Shenyang Military Region Gegion General Hospital ,Shenyang.
, 百拇医药
作者简介：宋洪涛 男，硕士，主管药师。1989年毕业于上海第二军医大学药学系，现于沈阳药科大学攻读药剂学博士学位，主要从事于“中药复方的速释及缓释制剂研究”，已表论文20余篇，参编著作2部，获军队科技进步奖2项，辽宁省科技进步奖1项。
参 考 文 献
[1] 江苏新医学院编.中药大辞典.第一版.上海：上海人民出版社，1997：991
[2] Shigenori N, et al.J Antibiotics, 1986,64(6):509
[3] Endo A.J Antibiotics, 1979,32:852
(1998-05-04收稿), 百拇医药(宋洪涛 宓鹤鸣** 郭 涛 吴 伟** 储文功**)