碳酸氢钠注射液细菌内毒素检查法的研究
作者：陈国锐 吴文光
单位：莆田市药品检验所
关键词：碳酸氢钠注射液；鲎试剂；细菌内毒素检查法；干扰试验
海峡药学990220 摘要 本文利用自配的盐酸溶液(浓盐酸∶水＝5∶100)与碳酸氢钠注射液等体积混合，排除了样品对鲎试剂的抑制作用，使得可用细菌内毒素检查法代替碳酸氢钠注射液的热原检查法。
碳酸氢钠注射液用于静脉注射，《中国药典》1995年版规定用家兔做热原检查，但该法试验条件要求较高，操作繁烦，费时费力。能否用简便快速的细菌内毒素检查法替代热原检查法，已往的报道均证实了碳酸氢钠对鲎试剂的抑制作用，无法用简单的稀释法排除干扰。本文根据鲎试验法原理并结合具体实验条件作了一些研究，采用盐酸溶液中和的办法排除了干扰，取得满意的结果，现报道如下。
1 实验材料
, http://www.100md.com
细菌内毒素国家标准品(中国药品生物制品检定所，批号981，规格9000 EU/支)；鲎试剂(均由福州东方鲎试剂厂提供，规格0.1 ml/支)；细菌内毒素检查用水(福州东方鲎试剂厂，批号990205，内毒素含量<0.03 EU/ml，规格2 ml/支，下文简称BET水)；碳酸氢钠注射液(样品1：连云港正大天晴制药有限公司，批号9809301；样品2：安徽省阜阳制药厂，批号981207；样品3：莆田市医院制剂室，批号990316；以上规格均为250 ml：12.5 g，热原检查均符合规定，临床使用无不良反应)；浓盐酸(三明市三元化学试剂厂，批号970714，规格500 ml/瓶，含HCl36%～38%，化学纯)；氢氧化钠(蚌埠电化试剂厂，批号970803，规格500 g/瓶，分析纯)。SZK-202净化工作台(蚌埠绝缘材料厂)；ZD-2酸度计(上海第二分析仪器厂)；XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；定量加液器(上海金林生化试剂仪器厂，经用BET水比对，各档误差均在1.0%以内)。其余玻璃器具均按规定方法[1]处理。
, 百拇医药
2 试验方法及结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核 结果(见表1)。
表1 鲎试剂灵敏度复核结果 鲎试剂批号
标示值λb(EU/ml)
测定值λc(EU/ml)
标准差s
990126
0.5
0.5
0
990204
, 百拇医药
0.5
0.707
0.174
990412
0.5
0.5
0
990118
0.25
0.25
0
990310
0.125
, 百拇医药
0.125
0
2.2 盐酸溶液浓度确定 碳酸氢钠与盐酸反应生成中性的氯化钠和水并放出二氧化碳。为方便使用，拟定样品与盐酸液等体积混合后检测，相当于样品被2倍稀释，这时选择鲎试剂较为容易。经计算，浓盐酸(37%)∶水＝5∶95(V/V)的盐酸溶液与等体积5%碳酸氢钠注射液正好中和完全，为防止极限状况下混合液过份偏酸而超出鲎试剂的缓冲能力范围，本实验配制浓盐酸∶水＝5∶100(V/V)的盐酸溶液(下文简称酸液)。测定各批样品与酸液等体积混合前后的pH值，同时测定了各样品的含量，结果(见表2)，证明了酸液浓度是合适的。
表2 样品含量及混合前后pH值 样品编号
含量(标%)
混合前pH值
, http://www.100md.com
混合后pH值
样品1
100.8
8.06
7.14
样品2
99.0
8.02
5.12
样品3
98.4
8.24
4.48
, http://www.100md.com
2.3 自配酸液的阳性、阴性试验 取用BET水溶解的饱和氢氧化钠溶液0.15 ml置试管中，加入用BET水稀释10倍的酚酞指示液0.05 ml，再加BET水4.8 ml配成碱液。取浓盐酸0.25 ml加5 mlBET水配成酸液，缓缓加入上述碱液中至浅红色刚好消失，成为1∶1的中和液。取此中和液作为溶剂，制备2λb浓度的内毒素溶液，对各批鲎试剂进行阳性和阴性试验，每份平行做4管，阴性管保温4 h，结果(见表3)，证明自配的酸液不会引入细菌内毒素。
表3 酸碱中和液的阳性、阴性试验结果(n＝3) 鲎试剂批号
标示值λb
(EU/ml)
阳性管浓度
(EU/ml)
, 百拇医药
结
阳 性
果
阴 性
990126
0.5
1.0
4+
4-
990204
0.5
1.0
4+
, http://www.100md.com
4-
990412
0.5
1.0
4+
4-
990118
0.25
0.5
4+
4-
990310
0.125
, 百拇医药
0.25
4+
4-
2.4 干扰试验 药品细菌内毒素限值L＝K/M，静脉注射时K取5EU/ml，M＝10 ml/kg，得L＝0.5 EU/ml。试验中样品加入等体积酸液中和，相当于样品被2倍稀释，使用0.1 ml/支、λ＝0.5 EU/ml鲎试剂时，采取不加0.1 ml BET水复溶而直接加0.2 ml混合液检测，使得L值与λb值相当，具体试验设计如下：取浓盐酸0.5 ml加10 ml BET水配成酸液，取酸液10 ml与样品10 ml缓慢混合均匀，置旋涡混合器上2 min，充分混匀并排尽生成的气体。以此混合液配制含细菌内毒素0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.0625 EU/ml系列浓度的溶液对λb为0.5 EU/ml和0.25 EU/ml的鲎试剂进行干扰试验；上述系列浓度溶液经BET水2倍稀释后对λb为0.125 EU/ml的鲎试剂进行干扰试验。结果(见表4)，证明样品经酸液中和后不干扰鲎试剂的凝胶化过程。
, http://www.100md.com
表4 碳酸氢钠注射液加酸中和后干扰试验结果 样品编号
鲎试剂批号
标示值λb(EU/ml)
加BET水复溶(ml)
加系列内毒素浓度中和液(ml)
测定值λc(EU/ml)
标准差s
样品1
990126
0.5
0
, 百拇医药
0.2
0.5
0
990204
0.5
0
0.2
0.707
0.174
990412
0.5
0
0.2
, 百拇医药
0.5
0
990118
0.25
0.1
0.1
0.25
0
990310
0.125
0.1
0.1
0.125
, 百拇医药
0
样品2
990126
0.5
0
0.2
0.5
0
990204
0.5
0
0.2
0.595
, 百拇医药
0.150
990412
0.5
0
0.2
0.5
0
990118
0.25
0.1
0.1
0.25
0
, 百拇医药
990310
0.125
0.1
0.1
0.149
0.150
样品3
990126
0.5
0
0.2
0.5
0
, 百拇医药
990204
0.5
0
0.2
0.707
0.174
990412
0.5
0
0.2
0.5
0
990118
, http://www.100md.com
0.25
0.1
0.1
0.25
0
990310
0.125
0.1
0.1
0.149
0.150
2.5 检查法 根据以上实验结果，拟定样品的检查方法如下：精密吸取浓盐液0.1 ml，加BET水2 ml配成酸液。取样品1 ml置试管中，加酸液1 ml混匀，置旋涡混合器上2 min，排尽生成的气体，以此混合液作为供试品溶液，同时做供试品阳性和阴性对照，试验设计和结果(见表5)，与热原检查结果一致，证明本方法切实可行。表5 3 批 碳 酸 氢 钠 注 射 液 细 菌 内 毒 素 检 查 结 果(n＝3) 鲎试剂批号
, 百拇医药
标示值λb
(EU/ml)
加BET水复溶
(ml)
中和液稀释倍数
混合液加入量
(ml)
结果
阳性管
样品管
阴性管
990126
, 百拇医药 0.5
0
1
0.2
+--
-
990204
0.5
0
1
0.2
+--
-
990412
, 百拇医药
0.5
0
1
0.2
+--
-
990118
0.25
0.1
1
0.1
+--
-
, 百拇医药 990310
0.125
0.1
2
0.1
+--
-
3 讨论
3.1 碳酸氢钠注射液经8倍稀释仍会抑制灵敏度为0.0625 EU/ml的鲎试剂而出现假阴性[2]，有报道[3]经10倍以上稀释后不抑制λb＝0.125 EU/ml的鲎试剂，但这在实际检测中是不合理的。本文干扰试验表明，使用盐酸中和的方法是简单可行的。
, 百拇医药 3.2 碳酸氢钠与盐酸的中和反应为等摩尔数反应。合格的碳酸氢钠注射液含量为0.565 mol/L～0.625 mol/L，国标浓盐酸∶水＝5∶100的酸液含HCl为0.555 mol/L～0.585 mol/L。当两者等体积混合后，极限情况下，偏酸时混合液pH值约为2，但当样品含量(标%)达98.0% 以上时，pH值将≥3，达到鲎试剂的缓冲能力范围以内；而偏碱时，极限值为混合液仍含0.035 mol/L的碳酸氢钠，但此浓度相当于样品被稀释17倍，不会形成干扰。为防止样品含量低限和自配酸液误差较大的影响，建议在混合后用pH试纸测定一下pH值，然后酌情加入少量样品或酸液调节pH值至6.5～7.5再进行检测，保证结果的可靠性。
3.3 细菌内毒素为一种脂多糖，在浓盐酸和饱和氢氧化钠溶液中被分解破坏而失活，故在实验室中可自配酸液进行试验，表3结果也证明了这一点。如能由鲎试剂厂家配套供应含HCl0.565 mol/L的去除内毒素的酸液，那么，用细菌内毒素检查法检测碳酸氢钠注射液就易如反掌了。 参考文献
1.中国药典1995年版，细菌内毒素检查法；二部，1995；附录76
2.林朝阳等：碳酸氢钠注射液细菌内毒素检查法的初步研究 海峡药学 1998；10(4)：18
3.赵晓萌等：鲎试剂用于细菌内毒素检测碳酸氢钠注射液的研究 中国药学杂志 1999；34(2)：116, 百拇医药
单位：莆田市药品检验所
关键词：碳酸氢钠注射液；鲎试剂；细菌内毒素检查法；干扰试验
海峡药学990220 摘要 本文利用自配的盐酸溶液(浓盐酸∶水＝5∶100)与碳酸氢钠注射液等体积混合，排除了样品对鲎试剂的抑制作用，使得可用细菌内毒素检查法代替碳酸氢钠注射液的热原检查法。
碳酸氢钠注射液用于静脉注射，《中国药典》1995年版规定用家兔做热原检查，但该法试验条件要求较高，操作繁烦，费时费力。能否用简便快速的细菌内毒素检查法替代热原检查法，已往的报道均证实了碳酸氢钠对鲎试剂的抑制作用，无法用简单的稀释法排除干扰。本文根据鲎试验法原理并结合具体实验条件作了一些研究，采用盐酸溶液中和的办法排除了干扰，取得满意的结果，现报道如下。
1 实验材料
, http://www.100md.com
细菌内毒素国家标准品(中国药品生物制品检定所，批号981，规格9000 EU/支)；鲎试剂(均由福州东方鲎试剂厂提供，规格0.1 ml/支)；细菌内毒素检查用水(福州东方鲎试剂厂，批号990205，内毒素含量<0.03 EU/ml，规格2 ml/支，下文简称BET水)；碳酸氢钠注射液(样品1：连云港正大天晴制药有限公司，批号9809301；样品2：安徽省阜阳制药厂，批号981207；样品3：莆田市医院制剂室，批号990316；以上规格均为250 ml：12.5 g，热原检查均符合规定，临床使用无不良反应)；浓盐酸(三明市三元化学试剂厂，批号970714，规格500 ml/瓶，含HCl36%～38%，化学纯)；氢氧化钠(蚌埠电化试剂厂，批号970803，规格500 g/瓶，分析纯)。SZK-202净化工作台(蚌埠绝缘材料厂)；ZD-2酸度计(上海第二分析仪器厂)；XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；定量加液器(上海金林生化试剂仪器厂，经用BET水比对，各档误差均在1.0%以内)。其余玻璃器具均按规定方法[1]处理。
, 百拇医药
2 试验方法及结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核 结果(见表1)。
表1 鲎试剂灵敏度复核结果 鲎试剂批号
标示值λb(EU/ml)
测定值λc(EU/ml)
标准差s
990126
0.5
0.5
0
990204
, 百拇医药
0.5
0.707
0.174
990412
0.5
0.5
0
990118
0.25
0.25
0
990310
0.125
, 百拇医药
0.125
0
2.2 盐酸溶液浓度确定 碳酸氢钠与盐酸反应生成中性的氯化钠和水并放出二氧化碳。为方便使用，拟定样品与盐酸液等体积混合后检测，相当于样品被2倍稀释，这时选择鲎试剂较为容易。经计算，浓盐酸(37%)∶水＝5∶95(V/V)的盐酸溶液与等体积5%碳酸氢钠注射液正好中和完全，为防止极限状况下混合液过份偏酸而超出鲎试剂的缓冲能力范围，本实验配制浓盐酸∶水＝5∶100(V/V)的盐酸溶液(下文简称酸液)。测定各批样品与酸液等体积混合前后的pH值，同时测定了各样品的含量，结果(见表2)，证明了酸液浓度是合适的。
表2 样品含量及混合前后pH值 样品编号
含量(标%)
混合前pH值
, http://www.100md.com
混合后pH值
样品1
100.8
8.06
7.14
样品2
99.0
8.02
5.12
样品3
98.4
8.24
4.48
, http://www.100md.com
2.3 自配酸液的阳性、阴性试验 取用BET水溶解的饱和氢氧化钠溶液0.15 ml置试管中，加入用BET水稀释10倍的酚酞指示液0.05 ml，再加BET水4.8 ml配成碱液。取浓盐酸0.25 ml加5 mlBET水配成酸液，缓缓加入上述碱液中至浅红色刚好消失，成为1∶1的中和液。取此中和液作为溶剂，制备2λb浓度的内毒素溶液，对各批鲎试剂进行阳性和阴性试验，每份平行做4管，阴性管保温4 h，结果(见表3)，证明自配的酸液不会引入细菌内毒素。
表3 酸碱中和液的阳性、阴性试验结果(n＝3) 鲎试剂批号
标示值λb
(EU/ml)
阳性管浓度
(EU/ml)
, 百拇医药
结
阳 性
果
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0.5
1.0
4+
4-
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0.5
1.0
4+
, http://www.100md.com
4-
990412
0.5
1.0
4+
4-
990118
0.25
0.5
4+
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990310
0.125
, 百拇医药
0.25
4+
4-
2.4 干扰试验 药品细菌内毒素限值L＝K/M，静脉注射时K取5EU/ml，M＝10 ml/kg，得L＝0.5 EU/ml。试验中样品加入等体积酸液中和，相当于样品被2倍稀释，使用0.1 ml/支、λ＝0.5 EU/ml鲎试剂时，采取不加0.1 ml BET水复溶而直接加0.2 ml混合液检测，使得L值与λb值相当，具体试验设计如下：取浓盐酸0.5 ml加10 ml BET水配成酸液，取酸液10 ml与样品10 ml缓慢混合均匀，置旋涡混合器上2 min，充分混匀并排尽生成的气体。以此混合液配制含细菌内毒素0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.0625 EU/ml系列浓度的溶液对λb为0.5 EU/ml和0.25 EU/ml的鲎试剂进行干扰试验；上述系列浓度溶液经BET水2倍稀释后对λb为0.125 EU/ml的鲎试剂进行干扰试验。结果(见表4)，证明样品经酸液中和后不干扰鲎试剂的凝胶化过程。
, http://www.100md.com
表4 碳酸氢钠注射液加酸中和后干扰试验结果 样品编号
鲎试剂批号
标示值λb(EU/ml)
加BET水复溶(ml)
加系列内毒素浓度中和液(ml)
测定值λc(EU/ml)
标准差s
样品1
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0.5
0
, 百拇医药
0.2
0.5
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样品2
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0.25
0.1
0.1
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, 百拇医药
990310
0.125
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0.1
0.149
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样品3
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990204
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0.25
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0.1
0.1
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0.150
2.5 检查法 根据以上实验结果，拟定样品的检查方法如下：精密吸取浓盐液0.1 ml，加BET水2 ml配成酸液。取样品1 ml置试管中，加酸液1 ml混匀，置旋涡混合器上2 min，排尽生成的气体，以此混合液作为供试品溶液，同时做供试品阳性和阴性对照，试验设计和结果(见表5)，与热原检查结果一致，证明本方法切实可行。表5 3 批 碳 酸 氢 钠 注 射 液 细 菌 内 毒 素 检 查 结 果(n＝3) 鲎试剂批号
, 百拇医药
标示值λb
(EU/ml)
加BET水复溶
(ml)
中和液稀释倍数
混合液加入量
(ml)
结果
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3 讨论
3.1 碳酸氢钠注射液经8倍稀释仍会抑制灵敏度为0.0625 EU/ml的鲎试剂而出现假阴性[2]，有报道[3]经10倍以上稀释后不抑制λb＝0.125 EU/ml的鲎试剂，但这在实际检测中是不合理的。本文干扰试验表明，使用盐酸中和的方法是简单可行的。
, 百拇医药 3.2 碳酸氢钠与盐酸的中和反应为等摩尔数反应。合格的碳酸氢钠注射液含量为0.565 mol/L～0.625 mol/L，国标浓盐酸∶水＝5∶100的酸液含HCl为0.555 mol/L～0.585 mol/L。当两者等体积混合后，极限情况下，偏酸时混合液pH值约为2，但当样品含量(标%)达98.0% 以上时，pH值将≥3，达到鲎试剂的缓冲能力范围以内；而偏碱时，极限值为混合液仍含0.035 mol/L的碳酸氢钠，但此浓度相当于样品被稀释17倍，不会形成干扰。为防止样品含量低限和自配酸液误差较大的影响，建议在混合后用pH试纸测定一下pH值，然后酌情加入少量样品或酸液调节pH值至6.5～7.5再进行检测，保证结果的可靠性。
3.3 细菌内毒素为一种脂多糖，在浓盐酸和饱和氢氧化钠溶液中被分解破坏而失活，故在实验室中可自配酸液进行试验，表3结果也证明了这一点。如能由鲎试剂厂家配套供应含HCl0.565 mol/L的去除内毒素的酸液，那么，用细菌内毒素检查法检测碳酸氢钠注射液就易如反掌了。 参考文献
1.中国药典1995年版，细菌内毒素检查法；二部，1995；附录76
2.林朝阳等：碳酸氢钠注射液细菌内毒素检查法的初步研究 海峡药学 1998；10(4)：18
3.赵晓萌等：鲎试剂用于细菌内毒素检测碳酸氢钠注射液的研究 中国药学杂志 1999；34(2)：116, 百拇医药