雷帕霉素产生菌突变株的遗传稳定性研究
作者：强 华 黄 捷
单位：强 华 福建医科大学微生物教研室；黄 捷 国家医药管理局 福 建 省 微生物研究所
关键词：雷帕霉素；突变株；稳定性
摘要 本文研究了雷帕霉素产生菌摘要 本文研究了雷帕霉素产生菌——吸水链霉菌FC904的高产突变株C14的性状、稳定性。C14菌株冷藏稳定性较好，存放4 ℃冰箱3个月，效价基本不变。C14变株经传代后Ⅰ型菌落减少，生产能力下降，其高产性状不稳定，需不断自然分离，进一步提高效价。
The Study on the Heredity Stability of the Mutunt
from Rapamycin Producer
Qiang Hua
, 百拇医药
(Department of Microbiology，Fujian Medical University，Fuzhou)
Huang Jie
(Institute of Microbiology，State Pharmaceutical Administration of China & Fujian Province)
Abstract The high yielding property of C14 strain——a developed rapamycin producing strain derived from Streptomyces hygroscopicus FC904 was studied.C14 strain could be stored at 4℃ for 3 months with its potency keep gcneral unchanging.The potency and the number of type I colony decreased after subculture.The high yielding property of C14 strain is not stable，and the C14 strain also needs natural selecting and further improving.
, 百拇医药
Key words Rapamycin Mutant Stability
雷帕霉素(Rapamycin，RPM)是由吸水链霉菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤作用的新型强效免疫抑制剂。在国外已被用于器官移植的抗排斥反应和某些自身免疫疾病的治疗。国家医药管理局福建省微生物研究所也开发了国产雷帕霉素F904，并开展了对RPM的生物合成及其产生菌FC904的诱变育种工作。用庆大霉素处理FC904原生质体获得一高产菌株C14，其发酵水平(HPLC测定)比亲株提高了36%。本文进一步考察了该菌株的遗传稳定性，并对其影响因素作了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 菌种 吸水链霉菌FC904及其突变株C14，白色念珠菌Candida ablicans C90。
1.2 培养基(%) 分离及斜面培养基 麦片2，琼脂2，pH 7.0～7.5；发酵培养基 葡萄糖1，可溶性淀粉1，黄豆饼粉2，酵母粉0.2，蛋白胨0.1，NaCl 0.5，MgSO\-4*7H\-2O 0.05，pH自然；生物检定培养基 葡萄糖0.5，蛋白胨0.2，pH自然。上述培养基经121 ℃灭菌后使用。
, http://www.100md.com
1.3 主要仪器 Fisher-Lilly抑菌圈测量仪，高效液相色谱仪(岛津LC-3A)，旋转式摇瓶机，高速离心机等。
1.4 发酵及效价测定 孢子斜面培养物移种入摇瓶发酵培养基(装量30 ml/250 ml三角瓶)，26 ℃振荡培养(200 rpm)72 h。发酵液用甲醇提取[1]。生物检定用白色念珠菌为检定菌，以标准曲线计算效价[2]。发酵液中的RPM真实含量用HPLC法测定。采用外标法，波长277 nm，色谱柱为YWG-C18，柱温40 ℃，流动相为甲醇∶水＝75∶25 V/V，流速1 ml/min，根据以下公式计算效价。
1.5 4 ℃冷藏时间对C14生产能力的影响 C14变株冷藏于4 ℃冰箱，定期进行发酵(每次5个摇瓶重复)。以(冷藏斜面平均效价)/(新鲜斜面效价)计算生产能力。
, 百拇医药
1.6 传代对C14变株生产能力的影响 突变株C14(F0)进行2次传代培养，获取F0，F1，F2 3代菌株分别进行发酵(每株3个摇瓶重复)，做生物检测及HPLC测定。
1.7 传代斜面菌落类型变化 将各代的斜面进行单孢子分离；刮斜面孢子少许于含少量生理盐水的三角瓶中，玻璃珠打散，无菌滤纸过滤，适当稀释后涂布于分离培养基。26 ℃培养10 d，观察菌落类型变化。
2 结 果
2.1 4 ℃冷藏斜面对突变株C14生产能力的影响 为了解C14变株斜面的使用周期，我们考察了C14变株对冷藏的稳定性。结果表明：C14变株可存放4 ℃冰箱2～3个月，随冷藏时间延长，生产能力下降(见表1)。
表1 4 ℃冷藏时间对C14变株生产能力的影响
, 百拇医药
*生产能力
(%)
新鲜
1个月
2个月
3个月
4个月
5个月
生物检测
100
102
98
95
, http://www.100md.com
84
64
HPLC
100
100
99
94
88
62
* 生产能力：冷藏斜面效价/新鲜斜面效价×100%
2.2 传代对突变株C14生产能力的影响 原生质体再生突变株C14的高产性状不稳定，传代后发酵效价明显下降，经两次传代，效价已降至出发株水平(见表2)。
, 百拇医药
表2 传代对C14变株生产能力的影响
菌株数
N
摇瓶数
N×3
生物检测
平均值(%)
HPLC测定
平均值(%)
F0
1
1×3
156
, 百拇医药
136
F1
3
3×3
143
123
F2
3
3×3
102
99
FC904
1
, http://www.100md.com
1×3
100
100
2.3 各代斜面菌落类型 传代试验表明突变株C14的高产性状不稳定，传代后生产能力下降，为分析其原因，我们观察了各代斜面的菌落类型变化。结果表明传代后生产能力下降与Ⅰ型菌落比例减少，Ⅱ、Ⅲ型菌落增加有关(见表3，4)。
表3 C14变株在传代斜面中的菌落类型
Ⅰ型
(啤酒盖型)
Ⅱ型
(扁平型)
Ⅲ型
, 百拇医药
(光秃型)
直径(mm)
3～4
4～5
5～6
菌落特点
中央隆起，周边皱褶，啤酒瓶盖状
扁平，同心圆状，有较浅的放射状皱褶
扁平，同心圆状，有较深的放射状皱褶
基丝
浅黄
浅黄
, http://www.100md.com
黄
气丝
荔肉白，丰茂
雪白，单薄
无
孢子颜色
狼烟灰
银鼠灰
无
吸水时间
(d)
12
18
, 百拇医药
无
*颜色判定根据《色谱》，科学出版社，1957
表4 C14变株传代斜面菌落类型比例
斜面Fn
生产能力(%)*
菌落类型比例(%)
HPLC测定
生物测定
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
F0
, 百拇医药
100
100
100
0
0
F1
90.4
91.6
88
12
0
F2
72.8
, 百拇医药
65.4
60
32
8
* 生产能力：Fn效价/F0效价×100%
3 讨论
在抗生素工业发酵中，生产菌株的斜面质量对发酵产量有直接影响。高产菌株常会出现菌种退化，退化的原因除了有自然变异[3]等遗传因素外环境因素(如传代，冷藏)也起很大作用。冷藏时的温度及湿度变化将影响菌种的生产能力。传代时的生命活动过程更容易使遗传基因型的分离得到体现[4]。因此，环境因素多少都将对菌株的稳定性产生影响，但各菌株受影响程度不一，越不易受环境因素影响的菌株越适合于工业生产。C14变株对冷藏的稳定性较好，可存放冰箱3个月效价基本不变。原生质体再生株C14传代后高产性状较不稳定与地中海诺卡氏菌的原生质体再生突变株，其利福霉素的高产性状不稳定相类似[5]。其原因可能有原生质体再生后的菌株易形成异核体或其它方面的基因突变导致在传代中发生分离现象。高产突变株C14是庆大霉素处理后的原生质体再生株，传代后出现菌落分离，Ⅰ型菌落减少，产量下降。因此，C14变株还需不断自然分离并进一步改良。
, 百拇医药
参考文献
1.Cheng YR，et al：Effect of amino acids on rapamycin biosynthesis by Streptomyces hygroscopicus.Appl Microbiol Biotechnol 1995；43∶1096
2.Kojima I，et al：Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus，J Ind Microbiol 1995；14∶436
3.章名春(著)：工业微生物诱变育种，北京，科学出版社，1984；47
4.陈代杰等(著)：工业微生物菌种选育与发酵控制技术，上海，上海科学技术文献出版社，1995；129
5.顾薇玲等：地中海诺卡氏菌原生质体制备，再生和利福霉素产量变化的研究 中国抗生素杂志 1988；13(4)∶270, 百拇医药
单位：强 华 福建医科大学微生物教研室；黄 捷 国家医药管理局 福 建 省 微生物研究所
关键词：雷帕霉素；突变株；稳定性
摘要 本文研究了雷帕霉素产生菌摘要 本文研究了雷帕霉素产生菌——吸水链霉菌FC904的高产突变株C14的性状、稳定性。C14菌株冷藏稳定性较好，存放4 ℃冰箱3个月，效价基本不变。C14变株经传代后Ⅰ型菌落减少，生产能力下降，其高产性状不稳定，需不断自然分离，进一步提高效价。
The Study on the Heredity Stability of the Mutunt
from Rapamycin Producer
Qiang Hua
, 百拇医药
(Department of Microbiology，Fujian Medical University，Fuzhou)
Huang Jie
(Institute of Microbiology，State Pharmaceutical Administration of China & Fujian Province)
Abstract The high yielding property of C14 strain——a developed rapamycin producing strain derived from Streptomyces hygroscopicus FC904 was studied.C14 strain could be stored at 4℃ for 3 months with its potency keep gcneral unchanging.The potency and the number of type I colony decreased after subculture.The high yielding property of C14 strain is not stable，and the C14 strain also needs natural selecting and further improving.
, 百拇医药
Key words Rapamycin Mutant Stability
雷帕霉素(Rapamycin，RPM)是由吸水链霉菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤作用的新型强效免疫抑制剂。在国外已被用于器官移植的抗排斥反应和某些自身免疫疾病的治疗。国家医药管理局福建省微生物研究所也开发了国产雷帕霉素F904，并开展了对RPM的生物合成及其产生菌FC904的诱变育种工作。用庆大霉素处理FC904原生质体获得一高产菌株C14，其发酵水平(HPLC测定)比亲株提高了36%。本文进一步考察了该菌株的遗传稳定性，并对其影响因素作了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 菌种 吸水链霉菌FC904及其突变株C14，白色念珠菌Candida ablicans C90。
1.2 培养基(%) 分离及斜面培养基 麦片2，琼脂2，pH 7.0～7.5；发酵培养基 葡萄糖1，可溶性淀粉1，黄豆饼粉2，酵母粉0.2，蛋白胨0.1，NaCl 0.5，MgSO\-4*7H\-2O 0.05，pH自然；生物检定培养基 葡萄糖0.5，蛋白胨0.2，pH自然。上述培养基经121 ℃灭菌后使用。
, http://www.100md.com
1.3 主要仪器 Fisher-Lilly抑菌圈测量仪，高效液相色谱仪(岛津LC-3A)，旋转式摇瓶机，高速离心机等。
1.4 发酵及效价测定 孢子斜面培养物移种入摇瓶发酵培养基(装量30 ml/250 ml三角瓶)，26 ℃振荡培养(200 rpm)72 h。发酵液用甲醇提取[1]。生物检定用白色念珠菌为检定菌，以标准曲线计算效价[2]。发酵液中的RPM真实含量用HPLC法测定。采用外标法，波长277 nm，色谱柱为YWG-C18，柱温40 ℃，流动相为甲醇∶水＝75∶25 V/V，流速1 ml/min，根据以下公式计算效价。
1.5 4 ℃冷藏时间对C14生产能力的影响 C14变株冷藏于4 ℃冰箱，定期进行发酵(每次5个摇瓶重复)。以(冷藏斜面平均效价)/(新鲜斜面效价)计算生产能力。
, 百拇医药
1.6 传代对C14变株生产能力的影响 突变株C14(F0)进行2次传代培养，获取F0，F1，F2 3代菌株分别进行发酵(每株3个摇瓶重复)，做生物检测及HPLC测定。
1.7 传代斜面菌落类型变化 将各代的斜面进行单孢子分离；刮斜面孢子少许于含少量生理盐水的三角瓶中，玻璃珠打散，无菌滤纸过滤，适当稀释后涂布于分离培养基。26 ℃培养10 d，观察菌落类型变化。
2 结 果
2.1 4 ℃冷藏斜面对突变株C14生产能力的影响 为了解C14变株斜面的使用周期，我们考察了C14变株对冷藏的稳定性。结果表明：C14变株可存放4 ℃冰箱2～3个月，随冷藏时间延长，生产能力下降(见表1)。
表1 4 ℃冷藏时间对C14变株生产能力的影响
, 百拇医药
*生产能力
(%)
新鲜
1个月
2个月
3个月
4个月
5个月
生物检测
100
102
98
95
, http://www.100md.com
84
64
HPLC
100
100
99
94
88
62
* 生产能力：冷藏斜面效价/新鲜斜面效价×100%
2.2 传代对突变株C14生产能力的影响 原生质体再生突变株C14的高产性状不稳定，传代后发酵效价明显下降，经两次传代，效价已降至出发株水平(见表2)。
, 百拇医药
表2 传代对C14变株生产能力的影响
菌株数
N
摇瓶数
N×3
生物检测
平均值(%)
HPLC测定
平均值(%)
F0
1
1×3
156
, 百拇医药
136
F1
3
3×3
143
123
F2
3
3×3
102
99
FC904
1
, http://www.100md.com
1×3
100
100
2.3 各代斜面菌落类型 传代试验表明突变株C14的高产性状不稳定，传代后生产能力下降，为分析其原因，我们观察了各代斜面的菌落类型变化。结果表明传代后生产能力下降与Ⅰ型菌落比例减少，Ⅱ、Ⅲ型菌落增加有关(见表3，4)。
表3 C14变株在传代斜面中的菌落类型
Ⅰ型
(啤酒盖型)
Ⅱ型
(扁平型)
Ⅲ型
, 百拇医药
(光秃型)
直径(mm)
3～4
4～5
5～6
菌落特点
中央隆起，周边皱褶，啤酒瓶盖状
扁平，同心圆状，有较浅的放射状皱褶
扁平，同心圆状，有较深的放射状皱褶
基丝
浅黄
浅黄
, http://www.100md.com
黄
气丝
荔肉白，丰茂
雪白，单薄
无
孢子颜色
狼烟灰
银鼠灰
无
吸水时间
(d)
12
18
, 百拇医药
无
*颜色判定根据《色谱》，科学出版社，1957
表4 C14变株传代斜面菌落类型比例
斜面Fn
生产能力(%)*
菌落类型比例(%)
HPLC测定
生物测定
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
F0
, 百拇医药
100
100
100
0
0
F1
90.4
91.6
88
12
0
F2
72.8
, 百拇医药
65.4
60
32
8
* 生产能力：Fn效价/F0效价×100%
3 讨论
在抗生素工业发酵中，生产菌株的斜面质量对发酵产量有直接影响。高产菌株常会出现菌种退化，退化的原因除了有自然变异[3]等遗传因素外环境因素(如传代，冷藏)也起很大作用。冷藏时的温度及湿度变化将影响菌种的生产能力。传代时的生命活动过程更容易使遗传基因型的分离得到体现[4]。因此，环境因素多少都将对菌株的稳定性产生影响，但各菌株受影响程度不一，越不易受环境因素影响的菌株越适合于工业生产。C14变株对冷藏的稳定性较好，可存放冰箱3个月效价基本不变。原生质体再生株C14传代后高产性状较不稳定与地中海诺卡氏菌的原生质体再生突变株，其利福霉素的高产性状不稳定相类似[5]。其原因可能有原生质体再生后的菌株易形成异核体或其它方面的基因突变导致在传代中发生分离现象。高产突变株C14是庆大霉素处理后的原生质体再生株，传代后出现菌落分离，Ⅰ型菌落减少，产量下降。因此，C14变株还需不断自然分离并进一步改良。
, 百拇医药
参考文献
1.Cheng YR，et al：Effect of amino acids on rapamycin biosynthesis by Streptomyces hygroscopicus.Appl Microbiol Biotechnol 1995；43∶1096
2.Kojima I，et al：Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus，J Ind Microbiol 1995；14∶436
3.章名春(著)：工业微生物诱变育种，北京，科学出版社，1984；47
4.陈代杰等(著)：工业微生物菌种选育与发酵控制技术，上海，上海科学技术文献出版社，1995；129
5.顾薇玲等：地中海诺卡氏菌原生质体制备，再生和利福霉素产量变化的研究 中国抗生素杂志 1988；13(4)∶270, 百拇医药