纸片定量法应用于棒酸的生物检定
作者：黄喜桂 林 如 陈美珍
单位：国家医药管理局 福建省微生物研究所
关键词：β-内酰胺酶；抑制剂；棒酸；生物检定
海峡药学990389 摘要 以克氏肺炎杆菌ATCC 100 31为检定菌，探讨了纸片定量法用于棒酸效价的测定结果经数理统计，符合药典要求。该方法具有操作简便，同步性好，测定误差小的优点。
The Bioassay of Clavulanic Acid by Paper Disc Assay
Huang Xigui，Linru，Chen Meizheng
(Institute of Microbiology，State Pharm aceutical Administration
, 百拇医药
of China and Fujian Province，Fuzhou)
The bioassay method of cla v ulanic acid by paper disc assay was iven with the Klebsiella Pneumoniae ATCC1003 1 as the testing bacterium.The results o f bioassay meet the requirements of Chin ese Pharmacopeia after drawing the stand ard curve and biostatistics processing.T he method is easy in use with good sync hronism and low determining error.It is useful in the bioassay of unstable clavu lanic acid.
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Key words β-Lactamase Inhibitor B ioassay Clavulanic Acid
棒酸是一种β-内酰胺酶抑制剂，国内现已生产并制成复合剂应用于临床。我们曾经报道了棒酸的生物检定法--杯碟法[1]。由于棒酸产生菌除了产生棒酸外，还产生其它抗菌物质，且棒酸又极不稳定，在杯碟法检测过程中，操作条件苛刻，并且测定数量有限，不能适应菌种选育中大量样品的测定工作。我们根据Kojiama等[2]报道纸片定量法测定雷帕霉素生物效价的方法。用纸片定量法(以下简称纸片法)代替杯碟法进行棒酸的效价检测。试验结果说明纸片法用于棒酸的效价测定是可行的，现报道如下。
1 实验材料
1.1 纸片的制备 采用新华3号滤纸，用打洞器打成直径6mm的圆纸片，烤干备用。
, http://www.100md.com 1.2 吉尔森精密移液器P20型1支。
1.3 检定菌 克氏肺炎杆菌ATCC10031(日本微生物化学研究所赠送)。
1.4 测定培养基，标准品，标准溶液的配制及双碟平板的制备按日本药典[3]进行准备。双碟平板菌层培养基中除含有适量的检定菌外，还含有青霉素钠盐8μg/ml。其它器材及操作按中国药典[4]的规定进行准备。
2 实验方法与结果
2.1 标准曲线的绘制[5] 棒酸标准品剂量(d)分别为：4.00、3.20、2.56、2.05、1.64、1.31、1.05(r/ml)，中心点浓度为2.00r/ml，剂距r＝1∶0.8。将纸片平放在玻璃平板上，用P20型吉尔森精密移液器精确吸取以上各剂量溶液6μl于纸片上，每个剂量9片以上，中心点63片以上。待纸片稍干后，分别贴在已制备好的双碟上，中心点与各剂量的纸片位置与杯碟法的位置相同。纸片放置后30min，置33℃温箱培养过夜。测量各剂量的抑菌圈直径。以抑菌圈直径的差值为横坐标，以棒酸浓度为纵坐标，在双周半对数坐标纸上标点，绘制标准曲线(见图1)。标准曲线呈良好线性关系。
, 百拇医药
图1 棒酸标准曲线
标准曲线总体回归系数β的可信限与一剂量法 按抗生素效价的数理统计方法[6]，处理各反应数据，求得直线回归方程：
＝
+b(x-
)，式中的回归系数b＝10.16，总体回归系数β的可信限范围为：β＝b±t0.05×Sb＝10.55～9.77，β的可信限率＝[(10.55-9.77)/(10.16×2)]×100%＝3.84%，β的可信限率小于10%。因此该纸片法所作的标准曲线是正确有效的。一剂量法纸片测定的效价计算可用下式：lgR＝(YT-Ya)/b，PT＝R×AT，式中PT为样品效价，AT为样品的估计效价，b为回归系数，R为效价比值，y为抑菌圈直径。
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2.2 纸片法测定的可靠性试验 我们以已知效价为750μg/mg的棒酸样品假设为未知样品，估计效价分别为500、600、700、800、900(μg/ml)，进行纸片法测定，结果(见表1)。
表1 纸片法测定的可靠性试验结果 项 目
试 验 区 组
1
2
3
4
5
标准剂量(μg/ml)
2.0
, 百拇医药 2.0
2.0
2.0
2.0
估计效价(μg/mg)
500
600
700
800
900
双碟数(个)
3
3
, 百拇医药
3
3
3
测定效价(PT)
773
784
722
753
733
准确效价(μg/mg)
750
750
750
, 百拇医药
750
750
相对误差*(%)
3.06
4.50
3.70
0.40
2.27
相对误差＝[(准确效价-测定效价)/准确效价]×100%
表中数据显示已知效价为750μg/mg的同一样品，设定不同的估计效价进行测定，结果在722μg/mg～784μg/mg之间，测定的相对误差均小于5%，符合药典要求。
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3 小结 鉴于纸片法操作简便，节省了操作时间，使样品与标准品的同步性更好，对极不稳定的棒酸来说，可以减少测定误差，并较好地克服了检测数量受限的缺点。测定结果经数理统计，符合药典要求。可靠性试验证明纸片法测定的相对误差在5%以内，结果可靠，重现性好，该方法适用于棒酸纯品、粗品及发酵液的效价测定。
参考文献
1.黄喜桂等：棒酸的生物检定福建药学杂志1990；2(4)∶11
2.Kojima，I.etal：J Ind Microbial1995;14(6)∶436～439
3.日本抗生物质医药品基准解说 1986；5～7
4.中国药典:1985；附录62～85
5.日本抗生物质医药品基准 1986；追补13
6.郑均镛等主编：药品微生物学及检验技术，人民卫生出版社，北京，1989；375～388, http://www.100md.com
单位：国家医药管理局 福建省微生物研究所
关键词：β-内酰胺酶；抑制剂；棒酸；生物检定
海峡药学990389 摘要 以克氏肺炎杆菌ATCC 100 31为检定菌，探讨了纸片定量法用于棒酸效价的测定结果经数理统计，符合药典要求。该方法具有操作简便，同步性好，测定误差小的优点。
The Bioassay of Clavulanic Acid by Paper Disc Assay
Huang Xigui，Linru，Chen Meizheng
(Institute of Microbiology，State Pharm aceutical Administration
, 百拇医药
of China and Fujian Province，Fuzhou)
The bioassay method of cla v ulanic acid by paper disc assay was iven with the Klebsiella Pneumoniae ATCC1003 1 as the testing bacterium.The results o f bioassay meet the requirements of Chin ese Pharmacopeia after drawing the stand ard curve and biostatistics processing.T he method is easy in use with good sync hronism and low determining error.It is useful in the bioassay of unstable clavu lanic acid.
, http://www.100md.com
Key words β-Lactamase Inhibitor B ioassay Clavulanic Acid
棒酸是一种β-内酰胺酶抑制剂，国内现已生产并制成复合剂应用于临床。我们曾经报道了棒酸的生物检定法--杯碟法[1]。由于棒酸产生菌除了产生棒酸外，还产生其它抗菌物质，且棒酸又极不稳定，在杯碟法检测过程中，操作条件苛刻，并且测定数量有限，不能适应菌种选育中大量样品的测定工作。我们根据Kojiama等[2]报道纸片定量法测定雷帕霉素生物效价的方法。用纸片定量法(以下简称纸片法)代替杯碟法进行棒酸的效价检测。试验结果说明纸片法用于棒酸的效价测定是可行的，现报道如下。
1 实验材料
1.1 纸片的制备 采用新华3号滤纸，用打洞器打成直径6mm的圆纸片，烤干备用。
, http://www.100md.com 1.2 吉尔森精密移液器P20型1支。
1.3 检定菌 克氏肺炎杆菌ATCC10031(日本微生物化学研究所赠送)。
1.4 测定培养基，标准品，标准溶液的配制及双碟平板的制备按日本药典[3]进行准备。双碟平板菌层培养基中除含有适量的检定菌外，还含有青霉素钠盐8μg/ml。其它器材及操作按中国药典[4]的规定进行准备。
2 实验方法与结果
2.1 标准曲线的绘制[5] 棒酸标准品剂量(d)分别为：4.00、3.20、2.56、2.05、1.64、1.31、1.05(r/ml)，中心点浓度为2.00r/ml，剂距r＝1∶0.8。将纸片平放在玻璃平板上，用P20型吉尔森精密移液器精确吸取以上各剂量溶液6μl于纸片上，每个剂量9片以上，中心点63片以上。待纸片稍干后，分别贴在已制备好的双碟上，中心点与各剂量的纸片位置与杯碟法的位置相同。纸片放置后30min，置33℃温箱培养过夜。测量各剂量的抑菌圈直径。以抑菌圈直径的差值为横坐标，以棒酸浓度为纵坐标，在双周半对数坐标纸上标点，绘制标准曲线(见图1)。标准曲线呈良好线性关系。
, 百拇医药
图1 棒酸标准曲线
标准曲线总体回归系数β的可信限与一剂量法 按抗生素效价的数理统计方法[6]，处理各反应数据，求得直线回归方程：
＝+b(x-)，式中的回归系数b＝10.16，总体回归系数β的可信限范围为：β＝b±t0.05×Sb＝10.55～9.77，β的可信限率＝[(10.55-9.77)/(10.16×2)]×100%＝3.84%，β的可信限率小于10%。因此该纸片法所作的标准曲线是正确有效的。一剂量法纸片测定的效价计算可用下式：lgR＝(YT-Ya)/b，PT＝R×AT，式中PT为样品效价，AT为样品的估计效价，b为回归系数，R为效价比值，y为抑菌圈直径。, http://www.100md.com
2.2 纸片法测定的可靠性试验 我们以已知效价为750μg/mg的棒酸样品假设为未知样品，估计效价分别为500、600、700、800、900(μg/ml)，进行纸片法测定，结果(见表1)。
表1 纸片法测定的可靠性试验结果 项 目
试 验 区 组
1
2
3
4
5
标准剂量(μg/ml)
2.0
, 百拇医药 2.0
2.0
2.0
2.0
估计效价(μg/mg)
500
600
700
800
900
双碟数(个)
3
3
, 百拇医药
3
3
3
测定效价(PT)
773
784
722
753
733
准确效价(μg/mg)
750
750
750
, 百拇医药
750
750
相对误差*(%)
3.06
4.50
3.70
0.40
2.27
相对误差＝[(准确效价-测定效价)/准确效价]×100%
表中数据显示已知效价为750μg/mg的同一样品，设定不同的估计效价进行测定，结果在722μg/mg～784μg/mg之间，测定的相对误差均小于5%，符合药典要求。
, http://www.100md.com
3 小结 鉴于纸片法操作简便，节省了操作时间，使样品与标准品的同步性更好，对极不稳定的棒酸来说，可以减少测定误差，并较好地克服了检测数量受限的缺点。测定结果经数理统计，符合药典要求。可靠性试验证明纸片法测定的相对误差在5%以内，结果可靠，重现性好，该方法适用于棒酸纯品、粗品及发酵液的效价测定。
参考文献
1.黄喜桂等：棒酸的生物检定福建药学杂志1990；2(4)∶11
2.Kojima，I.etal：J Ind Microbial1995;14(6)∶436～439
3.日本抗生物质医药品基准解说 1986；5～7
4.中国药典:1985；附录62～85
5.日本抗生物质医药品基准 1986；追补13
6.郑均镛等主编：药品微生物学及检验技术，人民卫生出版社，北京，1989；375～388, http://www.100md.com