露水草愈伤组织分化的研究
作者：林如辉 刘美龙 甘烦远 彭丽萍 赵沛基
单位：林如辉 福建省医药职工教育培训中心；刘美龙 福建医药学校；甘烦远 彭丽萍 赵沛基 中国科学院昆明植物研究所
关键词：露水草；愈伤组织分化；红色色素
海峡药学990427 摘要 从露水草(Cyanotis arachnoidea)无菌苗的胚根及叶鞘均能诱导出愈伤组织，叶鞘愈伤组织(LC)的生长比胚根愈伤组织(RC)的快，在同一培养条件下，由LC分化成3种不同生长及生理状态的愈伤组织无性质，正常脱分化的叶鞘愈伤组织(LCD)，只分化根的愈伤组织(LCR)及产生红色色素的愈伤组织(LCP)。
露水草(Cyanotis arachnoidea)为鸭跖草科兰耳草属多年生的传统草药，其体内富含β-蜕皮激素(β-ecdysone)[1]，前文报道了露水草的愈伤组织也含有β-蜕皮激素[2]。对露水草进行组织培养的研究对解决其资源不足，保护其生长生态环境等都有一定的意义，并且可利用组织培养方法工业化大量生产露水草中的有效成分，这对开发露水草资源是很有意义。
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1 材料与方法
1.1 材料
露水草种子系中国科学院昆明植物研究所提供，由陈宗莲研究员鉴定。基本培养基为MS培养基。
1.2 方法
愈伤组织诱导及培养 露水草种子经消毒后诱导出无菌苗，将无菌苗的胚根及叶鞘等剪成0.5 cm～1.0 cm长的切段，然后放入MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L BA(I)及其它激素组合的固体培养基上诱导愈伤组织。诱导出愈伤组织与母体分离后，经选择转接到继代培养基上，继代培养基为MS+1.0 mg/L IBA+5%CM(椰子汁)。每50 ml三角瓶分装25 ml固体培养基，每三角瓶接种愈伤组织量约为0.02 g(干重)。愈伤组织诱导及培养均于26±1℃下暗中进行，培养基的pH为5.8。
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2 结果与讨论
2.1 愈伤组织的分化
前文曾提及[2]，愈伤组织培养在含较低浓度IBA的培养基上时，有少量不定根分化，对此我们进一步进行了试验。结果发现，只有在IBA浓度为0.5～1.0 mg/L时，才有少量LC(叶鞘愈伤组织)愈伤组织分化成不定根，分化率也只有25%，而在其它植物激素种类配比及不同浓度条件下，愈伤组织均未分化，RC(胚根愈伤组织)即使在LC能分化的条件下也不分化。这可能是因为愈伤组织已经继代了很长的时间，丧失了分化能力。在研究中，我们发现即使在LC能分化的条件下，仍有一种LC保持旺盛的生长能力，其生长速率与原初LC的生长速率相似，在经过5次继代后，在MS+IBA 1.0 mg/L条件下，分化的不定根继续保持分化生长，但生长速率较慢，我们把这种分化的愈伤组织命名为LCR(只分化根的愈伤组织)，其生长率为每天0.20 g/L左右。而不分化的LC，仍保持快速的生长，也不分化，命名为LCD(脱分化的叶鞘愈伤组织)。在以后的继代过程中，这两种状态的愈伤组织仍维持原状态不变。
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2.2 愈伤组织红色色素无性系的建立
LCD继代至20代时，偶然在一个三角瓶的愈伤组织中，发现一小块已变红色的愈伤组织块。其它种类的愈伤组织颜色仍保持不变。于是把这小块红色的愈伤组织单独挑出培养于与其它愈伤组织继代培养相同的培养基上，在培养中发现这小块红色的愈伤组织生长亦较快，但其底部大多仍为白色，只有愈伤组织的表面为鲜红色。在以后的继代培养中，继续把最红的愈伤组织挑出继代培养，经5次继代后，这个红色的愈伤组织无性系建立起来了，其生长率虽比不上LCD，但比LCR和LC仍快得多，为每天0.30 g/L左右。其红色色素含量经用工业乙醇提取后测定大约为10%。我们把这个红色的愈伤组织无性系称为LCP。LCP的一些特性如下：
在培养的30 d之内，愈伤组织为鲜红色，30 d之后，由于愈伤组织开始老化，颜色变为紫红色，大约40 d之后，由于愈伤组织已死亡，因此颜色变为紫黑色。红色色素在培养的15 d内，着色不很明显，20 d后急剧增加，25 d后愈伤组织基本上全部变为红色。光照可以增加红色色素的含量，但不明显。培养基中附加5%CM可以明显地产加红色素含量。
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红色色素可以溶于水、甲醇及乙醇等极性较大的溶剂，但在甲醇中易变色，在乙醇中较稳定，在光照、pH为中性条件下可以保持很长时间而不变色。经柱层析分离色素不是单一成分，其结构初步鉴定为花青素类物质。
综上所述，从露水草无菌苗诱导并经选择出的4种愈伤组织无性系其生长特性、生长速率以及一些生理状态并不完全相同，这4种愈伤组织无性系的生长速率的大小依序为LCD、LCP、LC、LCR，这些不同的愈伤组织无性系为进一步研究其生理生化特征及产物的代谢过程提供了基础。
理论上，培养细胞应具有合成与原植物相同代谢产物的“全能性”[3]，这点在多种植物培养细胞中已体现到，不少培养细胞中代谢产物的含量还要高于原植物中的含量，这也是植物细胞大量培养生产有用代谢产物的基础[4]。但是，由于代谢产物通常是由植物中特定的组织或器官产生，脱分化的培养细胞往往缺少这样的特定组织或器官，或者其次生代谢过程由于这方面的原因而不能表达。因此，在愈伤组织培养物中亦往往测定不到某些在原植物中存在的特定成分，或者即使偶尔在愈伤组织中测到代谢物，其浓度通常也是远低于植株中的，这方面也有不少例证[5]。我们对露水草进行的愈伤组织培养的研究就属于这一类。
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参考文献
1 聂珊麟等：露水草植物中蜕皮激素的分离和鉴定 化学学报 1978；36：136～141
2 林如辉等：露水草愈伤组织培养的研究 福建中医药 1999；30(4)：39
3 梁峥等：高等植物的次级代谢.植物生理学通讯，1981；(1)：14～21
4 甘烦远等：提高植物培养细胞中次级代谢产物含量的途径 植物学通讯 1991；8：14～20
5 甘烦远等：三七愈伤组织分化的研究 云南植物研究 1993；15：61～65, http://www.100md.com
单位：林如辉 福建省医药职工教育培训中心；刘美龙 福建医药学校；甘烦远 彭丽萍 赵沛基 中国科学院昆明植物研究所
关键词：露水草；愈伤组织分化；红色色素
海峡药学990427 摘要 从露水草(Cyanotis arachnoidea)无菌苗的胚根及叶鞘均能诱导出愈伤组织，叶鞘愈伤组织(LC)的生长比胚根愈伤组织(RC)的快，在同一培养条件下，由LC分化成3种不同生长及生理状态的愈伤组织无性质，正常脱分化的叶鞘愈伤组织(LCD)，只分化根的愈伤组织(LCR)及产生红色色素的愈伤组织(LCP)。
露水草(Cyanotis arachnoidea)为鸭跖草科兰耳草属多年生的传统草药，其体内富含β-蜕皮激素(β-ecdysone)[1]，前文报道了露水草的愈伤组织也含有β-蜕皮激素[2]。对露水草进行组织培养的研究对解决其资源不足，保护其生长生态环境等都有一定的意义，并且可利用组织培养方法工业化大量生产露水草中的有效成分，这对开发露水草资源是很有意义。
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1 材料与方法
1.1 材料
露水草种子系中国科学院昆明植物研究所提供，由陈宗莲研究员鉴定。基本培养基为MS培养基。
1.2 方法
愈伤组织诱导及培养 露水草种子经消毒后诱导出无菌苗，将无菌苗的胚根及叶鞘等剪成0.5 cm～1.0 cm长的切段，然后放入MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L BA(I)及其它激素组合的固体培养基上诱导愈伤组织。诱导出愈伤组织与母体分离后，经选择转接到继代培养基上，继代培养基为MS+1.0 mg/L IBA+5%CM(椰子汁)。每50 ml三角瓶分装25 ml固体培养基，每三角瓶接种愈伤组织量约为0.02 g(干重)。愈伤组织诱导及培养均于26±1℃下暗中进行，培养基的pH为5.8。
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2 结果与讨论
2.1 愈伤组织的分化
前文曾提及[2]，愈伤组织培养在含较低浓度IBA的培养基上时，有少量不定根分化，对此我们进一步进行了试验。结果发现，只有在IBA浓度为0.5～1.0 mg/L时，才有少量LC(叶鞘愈伤组织)愈伤组织分化成不定根，分化率也只有25%，而在其它植物激素种类配比及不同浓度条件下，愈伤组织均未分化，RC(胚根愈伤组织)即使在LC能分化的条件下也不分化。这可能是因为愈伤组织已经继代了很长的时间，丧失了分化能力。在研究中，我们发现即使在LC能分化的条件下，仍有一种LC保持旺盛的生长能力，其生长速率与原初LC的生长速率相似，在经过5次继代后，在MS+IBA 1.0 mg/L条件下，分化的不定根继续保持分化生长，但生长速率较慢，我们把这种分化的愈伤组织命名为LCR(只分化根的愈伤组织)，其生长率为每天0.20 g/L左右。而不分化的LC，仍保持快速的生长，也不分化，命名为LCD(脱分化的叶鞘愈伤组织)。在以后的继代过程中，这两种状态的愈伤组织仍维持原状态不变。
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2.2 愈伤组织红色色素无性系的建立
LCD继代至20代时，偶然在一个三角瓶的愈伤组织中，发现一小块已变红色的愈伤组织块。其它种类的愈伤组织颜色仍保持不变。于是把这小块红色的愈伤组织单独挑出培养于与其它愈伤组织继代培养相同的培养基上，在培养中发现这小块红色的愈伤组织生长亦较快，但其底部大多仍为白色，只有愈伤组织的表面为鲜红色。在以后的继代培养中，继续把最红的愈伤组织挑出继代培养，经5次继代后，这个红色的愈伤组织无性系建立起来了，其生长率虽比不上LCD，但比LCR和LC仍快得多，为每天0.30 g/L左右。其红色色素含量经用工业乙醇提取后测定大约为10%。我们把这个红色的愈伤组织无性系称为LCP。LCP的一些特性如下：
在培养的30 d之内，愈伤组织为鲜红色，30 d之后，由于愈伤组织开始老化，颜色变为紫红色，大约40 d之后，由于愈伤组织已死亡，因此颜色变为紫黑色。红色色素在培养的15 d内，着色不很明显，20 d后急剧增加，25 d后愈伤组织基本上全部变为红色。光照可以增加红色色素的含量，但不明显。培养基中附加5%CM可以明显地产加红色素含量。
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红色色素可以溶于水、甲醇及乙醇等极性较大的溶剂，但在甲醇中易变色，在乙醇中较稳定，在光照、pH为中性条件下可以保持很长时间而不变色。经柱层析分离色素不是单一成分，其结构初步鉴定为花青素类物质。
综上所述，从露水草无菌苗诱导并经选择出的4种愈伤组织无性系其生长特性、生长速率以及一些生理状态并不完全相同，这4种愈伤组织无性系的生长速率的大小依序为LCD、LCP、LC、LCR，这些不同的愈伤组织无性系为进一步研究其生理生化特征及产物的代谢过程提供了基础。
理论上，培养细胞应具有合成与原植物相同代谢产物的“全能性”[3]，这点在多种植物培养细胞中已体现到，不少培养细胞中代谢产物的含量还要高于原植物中的含量，这也是植物细胞大量培养生产有用代谢产物的基础[4]。但是，由于代谢产物通常是由植物中特定的组织或器官产生，脱分化的培养细胞往往缺少这样的特定组织或器官，或者其次生代谢过程由于这方面的原因而不能表达。因此，在愈伤组织培养物中亦往往测定不到某些在原植物中存在的特定成分，或者即使偶尔在愈伤组织中测到代谢物，其浓度通常也是远低于植株中的，这方面也有不少例证[5]。我们对露水草进行的愈伤组织培养的研究就属于这一类。
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参考文献
1 聂珊麟等：露水草植物中蜕皮激素的分离和鉴定 化学学报 1978；36：136～141
2 林如辉等：露水草愈伤组织培养的研究 福建中医药 1999；30(4)：39
3 梁峥等：高等植物的次级代谢.植物生理学通讯，1981；(1)：14～21
4 甘烦远等：提高植物培养细胞中次级代谢产物含量的途径 植物学通讯 1991；8：14～20
5 甘烦远等：三七愈伤组织分化的研究 云南植物研究 1993；15：61～65, http://www.100md.com