关于干热除去热原细菌内毒素标示品(ECV)的研究
作者：刘端华 王绍明
单位：刘端华(福州东方鲎试剂厂 350001)；王绍明(福州东方鲎试剂厂 350001)
关键词：内毒素标示品(ECV)；干热除热原；验证；标准曲线
海峡药学000174
摘要 细菌内毒素标示品(Endotoxin Challenge Vial，ECV)是用于干热烘箱除去细菌内毒素(热原)验证的生物活性指示剂。除去细菌内毒素是制药与生物制品工业的一个重要问题。干热法除去热原是常用的手段，其除热原的可靠性的验证是将ECV置于除热原过程中，以最终内毒素量下降对数值来判断其有效性，美国药典与欧洲药典[1，2]分别以下降3个与4个对数(3log与4log)为有效，并对其验证作了规范指南，我国至今对此尚未有具体的规范与验证标准及指导文件，也无ECV的正式产品。我们曾于1997年研制成ECV，其结果表明达到干热除去细菌内毒素验证的要求[3]。
, 百拇医药
目前，我国用于细菌内毒素检查法的细菌内毒素标准品与工作标准品，含有的赋型剂经受不住干热验证的高温烘烤而变焦、碳化等。为此我们研制出10000EU/安瓿的ECV将其置于180、250、300℃中烘烤试验，测出残留量，现将检测与过程报道如下。
1 材料与方法
1.1 细菌内毒素标示品：效价10000 EU/支，批号990701福州东方鲎试剂厂出品
1.2 定量鲎试剂盒：批号990701福州东方鲎试剂厂出品
2 制订ECV标准曲线
在进行干热去热原验证试验前都要用定量产色基质鲎试剂制订标准曲线以用其直线回归方程计算残留量与下降log值。关于定量产色基质鲎试剂操作请按试剂盒说明书。
, 百拇医药 2.1 ECV的稀释步骤如下：先将在ECV安瓿曲颈上1 cm处用小砂轮割划后用75%乙醇棉球擦干净，启开后加入1.0 ml细菌内毒素检查用水(BET水)然后均用BET水作如下连续稀释：
当ECV加入1.0 mlBET水后，须在旋涡混合器上混匀30 min，然后每稀释一步均要再混合15 s，加样时亦要再混合15 s后检测其结果(见表1)。
表1 检测结果(n＝4) EU/ml
0.03
0.06
0.125
0.25
OD545
, 百拇医药
0.113
0226
0.6073
1.2103
相关系数为0.998，其内毒素OD值最高与最低之差大于0.4合于标准曲线要求[4]。
直线方程Y＝5.0266X+0.0451，式中X为内毒素浓度，Y为读出的OD545值。
本试验按此公式计算经高温处理后ECV的内毒素残留量与下降对数单位。
3 结果
3.1 处理方法请参照王绍明报导(1997)[3]。
, http://www.100md.com
3.2 本试验处理温度为180、170、160、150℃分别以120、100、80、60 min处理。
以120 min干热处理结果为例
温度 ℃ 180° 170° 160° 150°
残留量 EU/m l0.01 132.500 54.00 372.76
下降对数lg 5.9469 3.6020 3.3010 1.4286
残留量降解对数计算，例示以180°120′
ECV原有内毒素含量10000EU＝log4，处理后内毒素残留量为0.0113即log为-1.9469，其下降log为4-(-1.9469)＝5.9469。
, 百拇医药
3.3 本ECV的D值与Z值 按文献报道[5]内毒素干热灭活过程和干热灭菌过程(Dry Heat Sterilization)有一定相似，所以，国外将干灭菌中微生物死亡动力应用于内毒素失活上，建立起数学模型，求出相应的D值(即单位对数失活时间)和Z值即灭活温度示数[6]。我们以此计算结果如下：
温度180、170、160、150℃其D值分别为20.18、33.14、52.15、84.0。其Z值为48.49也是符合国外报道Z值在30℃～50℃之间。
3.4 几个干热高温处理ECV试验 3.4.1 取ECV各4支放于加盖玻璃培养皿，将其按放在烘箱四角与中央共数5个玻璃皿，用180 ℃ 120 min后检测其残留量，分别为里边左右与门边左右及中央的内毒素残留量检测结果分别为0.0965、0.0842、0.0842、0.1792、0.0199 EU/ml。3.4.2 同上法将玻璃皿一个置于烘箱中央于300℃，2 min其残留量为0.0094 EU/ml。
, 百拇医药
4 讨论
4.1 经上述不同温度与时间的干热烘箱处理用定量产色基质鲎试剂通过残留量的测定与计算其ECV下降对数值，与计算的D值与Z值结果表明符合干热灭活动力学理论，从数据可见D值越大该温度下内毒素的耐性越强，灭活过程中就越难除去，随温度升高其D值就变小，其灭活内毒素比前者更有效。
4.2 通过在干热烘箱中同一层搁扳不同位置其残留量各异，因此用ECV也可反应出该烘箱在干热过程中温度冷热点不同。提示用ECV进行干热除热原GMP验证是不可勿视。
4.3 通过上述试验结果表明本ECV经高温度干热后用定量产色基质含均能测定出残留量及降解对数下降值及D值Z值符合GMP干热除去热原的验证要求，但由于现在对于其降解内毒素残量的下降对数值尚未有正式标准，以及对验证规范与指南尚待研究，故此本实验仅供参考。
参考文献
, 百拇医药
[1]U.S Pharmacopcien XⅫ Mack Pubilshing CO，1990；1943
[2]European Pharmacopeia，2nd，maisonnemve S.A，Saint Ruffine Frauce 1980；21.4
[3]王绍明等：中国药学杂志，1997；32(增刊)∶151
[4]中国药典2000年版(二部)新增订与修订内容汇编(初稿)1999；7月，347
[5]Thomas J：PDA.J Pharm.Sci Techonl，1995；49(1)∶33～34
[6]“Validation of Dry Heat Process Used For Sterilization and Depyrogenation，”Tech Rpt.No3，ParenteralDrug Asscoiation Inc，1981；
[7]Kenneth E：J.Parenter，sci Technol，1987；41(2)∶49, 百拇医药
单位：刘端华(福州东方鲎试剂厂 350001)；王绍明(福州东方鲎试剂厂 350001)
关键词：内毒素标示品(ECV)；干热除热原；验证；标准曲线
海峡药学000174
摘要 细菌内毒素标示品(Endotoxin Challenge Vial，ECV)是用于干热烘箱除去细菌内毒素(热原)验证的生物活性指示剂。除去细菌内毒素是制药与生物制品工业的一个重要问题。干热法除去热原是常用的手段，其除热原的可靠性的验证是将ECV置于除热原过程中，以最终内毒素量下降对数值来判断其有效性，美国药典与欧洲药典[1，2]分别以下降3个与4个对数(3log与4log)为有效，并对其验证作了规范指南，我国至今对此尚未有具体的规范与验证标准及指导文件，也无ECV的正式产品。我们曾于1997年研制成ECV，其结果表明达到干热除去细菌内毒素验证的要求[3]。
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目前，我国用于细菌内毒素检查法的细菌内毒素标准品与工作标准品，含有的赋型剂经受不住干热验证的高温烘烤而变焦、碳化等。为此我们研制出10000EU/安瓿的ECV将其置于180、250、300℃中烘烤试验，测出残留量，现将检测与过程报道如下。
1 材料与方法
1.1 细菌内毒素标示品：效价10000 EU/支，批号990701福州东方鲎试剂厂出品
1.2 定量鲎试剂盒：批号990701福州东方鲎试剂厂出品
2 制订ECV标准曲线
在进行干热去热原验证试验前都要用定量产色基质鲎试剂制订标准曲线以用其直线回归方程计算残留量与下降log值。关于定量产色基质鲎试剂操作请按试剂盒说明书。
, 百拇医药 2.1 ECV的稀释步骤如下：先将在ECV安瓿曲颈上1 cm处用小砂轮割划后用75%乙醇棉球擦干净，启开后加入1.0 ml细菌内毒素检查用水(BET水)然后均用BET水作如下连续稀释：
当ECV加入1.0 mlBET水后，须在旋涡混合器上混匀30 min，然后每稀释一步均要再混合15 s，加样时亦要再混合15 s后检测其结果(见表1)。
表1 检测结果(n＝4) EU/ml
0.03
0.06
0.125
0.25
OD545
, 百拇医药
0.113
0226
0.6073
1.2103
相关系数为0.998，其内毒素OD值最高与最低之差大于0.4合于标准曲线要求[4]。
直线方程Y＝5.0266X+0.0451，式中X为内毒素浓度，Y为读出的OD545值。
本试验按此公式计算经高温处理后ECV的内毒素残留量与下降对数单位。
3 结果
3.1 处理方法请参照王绍明报导(1997)[3]。
, http://www.100md.com
3.2 本试验处理温度为180、170、160、150℃分别以120、100、80、60 min处理。
以120 min干热处理结果为例
温度 ℃ 180° 170° 160° 150°
残留量 EU/m l0.01 132.500 54.00 372.76
下降对数lg 5.9469 3.6020 3.3010 1.4286
残留量降解对数计算，例示以180°120′
ECV原有内毒素含量10000EU＝log4，处理后内毒素残留量为0.0113即log为-1.9469，其下降log为4-(-1.9469)＝5.9469。
, 百拇医药
3.3 本ECV的D值与Z值 按文献报道[5]内毒素干热灭活过程和干热灭菌过程(Dry Heat Sterilization)有一定相似，所以，国外将干灭菌中微生物死亡动力应用于内毒素失活上，建立起数学模型，求出相应的D值(即单位对数失活时间)和Z值即灭活温度示数[6]。我们以此计算结果如下：
温度180、170、160、150℃其D值分别为20.18、33.14、52.15、84.0。其Z值为48.49也是符合国外报道Z值在30℃～50℃之间。
3.4 几个干热高温处理ECV试验 3.4.1 取ECV各4支放于加盖玻璃培养皿，将其按放在烘箱四角与中央共数5个玻璃皿，用180 ℃ 120 min后检测其残留量，分别为里边左右与门边左右及中央的内毒素残留量检测结果分别为0.0965、0.0842、0.0842、0.1792、0.0199 EU/ml。3.4.2 同上法将玻璃皿一个置于烘箱中央于300℃，2 min其残留量为0.0094 EU/ml。
, 百拇医药
4 讨论
4.1 经上述不同温度与时间的干热烘箱处理用定量产色基质鲎试剂通过残留量的测定与计算其ECV下降对数值，与计算的D值与Z值结果表明符合干热灭活动力学理论，从数据可见D值越大该温度下内毒素的耐性越强，灭活过程中就越难除去，随温度升高其D值就变小，其灭活内毒素比前者更有效。
4.2 通过在干热烘箱中同一层搁扳不同位置其残留量各异，因此用ECV也可反应出该烘箱在干热过程中温度冷热点不同。提示用ECV进行干热除热原GMP验证是不可勿视。
4.3 通过上述试验结果表明本ECV经高温度干热后用定量产色基质含均能测定出残留量及降解对数下降值及D值Z值符合GMP干热除去热原的验证要求，但由于现在对于其降解内毒素残量的下降对数值尚未有正式标准，以及对验证规范与指南尚待研究，故此本实验仅供参考。
参考文献
, 百拇医药
[1]U.S Pharmacopcien XⅫ Mack Pubilshing CO，1990；1943
[2]European Pharmacopeia，2nd，maisonnemve S.A，Saint Ruffine Frauce 1980；21.4
[3]王绍明等：中国药学杂志，1997；32(增刊)∶151
[4]中国药典2000年版(二部)新增订与修订内容汇编(初稿)1999；7月，347
[5]Thomas J：PDA.J Pharm.Sci Techonl，1995；49(1)∶33～34
[6]“Validation of Dry Heat Process Used For Sterilization and Depyrogenation，”Tech Rpt.No3，ParenteralDrug Asscoiation Inc，1981；
[7]Kenneth E：J.Parenter，sci Technol，1987；41(2)∶49, 百拇医药